雜交構(gòu)樹組培快繁體系的建立

劉 蕓，郭龍妹，任淼輝，田雙梅

（1.山西農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，山西太谷030801；2.佳縣農(nóng)業(yè)技術(shù)推廣中心，陜西佳縣719200）

雜交構(gòu)樹組培快繁體系的建立

劉 蕓1，郭龍妹1，任淼輝1，田雙梅2

（1.山西農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，山西太谷030801；2.佳縣農(nóng)業(yè)技術(shù)推廣中心，陜西佳縣719200）

通過對雜交構(gòu)樹的組織培養(yǎng)，研究不同的滅菌方法和激素配比對愈傷組織的誘導(dǎo)、芽的增殖、壯苗及生根的影響。結(jié)果表明，最佳滅菌劑為0.5%的HgCl2，滅菌15 min后除菌率達(dá)到68.2%；誘導(dǎo)愈傷組織分化的最佳培養(yǎng)基為MS＋1.5 mg/L6-BA＋1.0 mg/LNAA＋0.8%瓊脂＋3%蔗糖；最佳壯苗培養(yǎng)基為MS＋1.5 mg/L6-BA＋0.2 mg/L NAA＋0.8%瓊脂＋3%蔗糖；最佳生根培養(yǎng)基為1/2 MS＋0.5 mg/L6-BA＋1.0 mg/LNAA＋0.8%瓊脂＋3%蔗糖；移栽的最佳基質(zhì)為蛭石，移栽后成活率達(dá)到88%。

雜交構(gòu)樹；組織培養(yǎng)；快繁

雜交構(gòu)樹（Broussonetia papyrifera L.）為?？茦?gòu)屬落葉喬木，又名鹿仔樹、榖漿樹，是構(gòu)樹優(yōu)良種源的雜交種，在我國的溫帶、熱帶均有分布。其適應(yīng)性強，抗逆性強，生長迅速，耐旱、耐鹽、耐堿，在瘠薄土地均能生存，是良好的經(jīng)濟(jì)林和生態(tài)林品種，具有很高的利用價值[1]。現(xiàn)代研究表明，構(gòu)樹葉總黃酮具有抑菌抗癌防腐的作用[2-4]；其果實楮實子具有清肝明目、補肺益腎之功效，所含有的紅色素及提取物具有不同程度的抗氧化作用[5]；構(gòu)樹纖維表面光滑，部分纖維還有不明顯的轉(zhuǎn)曲，具有類似苧麻的橫紋，可廣泛用于造紙產(chǎn)業(yè)及新型紡紗材料等領(lǐng)域[6-7]；其還具有吸附空氣中的有害氣體和滯塵等功能，是較為優(yōu)良的生態(tài)保健園林綠化樹種[8]。戚亞偉等[9]研究表明，構(gòu)樹葉對養(yǎng)分過剩而導(dǎo)致的小鼠肥碩有治療效果，并能促進(jìn)其油脂減少，改變內(nèi)臟脂肪變性。

王克榮等[10]研究表明，蔬菜害蟲能被構(gòu)樹葉汁液有效地殺死，可以用構(gòu)樹葉開發(fā)出天然生物殺蟲劑。瞿曉晶等[11]研究表明，構(gòu)樹種子油對羥基自由基的抑制率高達(dá)93.56%。構(gòu)樹子還具有壯筋健骨，清熱明目的功效，可用于治療腰膝不適，腎虧目昏。此外，構(gòu)樹葉還可以代替苜蓿草粉和豆粕做成飼料添加在牛羊等的日糧中[12]。其樹皮、木材、葉、花、果實、種子、根、乳汁等皆可綜合利用，經(jīng)濟(jì)效益潛力很大[13]。目前，構(gòu)樹苗木主要靠常規(guī)的無性扦插繁殖，但由于材料來源不足，扦插成活率不高，費時費工，難以滿足當(dāng)前大面積栽培及推廣的需要[14]。由于構(gòu)樹具有巨大的利用價值，其需求量也在日趨增加，但雜交構(gòu)樹在自然條件下生長周期較長，遠(yuǎn)不能滿足社會的需求，而利用組織培養(yǎng)快繁技術(shù)能很好地解決構(gòu)樹資源短缺的問題。

本試驗通過優(yōu)化滅菌方法和激素配比，進(jìn)行愈傷組織、芽及根的誘導(dǎo)，建立了構(gòu)樹的組織培養(yǎng)體系，旨在為構(gòu)樹的大量快繁奠定基礎(chǔ)，同時，也可減輕對構(gòu)樹野生資源的采挖和破壞，實現(xiàn)良好的生態(tài)效益。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

供試材料為生長健壯、無病害的構(gòu)樹葉片，由山西清徐科爾沁構(gòu)樹種植基地提供。

1.2 試驗方法

1.2.1 試驗條件 以MS培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基，改變激素種類、濃度及添加瓊脂、蔗糖形成不同培養(yǎng)基組合，并于光照時間為12 h、光照強度為2 500 lx、培養(yǎng)溫度為（25±2）℃的條件下對試驗材料進(jìn)行培養(yǎng)。

1.2.2 試驗材料的獲取及消毒 將洗干凈的構(gòu)樹葉片用75%乙醇溶液浸泡30 s，經(jīng)無菌水沖洗2～3次，置于滅菌液中滅菌，并設(shè)置空白對照。滅菌液分別為9%Ca（ClO）2，0.5%HgCl2和10%H2O2，滅菌時間分別設(shè)定為5，10，15 min。滅菌完成后記錄葉片的死亡率，并用無菌水沖洗4～10次，瀝干水后迅速將葉片接種到培養(yǎng)基中，每瓶接種3～4個，10瓶為一組，共接種9組，光照培養(yǎng)室中培養(yǎng)7 d后統(tǒng)計葉片的污染率和成活率。

1.2.3 愈傷組織及芽苗的誘導(dǎo) 以MS＋0.8%瓊脂＋3%蔗糖為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，加入不同質(zhì)量濃度的6-BA和NAA。6-BA采用0.5，1.0，1.5 mg/L等3個水平，NAA采用0.5，1.0，1.5 mg/L等3個水平。將葉片切成1 cm2左右的正方形，接入培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)。每個水平接種20瓶，每瓶3塊葉片，培養(yǎng)20 d后觀察并記錄愈傷組織及芽苗的生長情況。

1.2.4 壯苗培養(yǎng)基的篩選 以MS＋0.8%瓊脂＋3%蔗糖為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，加入不同質(zhì)量濃度的6-BA和NAA。6-BA設(shè)置1.0，1.5，2.0 mg/L等3個水平，NAA設(shè)置0.10，0.15，0.20 mg/L等3個水平。選擇長勢較好的基礎(chǔ)苗進(jìn)行壯苗，每個水平做15瓶，每瓶插1～2株。接種后置于光照培養(yǎng)室中，20 d后觀察并記錄壯苗結(jié)果。

1.2.5 構(gòu)樹生根培養(yǎng)基的篩選 以1/2 MS＋0.8%瓊脂＋3%蔗糖為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，加入不同質(zhì)量濃度的6-BA和NAA。6-BA采用0.5，1.0，1.5 mg/L等3個水平，NAA采用0.2，0.3，0.4，0.5 mg/L等4個水平。每瓶接種1～2個幼苗，每個水平接種15瓶，培養(yǎng)15 d后觀察并記錄構(gòu)樹健壯幼苗的生根情況。

1.2.6 構(gòu)樹的馴化移栽 將長有構(gòu)樹幼苗的培養(yǎng)瓶轉(zhuǎn)移至半遮陰的自然光下，2～3 d后開口煉苗。將營養(yǎng)缽中裝入蛭石和珍珠巖，洗干凈幼苗根部黏附的培養(yǎng)基后，將幼苗移入營養(yǎng)缽中并澆足水。用塑料薄膜為幼苗搭建小拱棚并噴霧保濕，同時注意通風(fēng)，隨后逐漸降低濕度，15 d后揭去棚膜，讓幼苗在自然條件下生長。

2 結(jié)果與分析

2.1 消毒劑及消毒方法的比較

從表1可以看出，滅菌效果最好的處理是75%乙醇溶液浸泡30 s后，再用0.5%HgCl2滅菌15 min，除菌率可以達(dá)到68.2%，外植體的成活率可達(dá)43.6%。

表1 不同消毒方法對構(gòu)樹葉片消毒效果的比較

2.2 誘導(dǎo)愈傷組織及芽苗培養(yǎng)基的篩選

表2 不同培養(yǎng)基對愈傷組織的誘導(dǎo)效果

構(gòu)樹葉片在愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基中培養(yǎng)20 d后，觀察不同濃度激素比例下葉片的增殖倍數(shù)與芽苗高度等生長狀況。由表2可知，對愈傷組織的影響較大的激素為6-BA，當(dāng)6-BA質(zhì)量濃度逐漸增大時，芽的增殖倍數(shù)逐漸變大，當(dāng)6-BA質(zhì)量濃度為1.5 mg/L、NAA質(zhì)量濃度為1.0 mg/L時，增殖倍數(shù)為5.4，愈傷組織分化效果最明顯。因此，誘導(dǎo)愈傷組織分化的最佳培養(yǎng)基配方為MS＋1.5 mg/L 6-BA＋1.0 mg/L NAA＋0.8%瓊脂＋3%蔗糖。芽苗增殖結(jié)果如圖1-a所示。

2.3 構(gòu)樹壯苗培養(yǎng)基的篩選

從表3可以看出，分析可得對壯苗影響較大的激素為6-BA，當(dāng)6-BA質(zhì)量濃度為1.5 mg/L，NAA質(zhì)量濃度為0.2 mg/L時，壯苗效果最明顯，此時株高為3.6 cm。由此可得壯苗效果最佳的培養(yǎng)基配方為MS＋1.5 mg/L 6-BA＋0.20 mg/L NAA＋0.8%瓊脂＋3%蔗糖。壯苗結(jié)果如圖1-b所示。

表3 不同培養(yǎng)基對構(gòu)樹壯苗的誘導(dǎo)效果

2.4 生根培養(yǎng)基的篩選

接種至生根培養(yǎng)基12 d后可以看到根原基分化出的愈傷組織，15 d后可看到誘導(dǎo)出的細(xì)小不定根。從表4可以看出，當(dāng)6-BA質(zhì)量濃度為0.5 mg/L、NAA質(zhì)量濃度為1.0 mg/L時，根的生長情況最好，此時根原基的發(fā)生率為93%。由此可以得出，最佳的生根培養(yǎng)基為1/2 MS＋0.5 mg/L6-BA＋1.0 mg/L NAA＋0.8%瓊脂＋3%蔗糖。生根結(jié)果如圖1-c所示。

表4 不同培養(yǎng)基對構(gòu)樹生根的誘導(dǎo)效果

2.5 構(gòu)樹幼苗的馴化移栽

從表5可以看出，構(gòu)樹幼苗在移栽到蛭石中的成活率高于珍珠巖，在珍珠巖中，葉片失水嚴(yán)重，苗木萎蔫，生長不良；而蛭石中的幼苗則生長良好，移栽25 d后，長高3～5 cm，葉片明顯變大且長出1～2條新根，原來的根伸長1～2 cm。

表5 不同基質(zhì)對構(gòu)樹試管苗移栽后成活率的影響

3 討論與結(jié)論

無菌材料是植物組培快繁的前提，對葉片進(jìn)行消毒時，時間過長可能會對材料造成毒害，影響葉片的生命活力；時間過短可能會造成消毒不徹底。本試驗的最佳滅菌方法為0.5%的HgCl2處理15 min，在考慮選擇何種滅菌劑的同時，還綜合考慮了滅菌時間對滅菌效果的影響，與宋麗紅[15]及劉中兵[16]的研究思路接近。但也有研究認(rèn)為，構(gòu)樹葉片外植體最佳消毒方法是0.1%的HgCl2（加吐溫80）和0.5%次氯酸鈉的二次滅菌法[17]，這可能是由于試驗材料的來源不同及其生長環(huán)境的差異，導(dǎo)致材料所帶的微生物不同，從而需要滅菌的強度也有所差異。

在組織培養(yǎng)中，生長素類物質(zhì)的主要作用是促進(jìn)新梢生長，誘導(dǎo)外植體產(chǎn)生愈傷組織及促進(jìn)培養(yǎng)組織的延伸生長；細(xì)胞分裂素類物質(zhì)的主要作用是促進(jìn)細(xì)胞的分裂和分化，誘導(dǎo)胚狀體和不定芽的形成。在離體條件下，器官的誘導(dǎo)并不是由某種生長激素的濃度所決定，而是為那些參與分化的物質(zhì)間的比例關(guān)系所決定，當(dāng)6-BA與NAA的比例低時有利于愈傷組織的形成和芽的生長；比例高時有利于芽的分化[18-20]。本試驗研究結(jié)果表明，誘導(dǎo)愈傷組織分化時6-BA與NAA的適宜比例為3∶2；壯苗時6-BA與NAA的適宜比例為15∶2；生根時6-BA與NAA的適宜比例為1∶2，與其他文獻(xiàn)中報道的生長激素使用比列相符合。

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Establishment of Tissue Culture and Rapid Propagation System of HybridBroussonetia papyrifera

LIUYun1，GUOLongmei1，RENMiaohui1，TIANShuangmei2
（1.College ofLife Sciences，Shanxi Agricultural University，Taigu 030801，China；2.Jiaxian CountyAgricultural TechnologyExtension Center，Yulin Gity，Jiaxian 719200，China）

Based on tissue culture of hybrid Broussonetia papyrifera,this paper studied on the effect of different factors,such as different sterilization treatments and combinations of plant growth regulators.The result showed that the appropriate sterilant agent was 0.5%HgCl2,the sterilization rate reached 68.2%after 15 min sterilization.The most suitable medium for callus differentiation consisted of MS＋1.5 mg/L 6-BA＋1.0 mg/L NAA＋0.8%agar+3%sugar;MS＋1.5 mg/L 6-BA＋0.2 mg/L NAA＋0.8%agar＋3%sugar was the optimum for strong seedling cultivation;and the best rooting medium was 1/2 MS＋0.5 mg/L 6-BA＋1.0 mg/L NAA＋0.8%ager＋3%sugar.The best growth substrate for transplant was vermiculite,the survival rate reached 88%.

hybrid Broussonetia papyrifera;tissue culture;rapid propagation

S792.99

A

1002-2481（2016）08-1073-04

10.3969/j.issn.1002-2481.2016.08.05

2016-05-16

山西省普通高等學(xué)校大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練項目（J201482025）

劉 蕓（1993-），女，河北石家莊人，在校學(xué)生，研究方向：中藥材開發(fā)與應(yīng)用。