超高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法測定草莓中鞣花酸

楊 媛，石 磊，楊軍軍，張瑩瑩，張開春,3*

(1.北京市農(nóng)林科學(xué)院 林業(yè)果樹研究所，北京 100093；2.農(nóng)業(yè)部華北地區(qū)園藝作物生物學(xué)與種質(zhì)創(chuàng)制重點實驗室，北京 100097；3.北京市落葉果樹工程技術(shù)研究中心，北京 100093)

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超高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法測定草莓中鞣花酸

楊 媛1,2，石 磊1，楊軍軍1，張瑩瑩1，張開春1,3*

(1.北京市農(nóng)林科學(xué)院 林業(yè)果樹研究所，北京 100093；2.農(nóng)業(yè)部華北地區(qū)園藝作物生物學(xué)與種質(zhì)創(chuàng)制重點實驗室，北京 100097；3.北京市落葉果樹工程技術(shù)研究中心，北京 100093)

建立了測定草莓中鞣花酸含量(包括游離鞣花酸和總鞣花酸)的超高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用(UPLC-MS/MS)分析方法。草莓中游離鞣花酸在酸性條件下用甲醇提取，經(jīng)C18分散固相萃取凈化后可直接測定；總鞣花酸經(jīng)酸性水解呈游離態(tài)再經(jīng)分散固相萃取凈化后進行測定。凈化液經(jīng)C18色譜柱分離，以甲醇和0.5%甲酸水為流動相進行梯度洗脫，電噴霧負離子(ESI-)模式電離，超高效液相色譜-質(zhì)譜法(UPLC-MS/MS)測定，外標法定量。結(jié)果表明：在10～500 ng/mL濃度范圍內(nèi)鞣花酸的線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)為0.998 1，游離鞣花酸的定量下限為0.5 mg/kg，總鞣花酸的定量下限為5.0 mg/kg。在低、中、高3個加標濃度的回收實驗中，游離鞣花酸的加標回收率為86.7%～113.6%，相對標準偏差均小于10%。該方法操作簡單，靈敏度高，準確性好，適用于草莓中鞣花酸的測定。

超高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法(UPLC-MS/MS)；游離鞣花酸；總鞣花酸；草莓

近年來，鞣花酸因其突出的抗氧化效果備受關(guān)注。有報道表明，鞣花酸廣泛存在于山莓[1]、草莓[2]、藍莓[3]、紅醋栗[4]、石榴[5]、胡桃[6]等水果和堅果中。鞣花酸具有重要的抗菌[7]、抗炎[8]、抗氧化[9-12]、促進傷口愈合[4]、心肌保護[13]、鎮(zhèn)痛[14]、腫瘤抑制[1,15]等功能，對癲癇病[16]、糖尿病及其并發(fā)癥[17]、動脈硬化[18]、癌癥[19-21]等疾病的預(yù)防和治療效果備受關(guān)注，鞣花酸具有比維生素E更強的抗氧化脅迫作用[22]。

鞣花酸存在3種形式[1]:即與糖結(jié)合成醚的鞣花單寧，鞣花酸糖苷，以及少量的游離鞣花酸。目前，鞣花酸含量的分析方法有高效液相色譜法[23-24]、反滴定法[25]、紫外分光光度法[4,26]、薄層層析法[27-28]、高效毛細管電泳法[29]等，但國內(nèi)鮮有關(guān)于超高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法(UPLC-MS/MS)檢測鞣花酸的報道。在鞣花酸測定的多種方法中，反滴定法的操作比較繁瑣、費時費力且溶劑用量大；分光光度法前處理采用萃取法比較繁瑣，且雜質(zhì)干擾影響測定結(jié)果；薄層層析法主要用于定性分析；高效毛細管電泳法前處理復(fù)雜、耗時長、溶劑用量大；高效液相色譜法是目前效率較高、定性定量準確性好的一種檢測方法。而相比之下，超高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法具有效率更高，溶劑試劑用量更少，定性、定量更準確的優(yōu)勢。

本研究針對富含鞣花酸的代表性水果草莓[30]，建立了分散固相萃取凈化、超高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法測定草莓中游離鞣花酸和總鞣花酸，該方法操作簡便，準確性高，可用于其他水果中游離鞣花酸和總鞣花酸含量的測定。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

Waters Xevo TQ-S(Acquity UPLC，ZspraYTM，ESI/APCI/ESCi?，Waters公司)；乙腈、甲醇(色譜純，Merck公司)，三氟乙酸(分析純，北京北化精細化學(xué)品有限責(zé)任公司)，鞣花酸(純度98.5%，Dr.Ehrenstorferg公司)，C18填料(Dikma公司)。除非另有說明，其他所用試劑均為分析純試劑；實驗用水為GB/T6682規(guī)定的一級水。

1.2 樣品前處理

1.2.1 游離鞣花酸 準確稱取1.00 g草莓勻漿樣品置于50 mL具塞刻度離心管中，加入甲醇-0.1%三氟乙酸水(80∶20)提取液定容至50 mL，渦旋混勻3 min，10 000 r/min離心5 min。取2 mL上清液加入20 mg C18粉末，渦旋振蕩3 min，5 000 r/min離心5 min。取上清液過0.22 μm有機濾膜，濾液供UPLC-MS/MS測定。

1.2.2 總鞣花酸 稱取1.00 g 草莓勻漿樣品置于50 mL刻度離心管中，加入2 mol/L三氟乙酸溶液定容至50 mL，渦旋振蕩3 min，置于90 ℃水浴中加熱2 h。冷卻后10 000 r/min離心5 min，取1 mL上清液置于10 mL刻度離心管中，加入甲醇定容至10 mL，渦旋振蕩2 min。取2 mL上清液加入20 mg C18粉末，渦旋振蕩2 min，10 000 r/min離心5 min。取1.0 mL清液，過0.22 μm有機相濾膜，濾液供UPLC-MS/MS測定。

1.3 標準溶液配制

鞣花酸標準儲備液濃度為1.0 mg/mL的乙腈溶液，避光存儲于4 ℃冰箱，用甲醇逐級稀釋為500，250，100，50，25，10 ng/mL的標準工作溶液，使用前需新鮮配制。

1.4 檢測條件

1.4.1 液相色譜條件 色譜柱：Acquity UPLC BEH?C18(2.1×50 mm，1.7 μm)；柱溫：30 ℃；流動相：A為甲醇，B為0.5%甲酸水溶液；流速：0.2 mL/min；進樣量：1.0 μL。梯度洗脫程序：0～2.5 min，90%B；2.5～3 min，90%～10%B；3～5 min，10%B；5～5.5 min，10%～90%B；5.5～8 min，90%B。

1.4.2 質(zhì)譜條件 掃描模式：電噴霧負離子模式ESI(-)；毛細管電壓：2 500 V；干燥氣流量：氮氣 500 L/H；去溶劑化溫度：350 ℃；霧化器壓力：7.0 bar；碰撞氣：氬氣；監(jiān)測方式：多反應(yīng)監(jiān)測(MRM)；定量離子對300.97>144.70，錐孔電壓82 V，碰撞電壓38 V；定性離子對300.97>228.71，錐孔電壓82 V，碰撞電壓28 V。

圖1 50 ng/mL鞣花酸的典型色譜質(zhì)譜圖Fig.1 MRM chromatograms of 50 ng/mL ellagic acid

圖2 鞣花酸的二級質(zhì)譜圖Fig.2 MRM spectrum of ellagic acid collision energy：38 eV

2 結(jié)果與討論

2.1 質(zhì)譜條件的優(yōu)化

本研究采用UPLC-MS/MS技術(shù)進行檢測，由于二級質(zhì)譜的多反應(yīng)離子監(jiān)測模式與一級質(zhì)譜的單離子監(jiān)測方式相比專屬性更高，抗背景干擾能力更強，定量的準確性更好，檢出限更低，因此本文以多反應(yīng)離子監(jiān)測模式檢測鞣花酸；掃描方式的選擇主要依據(jù)物質(zhì)本身的結(jié)構(gòu)特點，鞣花酸作為有機酸易失去1個質(zhì)子帶負電荷，理論上鞣花酸可采用負離子進行掃描。研究證實，在含有甲酸的流動相系統(tǒng)中，采用負離子方式掃描時鞣花酸的響應(yīng)較高，峰形較尖銳，因此，本研究選擇多反應(yīng)離子監(jiān)測模式負離子掃描方式檢測鞣花酸(見圖1)。

2.2 裂分途徑

圖2為碰撞電壓為38 eV條件下，鞣花酸的二級質(zhì)譜圖。根據(jù)鞣花酸的分子結(jié)構(gòu)特點和碎片質(zhì)荷比，推測鞣花酸在該質(zhì)譜條件下的裂分途徑如圖3所示。由圖3可見，鞣花酸(化合物(1))是含有4個羥基的對稱雙內(nèi)酯，在負離子模式下，容易失去1個氫離子帶上負電荷而形成較穩(wěn)定的分子離子即(2)，該離子由于分子的良好對稱性和苯環(huán)的π鍵共軛作用而能穩(wěn)定存在。鞣花酸有3個響應(yīng)較高的碎片離子，其中，m/z=283.82是分子離子丟失水分子的產(chǎn)物即(3)。m/z=228.71是(3)丟失兩分子CO的產(chǎn)物即(4)；m/z=144.70是(4)進一步丟失3分子CO的產(chǎn)物即(5)。

圖3 負離子模式下鞣花酸的質(zhì)譜裂分示意圖Fig.3 Tentative assignment of fragmentation of ellagic acid under negative ion mode

2.3 前處理條件的選擇

2.3.1 游離鞣花酸提取溶劑的選擇 目前國內(nèi)報道的高效液相色譜法中，鞣花酸的提取多采用丙酮溶液浸泡6～8 h后超聲或回流提取，其操作繁瑣、耗時長，且提取后未經(jīng)凈化直接使用高效液相色譜儀檢測，易對色譜柱及檢測器造成污染。

鞣花酸屬于酸性物質(zhì)，本實驗比較了乙腈、甲醇、乙腈-水(80∶20)、甲醇-水(80∶20)、乙腈-0.1%三氟乙酸水溶液(80∶20)、甲醇-0.1%三氟乙酸水溶液(80∶20) 6種提取液對“章姬”樣品中添加5.0 mg/kg鞣花酸的提取效果。結(jié)果表明，鞣花酸在后2種溶劑中的提取回收率均大于90%，而在前4種溶劑中的提取回收率均不大于60%，表明后2種溶劑的提取效果較好。但樣品經(jīng)乙腈-0.1%三氟乙酸水溶液(80∶20)提取，C18凈化后，仍含有較多雜質(zhì)；而經(jīng)甲醇-0.1%三氟乙酸水溶液(80∶20)提取，C18凈化后可有效去除雜質(zhì)。因此，實驗選擇甲醇-0.1%三氟乙酸水溶液(80∶20)作為樣品的最佳提取溶劑。

2.3.2 總鞣花酸水解條件的優(yōu)化 用“章姬”樣品比較了總鞣花酸在酸性條件(2 mol/L三氟乙酸水溶液)和堿性條件(10 mol/L氫氧化鈉溶液)的水解效果。結(jié)果表明，兩種水解方式下總鞣花酸的水解率相當(dāng)。但堿性水解后，反應(yīng)溶液還需進行pH值調(diào)節(jié)和萃取分液等步驟后，才能進行稀釋、上機測定；而酸性水解后，反應(yīng)液可直接進行稀釋、上機測定。因此，實驗選擇步驟更為簡化的酸性方式將總鞣花酸水解為游離鞣花酸。

2.4 線性范圍與定量下限

在優(yōu)化色譜條件下，測定了一系列濃度(500，200，100，50，25，10 ng/mL)的鞣花酸標準溶液。分別以定量離子峰面積(Y)對質(zhì)量濃度(X，ng/mL)進行回歸方程擬合。結(jié)果表明，在10～500 ng/mL濃度范圍內(nèi)，鞣花酸的線性關(guān)系良好，線性方程為Y=97.67X+2 396(r=0.998 1 )。該方法的最低定量濃度為10 ng/mL，根據(jù)前處理條件，鞣花酸的定量下限為0.5 mg/kg，總鞣花酸(以游離鞣花酸計算)的定量下限為5.0 mg/kg。

2.5 加標回收率及相對標準偏差

選取“紅顏”、“章姬”、“甜查理”3種北京主栽草莓品種為游離鞣花酸加標回收實驗的基質(zhì)，分別添加0.5，5.0，10 mg/kg游離鞣花酸，每個濃度設(shè)3個平行。實驗結(jié)果表明，3種代表基質(zhì)中游離鞣花酸的加標回收率為86.7%～113.6%，相對標準偏差(RSD)為2.1%～9.5%(見表1)。表明方法的精密度和準確度較好，能滿足檢測要求。

表1 草莓中游離鞣花酸的添加回收試驗結(jié)果(n=3)

2.6 重現(xiàn)性試驗

平行稱取同一“章姬”勻漿樣品6份，分別置于50 mL具塞刻度離心管中，加入甲醇-0.1%三氟乙酸水(80∶20)提取液定容至50 mL，渦旋混勻3 min，10 000 r/min離心5 min。取2 mL上清液加入20 mg C18粉末，渦旋振蕩3 min，5 000 r/min離心5 min。取上清液過0.22 μm有機濾膜，濾液供UPLC-MS/MS測定。結(jié)果表明，該樣品的游離鞣花酸含量為2.30 mg/kg，RSD為2.4%，具有良好的重復(fù)性。

平行稱取同一“章姬”勻漿樣品6份，分別置于50 mL刻度離心管中，加入2 mol/L三氟乙酸溶液定容至50 mL，渦旋振蕩3 min，置于90 ℃水浴中加熱2 h。冷卻后10 000 r/min離心5 min，取1 mL上清液置于10 mL刻度離心管中，加入甲醇定容至10 mL，渦旋振蕩2 min。取2 mL上清液加入20mg C18粉末，渦旋振蕩2 min，10 000 r/min離心5 min。取1.0 mL清液，過0.22 μm有機相濾膜，濾液供UPLC-MS/MS測定。結(jié)果表明，該樣品的總鞣花酸含量為26.54 mg/kg，RSD為1.3%，具有良好的重復(fù)性。

2.7 實際樣品分析

采用本方法對市售8種實際草莓樣品進行分析，結(jié)果表明，不同品種草莓中所含的游離鞣花酸含量差別較小，但總鞣花酸含量有所差別(見表2)，但無論是游離鞣花酸還是總鞣花酸，幾種草莓間均不具有顯著性差異，即相互間未達到p<0.05顯著水平。

表2 8種草莓中鞣花酸含量的測定結(jié)果(n=2)

Table 2 Content of ellagica acid in eight strawberry samples (n=2)

SampleFreeellagicacid(mg/kg)Totalellagicacid(mg/kg)Benihoppe(紅顏)6806387Tochiotome(章姬)3863758SweetCharlie(甜查理)86112560TianXiang(天香)9849549YanXiang(燕香)5227806ShuXiang(書香)7959943DongXiang(冬香)118310777Toyonoka(豐香)4586855p?value090075

3 結(jié) 論

本文建立了超高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法測定草莓中鞣花酸(包括游離鞣花酸和總鞣花酸)，游離鞣花酸在酸性條件下用甲醇提取，經(jīng)C18分散固相萃取凈化后可直接測定；總鞣花酸經(jīng)酸性水解成游離態(tài)后，再進行分散固相萃取凈化后，上機測定。方法前處理簡單快捷，測定結(jié)果穩(wěn)定、靈敏度高、準確性好，適合于草莓中鞣花酸的測定，同時也可為其他水果中鞣花酸的測定提供參考。

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Determination of Ellagic Acid in Strawberry by UPLC-MS/MS

YANG Yuan1,2，SHI Lei1，YANG Jun-jun1，ZHANG Ying-ying1，ZHANG Kai-chun1,3*

(1.Institute of Forestry and Pomology，Beijing Academy of Agriculture and Forestry Sciences，Beijing 100093，China;2.Key Laboratory of Biology and Genetic Improvement of Horticultural Crops(North China)，Ministry of Agriculture，China，Beijing 100097，China;3.Beijing Engineering Research Center for Deciduous Fruit Trees，Beijing 100093，China)

A method was developed for the determination of ellagic acid(free ellagic acid and total ellagic acid) in strawberry by ultra performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry(UPLC-MS/MS).In this work，the free ellagic acid was extracted from strawberry with 0.1%trifloroacetric acid-methane，purified by C18dispersive solid-phase extraction，and determined by UPLC-MS/MS.Total ellagic acid was hydrolyzed to free ellagic acid with 2 mol/L trifloroacetric acid aqueous，then purified with C18dispersive solid-phase extraction column，and determined by UPLC-MS/MS.Sample solution was separated on a C18column by gradient elution using methanol-0.5%formic acid aqueous as mobile phase.The linear range of 10-500 ng/mL for ellagic acid was obtained，with correlation coefficient of 0.998 1.The limit of quantitation was 0.5 mg/kg for free ellagic acid and 5.0 mg/kg for total ellagic acid.The recoveries at low，medium and high spiked levels ranged from 86.7%to 113.6%with relative standard deviations(RSD) not more than 10%.The results indicated that this approach was simple，sensitive and accurate，and was applicable for the determination of content of ellagic acid in strawberry.

ultra performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry(UPLC-MS/MS);free ellagic acid;total ellagic acid;strawberry

2016-06-15；

2016-07-25

科技創(chuàng)新能力建設(shè)專項(KJCX20140302，KJCX20150602)

10.3969/j.issn.1004-4957.2016.12.013

O656.63;S816.7

A

1004-4957(2016)12-1591-05

*通訊作者：張開春，博士，研究員，研究方向：果樹資源育種及果品質(zhì)量安全，Tel:010-82596007，E-mail:zkc8848@126.com