鎘對背角無齒蚌外套膜細胞凋亡相關(guān)酶活性和細胞結(jié)構(gòu)的影響

李涌泉，楊惠珍，任玉娟，吳 昊，井維鑫，王 蘭

（山西大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，山西太原030006）

鎘對背角無齒蚌外套膜細胞凋亡相關(guān)酶活性和細胞結(jié)構(gòu)的影響

李涌泉，楊惠珍，任玉娟，吳 昊，井維鑫，王 蘭

（山西大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，山西太原030006）

應(yīng)用酶學(xué)和組織顯微技術(shù)，研究了鎘（Cd）對背角無齒蚌（Anodonta woodiana）外套膜組織中細胞凋亡相關(guān)酶Caspase-3，8，9活性、H2O2含量和組織細胞超微結(jié)構(gòu)的影響。結(jié)果顯示，與對照組相比，隨著Cd質(zhì)量濃度的增加，外套膜Caspase-3活性表現(xiàn)為先降低后顯著升高的趨勢（P＜0.05）；Caspase-8活性呈現(xiàn)逐漸升高，差異顯著（P＜0.05）；Caspase-9活性在低質(zhì)量濃度和高質(zhì)量濃度組顯著降低，但中高質(zhì)量濃度組顯著升高（P＜0.05）。隨著Cd質(zhì)量濃度的增加，外套膜中H2O2含量呈現(xiàn)逐漸增高的趨勢，差異顯著（P＜0.05）。當(dāng)Cd質(zhì)量濃度為16.86 mg/L時，外套膜組織細胞結(jié)構(gòu)的變化明顯；細胞核染色質(zhì)不規(guī)則凝聚、固縮和邊集，核膜破裂；線粒體腫脹、嵴數(shù)量減少、空泡化比較嚴(yán)重；微絨毛排列雜亂、大部分?jǐn)嗔巡⑶铱张莼瘒?yán)重。當(dāng)Cd質(zhì)量濃度為67.45 mg/L時，外套膜組織細胞損傷更加明顯；染色質(zhì)大部分凝聚、固縮和邊集，核膜嚴(yán)重腫脹并破裂；粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)板層狀結(jié)構(gòu)解體后形成許多大小不同的小泡。研究表明，外套膜在酶活性和組織細胞結(jié)構(gòu)上對鎘的反應(yīng)較快且更具規(guī)律性，而且具有明顯的劑量效應(yīng)關(guān)系。

背角無齒蚌；外套膜；半胱氨酸蛋白酶；細胞結(jié)構(gòu)；鎘

雙殼貝類分布廣泛、活動范圍局限、對多種污染物具有一定的耐受性，其非常適合反映水體環(huán)境和底泥中重金屬的污染狀況[13-15]，是理想的污染物指示生物。背角無齒蚌（Anodonta woodiana）廣泛分布于我國淡水水域中，作為“淡水貝類觀察體系”的指示生物[16]，直接受到水域和底泥中重金屬的污染，可以有效地反映水域重金屬污染的狀況[17-18]。目前，已經(jīng)開展了關(guān)于背角無齒蚌生態(tài)和代謝生理[19]、重金屬蓄積和元素分布[20-21]、礦質(zhì)元素和氨基酸含量[22]、機體抗氧化系統(tǒng)酶活性[23]等方面的研究工作。

本試驗就鎘對背角無齒蚌外套膜的細胞凋亡相關(guān)酶和組織超微結(jié)構(gòu)的影響進行了研究，旨在闡明鎘對背角無齒蚌的毒性影響程度，為進一步篩選適合淡水水域重金屬污染和評價的指示生物提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 試驗動物

背角無齒蚌（簡稱“河蚌”）購自太原市五龍口水產(chǎn)品批發(fā)市場，置實驗室水族箱（50 cm×30 cm× 30 cm）中養(yǎng)殖14 d后備用。期間每隔3 d換水一次，隔1d喂食一次。養(yǎng)殖用水曝氣48h，水溫為（20± 2）℃，pH值為7.5±0.3，溶氧量為（8±1）mg/L。

1.2 試驗設(shè)計

根據(jù)Cd對河蚌96h的LC50（134.9mg/L）的1/2，1/4，1/8，1/16，設(shè)置了8.43，16.86，33.72，67.45 mg/L共4個染毒組，同時設(shè)置一個對照組，處理時間96 h。選擇個體大小基本一致的個體（體質(zhì)量為（48.0±4.0）g，殼長為（6.8±0.3）cm）置處理缸（50 cm×35 cm×20 cm）中，每缸10只。處理期間不喂食、不換水，定時檢查蚌體存活情況。

1.3 試劑及儀器

3.1 VBAC形成的背景 疤痕子宮患者再次妊娠是選用陰道分娩還是選用剖宮產(chǎn)，一直是一個爭議的話題。傳統(tǒng)意見[12]認為“一次剖宮產(chǎn)，永遠剖宮產(chǎn)”，而選擇陰道分娩方式風(fēng)險極大；傳統(tǒng)醫(yī)療條件比較差，疤痕子宮患者再次妊娠分娩時容易出現(xiàn)子宮破裂現(xiàn)象，因此大部分產(chǎn)婦通常選擇剖宮產(chǎn)方式進行分娩。然而隨著產(chǎn)科醫(yī)生操作水平的不斷提高，當(dāng)代產(chǎn)科技術(shù)的不斷進步，手術(shù)、抗菌藥物與麻醉技術(shù)不斷更新，使子宮切口得到明顯改善，疤痕子宮患者再次妊娠采用陰道分娩的子宮破裂率并未增加。

試劑：氯化鎘（CdCl2·2.5H2O）、氯化鈉（NaCl），均為分析純；Caspase-3，8，9活性及蛋白質(zhì)含量測定試劑盒，購于碧云天生物技術(shù)研究所。H2O2含量測定試劑盒，購于南京建成生物研究所。

儀器設(shè)備：多功能酶標(biāo)儀（MD SpectraMax M5）、透射電子顯微鏡（JEM-1011）、冷凍離心機（Eppendorf5804R）、樣品處理制備系統(tǒng)（MP Fastprep-24）。

1.4 樣品制備及酶活性和超微結(jié)構(gòu)的測定方法

Cd（0，8.43，16.86，33.72，67.45 mg/L）處理96 h后，活體解剖河蚌取外套膜，濾紙吸凈表面水分，稱量后置－80℃冰箱中備用。試驗時取約25 mg組織，加入250 μL裂解液后勻漿，按照Caspase-3，8，9活性、H2O2含量試劑盒說明書實驗步驟操作。蛋白含量測定采用Bradford方法，并按照蛋白質(zhì)含量測定試劑盒說明書實驗步驟操作。

Cd（0，16.86，67.45 mg/L）處理96 h后，取河蚌解剖取外套膜，濾紙吸凈表面水分后取3～5塊組織塊（約1 mm3），置于2%戊二醛（體積分?jǐn)?shù)）中固定2 h，二甲胂酸鈉緩沖液沖洗2次，再用1%鋨酸（體積分?jǐn)?shù)）固定。乙醇和丙酮梯度脫水，Epon618環(huán)氧樹脂包埋，超薄切片機切片（切片厚度為50～70 nm），醋酸鈾-檸檬酸鉛雙重染色，透射電鏡觀察并拍照。

1.5 數(shù)據(jù)處理

試驗結(jié)果所得數(shù)據(jù)采用SPSS 15.0軟件包的單因素方差分析（One-Way ANOVA）進行處理分析；顯著性檢驗通過LSD法進行比較；所得結(jié)果均為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差（mean±SD）；*表示P＜0.05下顯著差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 鎘脅迫對背角無齒蚌外套膜Caspase-3，8，9活性及H2O2含量的影響

圖1-a結(jié)果顯示，與對照組相比，隨著Cd質(zhì)量濃度的升高，外套膜中Caspase-3活性呈現(xiàn)出低質(zhì)量濃度Cd脅迫下顯著降低（8.43 mg/L，P＜0.05），中高質(zhì)量濃度Cd下活性逐漸升高（33.72 mg/L，P＜0.05），高質(zhì)量濃度Cd下活性回落（67.45 mg/L）。當(dāng)Cd質(zhì)量濃度為33.72 mg/L時，Caspase-3活性達到最大值。

從圖1-b可以看出，隨著Cd質(zhì)量濃度的升高，外套膜中Caspase-8活性顯現(xiàn)出在中高質(zhì)量濃度Cd下逐漸增高的趨勢，與對照組相比增高顯著（16.86，33.72，67.45 mg/L，P＜0.05）。當(dāng)Cd質(zhì)量濃度為67.45 mg/L時，Caspase-8活性達到最大值。

由圖1-c可知，與對照組相比，隨著Cd質(zhì)量濃度的升高，外套膜中Caspase-9活性在低質(zhì)量濃度和高質(zhì)量濃度Cd下顯著下降（8.43，67.45 mg/L，P＜0.05），中高質(zhì)量濃度Cd下活性顯著升高（16.86，33.72 mg/L，P＜0.05）。當(dāng)Cd質(zhì)量濃度為33.72 mg/L時，Caspase-9活性達到最大值。

圖1-d結(jié)果顯示，隨著Cd質(zhì)量濃度的升高，外套膜中H2O2含量呈逐漸增高的趨勢，與對照組相比差異顯著（P＜0.05）。當(dāng)Cd質(zhì)量濃度67.45 mg/L時，H2O2含量達到最大值。

2.2 鎘對背角無齒蚌外套膜組織細胞亞顯微結(jié)構(gòu) 的影響

從圖2-A～C可以看出，對照組外套膜組織細胞結(jié)構(gòu)清晰完整，細胞表面微絨毛豐富且排列規(guī)則；細胞核結(jié)構(gòu)完整，近圓形或卵圓形，核膜清晰規(guī)則，染色質(zhì)分布均勻；線粒體呈圓形或橢圓形，形態(tài)正常，嵴豐富且規(guī)則排列；高爾基體和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)形態(tài)正常。

從圖2-D～E可以看出，16.82 mg/L Cd處理96 h后，對外套膜組織細胞結(jié)構(gòu)影響較大；細胞體積縮小，細胞內(nèi)空泡化嚴(yán)重；細胞表面微絨毛排列不整齊，空泡化嚴(yán)重，大部分脫落并逐漸減少和消失；細胞核形狀不規(guī)則，核膜腫脹內(nèi)陷并有破裂現(xiàn)象，染色質(zhì)致密濃縮并呈新月形或戒指狀邊集結(jié)于核膜上，部分染色質(zhì)出芽形成指狀結(jié)構(gòu)；線粒體形態(tài)異常，部分線粒體嵴數(shù)量減少且排列不整齊，腫脹變形且空泡化比較嚴(yán)重；核周圍出現(xiàn)大量溶酶體，并有增大現(xiàn)象，內(nèi)含很多沉積物。

圖2-F～G結(jié)果顯示，67.45 mg/L Cd處理96 h后，外套膜組織細胞結(jié)構(gòu)損傷嚴(yán)重，細胞形態(tài)畸形，細胞膜消失，細胞內(nèi)空泡化非常嚴(yán)重；細胞核形態(tài)嚴(yán)重變形，核膜水腫嚴(yán)重、折疊內(nèi)陷并破裂，染色質(zhì)嚴(yán)重濃縮并靠近核膜、出芽裂解成核碎片，形成凋亡小體；線粒體嵴模糊并消失，腫脹且空泡化嚴(yán)重；板層狀結(jié)構(gòu)粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)解體，形成許多大小不同的小泡，表面附著核糖體；大部分細胞器消失，細胞內(nèi)容物外泄。

3 討論

半胱氨酸蛋白酶（Caspase）家族是一組特異性切割天冬氨酸的蛋白酶，在細胞凋亡進程中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用，是細胞凋亡通路的匯聚點和執(zhí)行凋亡的最終途徑。Caspase在細胞凋亡過程中扮演著2類角色，一類為起始者Caspase，在細胞凋亡早期被活化后發(fā)揮作用；另一類為執(zhí)行者Caspase，在細胞凋亡后期被活化后起凋亡執(zhí)行作用[24]。Caspase-8和Caspase-9屬于起始者Caspase，而Caspase-3屬于執(zhí)行者Caspase。Caspase-3是細胞凋亡過程中最主要的執(zhí)行者Caspase，在細胞凋亡網(wǎng)絡(luò)中居于中心位置[25]。通常情況下，Caspase-3以無活性酶原形式分布于細胞質(zhì)和線粒體基質(zhì)中，可以被Caspase-8和Caspase-9通過凋亡信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路而激活。Caspase-3被活化后，隨即觸發(fā)下游細胞凋亡鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，使細胞凋亡不可避免發(fā)生[26]。

有研究表明，在Cd誘導(dǎo)發(fā)生的細胞凋亡過程中，Caspase-3是關(guān)鍵的細胞凋亡效應(yīng)分子[27]。典型環(huán)境污染物與生物脅迫課題組前期研究顯示，Cd可以顯著誘導(dǎo)河南華溪蟹鰓和肝胰腺組織中Caspase-3活性[11，28]。本研究結(jié)果顯示，外套膜中Caspase-3活性在低質(zhì)量濃度Cd（8.43 mg/L）處理后顯著降低；中質(zhì)量濃度Cd（33.72 mg/L）處理后活性顯著升高，Caspase-3活性在一定Cd質(zhì)量濃度范圍內(nèi)呈現(xiàn)出了明顯的劑量-效應(yīng)關(guān)系。這與河南華溪蟹鰓和肝胰腺組織中Caspase-3活性的變化規(guī)律有相同之處，也有區(qū)別性。

細胞凋亡經(jīng)典的途徑有2條，分別為細胞表面死亡受體途徑和線粒體引發(fā)途徑[29]。Caspase-8在細胞表面死亡受體途徑中起到至關(guān)重要的作用，Caspase-8酶原前體通過細胞膜死亡受體作用，自我水解活化形成活化態(tài)Caspase-8，隨即激活Caspase-3觸發(fā)細胞凋亡發(fā)生[30]。Caspase-9在Caspase依賴性線粒體引發(fā)凋亡途徑中發(fā)揮中心作用，細胞色素C與凋亡蛋白酶激活因子-1（Apaf-1）及Caspase-9前體形成凋亡體，隨即Caspase-9前體自剪切活化后激活Caspase-3觸發(fā)細胞凋亡發(fā)生[31-32]。本試驗結(jié)果表明，外套膜中Caspase-9活性在低質(zhì)量濃度和高質(zhì)量濃度Cd（8.43，67.45 mg/L）下顯著下降；中高質(zhì)量濃度Cd（16.86，33.72 mg/L）下活性顯著升高，變化規(guī)律與Caspase-3活性基本保持一致。有研究表明，在Cd致小鼠肝臟組織細胞凋亡和Cd致河南華溪蟹肝胰腺組織細胞凋亡中，Caspase-9和Caspase-3活性變化表現(xiàn)出了高度的一致性[11，33]，本試驗結(jié)果與之相似。揭示Cd致河蚌外套膜組織細胞凋亡途徑可能是通過線粒體引發(fā)途徑實現(xiàn)的。在中、高質(zhì)量濃度Cd處理組，與對照組相比，外套膜中Caspase-8活性呈現(xiàn)出逐步顯著增高的趨勢，這與前者的研究結(jié)果不同，顯示了物種的差異性。

有研究表明，Cd誘導(dǎo)引起的細胞凋亡與氧化損傷密切相關(guān)[34]，ROS在細胞凋亡早期發(fā)揮一定的作用，并可引起線粒體膜電位去極化[35-36]。其中，H2O2可以促使T淋巴細胞中細胞色素C釋放和激活Caspase酶原而引發(fā)細胞凋亡[35]，誘導(dǎo)細胞凋亡因子Fas和FasL在腸上皮細胞中的表達，以觸發(fā)細胞凋亡[37]。本試驗結(jié)果顯示，外套膜中H2O2含量隨Cd質(zhì)量濃度的增加而呈現(xiàn)出逐步顯著增高的趨勢，這與Cd致河南華溪蟹鰓組織中H2O2含量的變化規(guī)律相似[26]。同時，生物有機體為了拮抗氧化脅迫，會通過過量表達抗氧化酶來降低氧化損傷。有研究也證實，Cd在96 h可以顯著誘導(dǎo)河蚌外套膜中SOD，CAT和GPX活性以應(yīng)對氧化損傷，以消除組織中過量的H2O2[38]。

Caspase酶原被激活后，尤其是Caspase-3活化后可以通過酶解細胞凋亡抑制因子，裂解細胞外基質(zhì)和細胞骨架及蛋白，酶解遺傳物質(zhì)修復(fù)因子，從而使細胞功能和形態(tài)發(fā)生一定的變化，包括細胞體積縮小，細胞質(zhì)固縮，細胞器變形消失，細胞之間裂解分離，染色質(zhì)凝聚及核碎裂等[39]。本試驗結(jié)果表明，Cd在一定質(zhì)量濃度范圍內(nèi)激活了Caspase酶活性，同時，致使外套膜組織細胞結(jié)構(gòu)發(fā)生了不同程度的變化，表現(xiàn)出了細胞凋亡的細胞形態(tài)特征；細胞體積縮小，細胞內(nèi)空泡化嚴(yán)重；微絨毛脫落消失；核膜水腫并折疊內(nèi)陷，染色質(zhì)嚴(yán)重濃縮并出芽裂解；線粒體嵴模糊并腫脹，空泡化嚴(yán)重。與已有的研究結(jié)果相似[11，28]。

Cd誘導(dǎo)的細胞凋亡包括Caspase依賴型[36]和Caspase非依賴型途徑[40]，有研究顯示，Cd致使有機體產(chǎn)生氧化損傷后，產(chǎn)生過量的ROS，在激活Caspase酶活性的同時也表現(xiàn)出了典型的細胞凋亡特征[41]。本試驗結(jié)果表明，Cd促使外套膜組織中H2O2顯著增加，Caspase-3，Caspase-8和Caspase-9活性在一定程度上也顯著升高，并表現(xiàn)了細胞凋亡的細胞形態(tài)特征。也有研究發(fā)現(xiàn)，H2O2可以通過Caspase依賴型途徑促使細胞凋亡發(fā)生[35]。雖然，Cd不能直接導(dǎo)致有機體組織氧化損傷和細胞凋亡，但是Cd可以通過誘導(dǎo)的ROS-caspase級聯(lián)反應(yīng)-細胞凋亡信號通路觸發(fā)凋亡[26]。因此，推測Cd處理河蚌后，Caspase依賴型途徑觸發(fā)的凋亡發(fā)生于河蚌外套膜組織中。H2O2作為活性氧自由基，一方面加重了外套膜組織的氧化損傷；另一方面可以作為信號分子激活Caspase酶活性并觸發(fā)細胞凋亡。

綜上所述，在Cd急性處理河蚌96 h后，外套膜受到氧化脅迫以后，產(chǎn)生大量的活性氧H2O2，并引發(fā)Caspase-3，Caspase-8和Caspase-9活性在一定程度顯著升高，觸發(fā)組織細胞發(fā)生凋亡，并表現(xiàn)出典型的細胞凋亡形態(tài)特征。同時，推測Cd致河蚌外套膜組織細胞凋亡可能是通過線粒體引發(fā)途徑實現(xiàn)的，Cd可以通過誘導(dǎo)ROS引起caspase級聯(lián)反應(yīng)后觸發(fā)細胞凋亡。至于更詳細的凋亡機制，仍需要后續(xù)進一步深入研究。

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Effects of Cadmium on Apoptosis-related Enzymes Activity and Cellularity Changes of the Mantle of Freshwater MusselAnodonta woodiana

LI Yongquan，YANGHuizhen，RENYujuan，WUHao，JINGWeixin，WANGLan
（College ofLife Sciences，Shanxi University，Taiyuan 030006，China）

This study examines the effects of cadmium（Cd）on the activities of apoptosis-related enzymes,the level of H2O2and ultrastructure ofthe mantle ofthe freshwater mussel Anodonta woodiana.The freshwater mussels were exposed todifferent concentrations ofCd（8.43,16.86,33.72,67.45 mg/L）for 96 h.Activities ofCaspase-3,8,9,as well as H2O2level were measured by enzymatic assays. The result showed that with the increase of Cd concentration,Caspase-3 activity decreased initially and increased subsequently（P＜0.05）.The change in Caspase-9 activity followed the similar pattern.The activity of Caspase-8 increased significantly after the mussels exposed to Cd in a dose-dependent manner（P＜0.05）.With the increase of Cd concentration,H2O2level increased gradually in a dose-dependent manner（P＜0.05）.Moreover,after Cd treatment（16.86,67.45 mg/L）for 96 h,histological abnormalities were observed by electronic microscopy in the mantle cells.After Cd treatment（16.86 mg/L）,the obvious changes of cellularity were shown by the followingfeatures:chromatin condensed near nuclear membrane,nuclear membrane swelled and ruptured;mitochondria became swelling and vacuolating gradually,and some mitochondrial crisae disintegrated;microvilli arranged disorderly,broke off and were decreased gradually,the vacuole appeared.After Cd treatment（67.45 mg/L）,the histological abnormalities were more apparent by the following features:most of chromatin condensed near nuclear membrane,nuclear membrane swelled and ruptured seriously;mitochondria became swelling and vacuolating,and most of mitochondrial crisae disintegrated;rough endoplasmic reticulum disintegrated,and formed many different sizes ofvesicles.In conclusion,Cd can cause significant changes in the enzymatic activities and histological abnormalities to the mantle ofthe animal.

Anodonta woodiana;mantle;caspase;cellularity;cadmium

X174

A

1002-2481（2016）08-1108-06

10.3969/j.issn.1002-2481.2016.08.13

2016-05-25

山西省普通高校生物學(xué)特色重點學(xué)科建設(shè)項目（2011-SXDX-SWX-003）

李涌泉（1981-），男，山西大同人，講師，主要從事水生生態(tài)毒理學(xué)教學(xué)及研究工作。王 蘭為通信作者。