阿司匹林對斑馬魚胃腸道的毒性研究

孫晨，何秋霞，韓利文，陳錫強，王希敏，楚杰，韓建，王榮春，侯海榮，劉可春

(山東省科學(xué)院藥物篩選技術(shù)重點實驗室，山東省科學(xué)院生物研究所，山東 濟南 250014)

【藥理與毒理】

阿司匹林對斑馬魚胃腸道的毒性研究

孫晨，何秋霞，韓利文，陳錫強，王希敏，楚杰，韓建，王榮春，侯海榮，劉可春*

(山東省科學(xué)院藥物篩選技術(shù)重點實驗室，山東省科學(xué)院生物研究所，山東 濟南 250014)

以斑馬魚作為動物模型，通過胃腸道蠕動功能分析、胃腸道內(nèi)皮細胞分泌功能檢測和腸粘膜組織形態(tài)學(xué)觀察等，對阿司匹林的胃腸道毒性做了初步分析。研究發(fā)現(xiàn)，阿司匹林濃度為50 μg/mL時，可以加快斑馬魚胃腸道的蠕動；濃度為50 μg/mL或100 μg/mL時，雖然斑馬魚腸粘膜的組織形態(tài)未受損害，但是位于腸粘膜上的杯狀細胞的分泌功能會受到影響。

阿司匹林；斑馬魚；胃腸道；毒性

阿司匹林(aspirin)又稱乙酰水楊酸，是一類歷史悠久的解熱鎮(zhèn)痛類非甾體抗炎藥。1853年，Gerhardt首次使用水楊酸與乙酰酐合成了乙酰水楊酸。1898年，Hoffmann合成了穩(wěn)定的乙酰水楊酸，并將其應(yīng)用于風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的治療。1899年，Dreiser將阿司匹林介紹到臨床，并正式命名為aspirin[1-3]。1971年，Simth等[4]發(fā)現(xiàn)，阿司匹林可以抑制血小板前列腺素的合成。1974年，Elwood等[5]證實，阿司匹林在預(yù)防心臟病方面具有一定功效。目前在臨床上，阿司匹林常被應(yīng)用于抗風(fēng)濕、消炎解熱、預(yù)防血栓形成、防止冠心病和治療老年性癡呆等[3,6-8]。以小鼠或大鼠等多種模式生物作為實驗對象的研究發(fā)現(xiàn)，阿司匹林可抑制化學(xué)誘導(dǎo)性癌癥的發(fā)生[9-11]。該作用機制可能與阿司匹林的抗炎作用相關(guān)[12]。Kopp等[13-14]研究發(fā)現(xiàn)，阿司匹林可以通過抑制轉(zhuǎn)錄因子NF-κB的活性來調(diào)控炎性細胞因子的產(chǎn)生，并最終抑制腸道腫瘤的生長。雖然阿司匹林作為臨床上常用的抗炎藥物，具有多種功效，但是其不良反應(yīng)也較多。很多人服用阿司匹林后出現(xiàn)腹痛、腹脹、食欲差和泛酸等癥狀，胃腸道反應(yīng)已成為阿司匹林最常見的不良反應(yīng)之一[15]。臨床應(yīng)用阿司匹林時，如何對其用藥劑量和指征進行把握，避免大劑量、長時間用藥，以及如何有效降低不良反應(yīng)的發(fā)生已成為人們關(guān)注的焦點。

斑馬魚(zebrafish，Daniorerio)是生命科學(xué)領(lǐng)域三大常用模式生物之一，既具哺乳動物類似的生理生化特征，又具有飼養(yǎng)成本低，繁殖周期短，體外受精、體外發(fā)育、胚胎透明和發(fā)育快速等特點[16]。斑馬魚的胃腸道在細胞功能和解剖學(xué)方面均與人類相似，由內(nèi)皮細胞、結(jié)締組織、外縱肌和環(huán)狀肌組成。胚胎發(fā)育至26～126 hpf(hours post fertilization,受精后小時)，斑馬魚胃腸道的管腔形成并不斷生長，形成有功能的腸道上皮。在未喂食情況下，斑馬魚胚胎受精約72 hpf，腸道首次出現(xiàn)不穩(wěn)定的自發(fā)收縮。伴隨著發(fā)育的進行，第120～144 hpf，斑馬魚大部分的卵黃囊被吸收，腸道自發(fā)的蠕動及攝食能力增強[17-18]。

基于上述獨特優(yōu)勢，本實驗選擇斑馬魚作為模式動物，通過胃腸道蠕動功能分析、胃腸道內(nèi)皮細胞分泌功能檢測和腸粘膜組織形態(tài)學(xué)觀察等，對阿司匹林的胃腸道毒性做了初步研究，為后續(xù)進一步的毒性機制研究提供了實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

本實驗采用受精120 hpf的野生AB系斑馬魚，由山東省科學(xué)院藥物篩選技術(shù)重點實驗室提供。斑馬魚的飼養(yǎng)和繁殖參照文獻[19]。雌雄斑馬魚在28 ℃，14 h光照/10 h黑暗條件下分開養(yǎng)殖，每日于9：30和16：30分別喂食兩次豐年蟲。交配取卵時，于前日將健康成熟斑馬魚按雌雄比1∶1或1∶2的比例放入交配缸內(nèi)，中間放置隔板，置于黑暗環(huán)境中，次日亮燈前抽去隔板，光照刺激使其排卵。排卵后半小時將成魚撈出，使排卵時間控制在半小時內(nèi)，以降低胚胎間發(fā)育時間的差異。收集受精卵，并對其進行消毒和清洗。隨后將受精卵置于28 ℃培養(yǎng)箱內(nèi)，保持14 h光照/10 h黑暗周期培養(yǎng)，并及時吸出死亡胚胎。

1.2 試劑與儀器

1.2.1 試劑

阿司匹林標(biāo)準(zhǔn)品(中國食品藥品檢定研究院)；多潘立酮標(biāo)準(zhǔn)品(加拿大TRC公司)。以上兩種標(biāo)準(zhǔn)品均用二甲基亞砜(中國國藥集團)溶解后，配制成10 mg/mL的儲備液。三卡因(Sigma-Aldrich公司)使用去離子水配制為1 mg/mL的儲備液。鈣黃綠素(Sigma-Aldrich公司)用培養(yǎng)水(NaCl 5 mmol/L，KCl 0.17 mmol/L，CaCl20.4 mmol/L，MgSO40.16 mmol/L，去離子水配制)溶解后，配制成質(zhì)量分數(shù)1%的儲備液。上述儲備液均置于4℃冰箱備用。阿爾新藍(Sigma-Aldrich公司)使用體積分數(shù)80%的乙醇和體積分數(shù)20%的冰醋酸溶解，并配制成質(zhì)量分數(shù)0.1%的工作液，置于4 ℃冰箱備用。無水乙醇和鹽酸(中國國藥集團)使用去離子水配置成體積分數(shù)1%的鹽酸酒精。質(zhì)量分數(shù)4%多聚甲醛(PFA)、PBS和HE染液(北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限公司)。

1.2.2 儀器

體視熒光顯微鏡SZX16(日本Olympus)；DP2-BSW圖像軟件(日本Olympus)；斑馬魚飼養(yǎng)繁殖系統(tǒng)(北京愛生科技有限公司)；311型水套式二氧化碳培養(yǎng)箱(美國ThermoForma)；智能生物圖像導(dǎo)航儀FSX100(日本Olympus)，石蠟切片機HM325(美國Thermo)。

1.3 加藥處理

將受精后120 h斑馬魚胚胎置于顯微鏡下，選取發(fā)育正常的胚胎，置于6孔板中，每孔20尾，分別設(shè)置5個組：溶劑(體積分數(shù)0.5% 二甲基亞砜)對照組、陽性藥物(50 μg/mL多潘立酮)對照組、30 μg/mL待試藥物(阿司匹林)劑量組、50 μg/mL待試藥物(阿司匹林)劑量組和100 μg/mL待試藥物(阿司匹林)劑量組，每組3個平行孔。移除6孔板中培養(yǎng)水，二甲基亞砜對照組加入6 mL 0.5%二甲基亞砜培養(yǎng)水溶液；多潘立酮對照組加入6 mL濃度為50 μg/mL的多潘立酮培養(yǎng)水溶液；3個阿司匹林實驗組分別在6mL培養(yǎng)水中加入終濃度為30 μg/mL、50 μg/mL和100 μg/mL的阿司匹林溶液。將以上各實驗組斑馬魚胚胎分別放入28 ℃恒溫培養(yǎng)箱中，14 h光照/10 h黑暗周期下培養(yǎng)24 h。

1.4 斑馬魚胃腸道蠕動功能分析

將加藥處理24 h后的胚胎放入含有培養(yǎng)水的EP管中，加入質(zhì)量分數(shù)為0.2%的鈣黃綠素溶液，25 ℃恒溫避光孵育10 min。孵育結(jié)束后使用培養(yǎng)水清洗胚胎。使用質(zhì)量分數(shù)0.02%的三卡因?qū)唏R魚胚胎麻醉。在熒光顯微鏡下利用圖像采集軟件對標(biāo)記的胃腸道部位進行影像采集，并統(tǒng)計1 min內(nèi)斑馬魚胃腸道蠕動次數(shù)。

1.5 斑馬魚胃腸道內(nèi)皮細胞分泌功能檢測

藥物處理24 h的胚胎在4% PFA中4 ℃固定過夜。使用1%鹽酸酒精清洗固定胚胎。清洗后的胚胎置于阿爾新藍染液中，室溫放置2 h，然后置于4 ℃冰箱過夜。染色后胚胎使用1%鹽酸酒精清洗，并置于體視顯微鏡下，采集胃腸道部位圖像。

1.6 腸粘膜組織形態(tài)學(xué)檢測

藥物處理24 h的胚胎在4% PFA中4 ℃固定過夜。固定后胚胎使用PBS清洗，并置于酒精中梯度脫水。使用石蠟對胚胎整體進行包埋，并制成石蠟切片。將石蠟切片進行HE染色，然后在顯微鏡下對胃腸道部位的組織形態(tài)進行觀察。

1.7 統(tǒng)計學(xué)分析

實驗數(shù)據(jù)用x±s表示，統(tǒng)計學(xué)差異采用ANOVA進行分析，Tukey檢驗做組間比較。P<0.05為有顯著性差異，P<0.01為有極顯著性差異。

2 結(jié)果

2.1 阿司匹林對斑馬魚胃腸道蠕動能力的影響

鈣黃綠素活體染色后，根據(jù)采集影像(圖1)，在1 min內(nèi)對溶劑對照組(0.5%二甲基亞砜)、陽性對照組(50 μg/mL多潘立酮)和阿司匹林劑量組(30 μg/mL、50 μg/mL和100 μg/mL)的斑馬魚胚胎的胃腸道蠕動次數(shù)進行計數(shù)。結(jié)果顯示，溶劑對照組和陽性對照組的平均蠕動次數(shù)分別為10.2和21次。阿司匹林劑量組的平均蠕動次數(shù)分別為11±1.67、13.3±2.16和11.2±1.60次，如表1所示。

a 溶劑對照組；b 陽性對照組；c 30 μg/mL阿司匹林溶液處理組；d 50 μg/mL阿司匹林溶液處理組；e 100 μg/mL阿司匹林溶液處理組。圖1 鈣黃綠素活體標(biāo)記斑馬魚胃腸道Fig.1 Vitalstaining of gastrointestinal tract of zebrafish

測試物濃度/(μg·mL-1)1min內(nèi)斑馬魚腸道蠕動次數(shù)/次二甲基亞砜(溶劑對照)510．2±2．40多潘立酮(陽性對照)5021±3．03??阿司匹林3011±1．675013．3±2．16?10011．2±1．60

注：*表示P<0.05，與溶劑對照組之間的差異具有顯著性意義；**表示P<0.01，與溶劑對照組之間的差異具有非常顯著性意義。

*表示P<0.05，與溶劑對照組之間的差異具有顯著性意義；**表示P<0.01，與溶劑對照組之間的差異具有非常顯著性意義。圖2 單位時間內(nèi)斑馬魚胃腸道蠕動次數(shù)統(tǒng)計的柱狀圖Fig.2 Histogram of gastrointestinal peristalsis number in unit time

由表1可以看出，當(dāng)阿司匹林處理濃度為30 μg/mL和100 μg/mL時，斑馬魚的胃腸道蠕動能力未受明顯影響。但是當(dāng)阿司匹林處理濃度為50 μg/mL時，與溶劑對照組相比，斑馬魚的胃腸道蠕動能力增加，且差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，結(jié)果如圖2所示。

2.2阿司匹林對斑馬魚胃腸道內(nèi)皮細胞分泌功能的影響

杯狀細胞是胃腸道里一種特殊的內(nèi)皮細胞，可分泌粘蛋白，如MUC2[18,20]。阿爾新藍染料可以與粘蛋白進行特異的結(jié)合,因此通過阿爾新藍染色，可對斑馬魚胃腸道內(nèi)杯狀細胞的分泌功能進行檢測。如圖3所示，與對溶劑對照組相比，阿司匹林處理濃度為30 μg/mL時，斑馬魚胃腸道內(nèi)粘蛋白含量未有明顯改變(圖3b)；但是當(dāng)阿司匹林處理濃度為50 μg/mL或100 μg/mL時，斑馬魚近泄殖腔部位的胃腸道內(nèi)，粘蛋白出現(xiàn)明顯淤積(圖3c，3d)。上述結(jié)果表明，濃度50 μg/mL或100 μg/mL的阿司匹林可對斑馬魚杯狀細胞的分泌功能造成影響，使其粘蛋白分泌量異常增加。

a 溶劑對照組；b 30 μg/mL阿司匹林溶液處理組；c 50 μg/mL阿司匹林溶液處理組(粘蛋白淤積于胃腸道后部，箭頭所示)；d 100 μg/mL阿司匹林溶液處理組(粘蛋白淤積于胃腸道后部，箭頭所示)。圖3 斑馬魚胃腸道阿爾新藍染色Fig.3 Alcian blue staining of gastrointestinal tract of zebrafish

2.3 阿司匹林對斑馬魚腸粘膜組織形態(tài)的影響

斑馬魚腸粘膜由上皮和固有層組成。粘膜上皮主要包括柱狀上皮細胞、杯狀細胞和淋巴細胞,柱狀上皮細胞位于粘膜表面，排列整齊，細胞核呈橢圓形;杯狀細胞多分散在柱狀上皮細胞之間，且頭部膨大;淋巴細胞則多分布在基底部。固有層主要由淋巴細胞和成纖維細胞組成[21]。如圖4所示，不同濃度阿司匹林處理組中，斑馬魚的腸粘膜均向腸腔內(nèi)折疊，形成腸絨毛，且腸絨毛多呈指狀或分枝狀；粘膜表面的柱狀上皮細胞排列整齊，細胞核呈橢圓形。與溶劑對照組相比，各阿司匹林處理組的斑馬魚腸粘膜組織形態(tài)無明顯異常。

a 溶劑對照組；b 30 μg/mL阿司匹林溶液處理組；c 50 μg/mL阿司匹林溶液處理組；d 100 μg/mL阿司匹林溶液處理組。圖4 斑馬魚胃腸道HE染色Fig.4 HE staining of gastrointestinal tract of zebrafish

3 討論

阿司匹林作為醫(yī)藥史上三大經(jīng)典藥物之一[22]，在臨床上被廣泛使用。但近年來的研究發(fā)現(xiàn)，若使用不當(dāng)，阿司匹林常會帶來明顯副作用，嚴重時甚至造成生命危險[23]。因此本研究以斑馬魚為模型，對阿司匹林的胃腸道毒性進行了初步分析檢測。研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)阿司匹林濃度為50 μg/mL時，可以加快斑馬魚胃腸道的蠕動。當(dāng)阿司匹林濃度為50 μg/mL或100 μg/mL時，雖然斑馬魚腸粘膜的組織形態(tài)未受影響，但是位于腸粘膜的杯狀細胞的分泌功能會發(fā)生改變。

胃腸運動功能是消化道最主要的功能之一，其調(diào)節(jié)機制非常復(fù)雜。近年來隨著社會競爭的日趨激烈，人們生活節(jié)奏的加快和工作壓力的增大而導(dǎo)致的胃腸動力障礙性疾病問題日趨普遍。截至目前為止，胃腸動力障礙性疾病已成為臨床的常見病和多發(fā)病。由于胃腸動力障礙性疾病多屬于功能性疾病，因此目前尚無特效治療方法。我們發(fā)現(xiàn)一定濃度的阿司匹林可提高腸道的蠕動次數(shù)，該發(fā)現(xiàn)可為胃腸動力藥物的研發(fā)提供新的思路。

腸道作為體內(nèi)和外界相通的器官，是機體重要的免疫器官。腸粘膜上皮、腸粘液、腸道菌群、激素、腸道相關(guān)淋巴組織和膽鹽等共同構(gòu)成腸道屏障，可阻止腸內(nèi)有害物質(zhì)穿過腸粘膜進入機體其他組織器官或是血液循環(huán)系統(tǒng)[24]。我們以斑馬魚為模型研究發(fā)現(xiàn)，阿司匹林在一定濃度下雖然可以不損壞腸粘膜結(jié)構(gòu)的完整性，但是卻可以擾亂腸道內(nèi)粘蛋白的分泌。而粘蛋白又是腸粘液的重要成分，在腸道屏障中起著重要功能，可幫助機體維持平衡、免受機械損傷或病原體感染等。我們認為，阿司匹林可能通過擾亂粘蛋白的分泌，對腸道屏障起著潛在毒害作用，而這也是其造成胃腸道副作用的重要原因之一。

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Toxicity of aspirin to gastrointestinal tract of zebrafish

SUN Chen, HE Qiu-xia, HAN Li-wen, CHEN Xi-qiang, WANG Xi-min, CHU Jie, HAN Jian, WANG Rong-chun, HOU Hai-rong, LIU Ke-chun*

(Key Laboratory for Drug Screening Technology of Shandong Academy of Sciences, Biology Institute, Shandong Academy of Sciences, Jinan 250014, China)

∶We performed a preliminary analysis of gastrointestinal toxicity of aspirin through analysis of peristalsis, detection of secretion functionality of gastrointestinal endothelial cells and histomorphology of intestinal mucosa with zebrafish as animal model. We discover that aspirin concentration of 50 μg/mL can improve the peristalsis. Aspirin concentration of 50 μg/mL or 100 μg/mL will impair secretion functionality of goblet cells on intestinal mucosa though routine HE staining among intestinal mucosa does not change.

∶aspirin; zebrafish; gastrointestinal tract; toxicity

10.3976/j.issn.1002-4026.2016.06.008

2016-08-17

山東省自主創(chuàng)新重大專項(2014ZZCX0214)；山東省三院聯(lián)合基金(ZR2015YL009)；山東省科學(xué)院青年基金(2015QN011)。

孫晨(1985—)，女，博士，助理研究員，研究方向為基于斑馬魚模型的藥物篩選技術(shù)。

*通信作者，劉可春(1964—)，男，博士，研究員，研究方向為藥物篩選。E-mail:hliukch@sdas.org

R965.3

A

1002-4026(2016)05-050-06