脊尾白蝦C-型凝集素基因cDNA全長(zhǎng)的克隆和表達(dá)分析

王有昆, 劉 萍, 李吉濤, 李 健

?

脊尾白蝦C-型凝集素基因cDNA全長(zhǎng)的克隆和表達(dá)分析

王有昆1, 3, 劉 萍1, 2, 李吉濤1, 2, 李 健1, 2

(1. 中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院黃海水產(chǎn)研究所農(nóng)業(yè)部海洋漁業(yè)可持續(xù)發(fā)展重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 山東青島 266071; 2.青島海洋科學(xué)與技術(shù)國(guó)家實(shí)驗(yàn)室海洋漁業(yè)科學(xué)與食物產(chǎn)出過(guò)程功能實(shí)驗(yàn)室, 山東青島 266071; 3.上海海洋大學(xué)水產(chǎn)與生命學(xué)院, 上海 201306)

本研究利用本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建的脊尾白蝦()血細(xì)胞cDNA文庫(kù)中的C-型凝集素基因EST序列, 采用cDNA末端快速擴(kuò)增(rapid amplification of cDNA end, RACE)技術(shù)克隆獲得脊尾白蝦C-型凝集素基因cDNA全長(zhǎng), 命名為。該基因全長(zhǎng)1285 bp, 包含1041 bp的開(kāi)放閱讀框, 編碼346個(gè)氨基酸組成的蛋白質(zhì), 分子量為38.56 kDa, 為甘露糖型凝集素。同源性分析表明, 脊尾白蝦基因氨基酸序列與秀麗白蝦()的同源性最高, 達(dá)到91％。熒光定量PCR分析結(jié)果表明,基因在血細(xì)胞、肝胰腺、肌肉等組織中均有表達(dá), 其中在肝胰腺當(dāng)中的相對(duì)表達(dá)量最高。感染鰻弧菌()和白斑綜合癥病毒(white spot syndrome virus, WSSV)后6~12 h, 脊尾白蝦血細(xì)胞和肝胰腺中的表達(dá)量較對(duì)照組均顯著增加(<0.05), 且具有明顯的時(shí)間差異性。本研究證明脊尾白蝦C-型凝集素在其免疫反應(yīng)中起到重要作用, 為進(jìn)一步探索脊尾白蝦免疫系統(tǒng)打下基礎(chǔ)。

脊尾白蝦(); C-型凝集素; 基因克隆; 基因表達(dá)

凝集素是具有凝集血細(xì)胞作用的一類蛋白。根據(jù)其結(jié)構(gòu)特征及特異性結(jié)合基序不同, 動(dòng)物凝集素被分為: L-型凝集素、P-型凝集素、C-型凝集素、I-型凝集素、R-型凝集素、半乳糖結(jié)合凝集素(Galectin)和鈣連蛋白(Calnexin)。在機(jī)體對(duì)病害的免疫防御過(guò)程中, 凝集素具有識(shí)別、黏附, 調(diào)理, 促吞噬等生理生化功能[1-3], 在無(wú)脊椎動(dòng)物的免疫系統(tǒng)中更是起到極其重要的作用。C-型凝集素因其鈣離子依賴性得名, 在Ca2+存在下能特異地識(shí)別并結(jié)合外源微生物表面的糖類物質(zhì), 引起一系列免疫反應(yīng)從而有效地抵抗病原微生物的入侵, 例如三疣梭子蟹(、凡納濱對(duì)蝦()重組C-型凝集素可與病原微生物結(jié)合并凝集甚至阻斷感染[4-5]。有研究表明, C-型凝集素還在某些重要的免疫過(guò)程如細(xì)胞的遷移、細(xì)胞間相互作用等過(guò)程中起到了至關(guān)重要的作用[6-7]。這些研究都證明了C-型凝集素在免疫防御過(guò)程中扮演重要角色, 是免疫防御的重要基因之一[8]。

脊尾白蝦()是中國(guó)重要的底棲蝦類[9], 具有繁殖能力強(qiáng)、生長(zhǎng)季節(jié)長(zhǎng)、環(huán)境適應(yīng)性廣的特點(diǎn)[10-11], 是中國(guó)重要的經(jīng)濟(jì)養(yǎng)殖品種。但隨著沿海灘涂的開(kāi)發(fā), 養(yǎng)殖面積的擴(kuò)大, 病害問(wèn)題日益嚴(yán)重, 給養(yǎng)殖戶造成了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失[12]。脊尾白蝦作為甲殼動(dòng)物具有先天性免疫防御功能, 深入研究其免疫相關(guān)基因及其作用機(jī)制, 可為其養(yǎng)殖病害防治提供理論依據(jù)。目前, C-型凝集素基因在中國(guó)對(duì)蝦()[13-14]、斑節(jié)對(duì)蝦()[15-16]、凡納濱對(duì)蝦[15-16]等蝦類中已見(jiàn)相關(guān)報(bào)道。且在免疫調(diào)節(jié)中發(fā)揮了重要作用。但脊尾白蝦C-型凝集素基因的相關(guān)研究則尚未見(jiàn)報(bào)道。

本研究利用RACE技術(shù)從脊尾白蝦中成功克隆了C-型凝集素基因cDNA全長(zhǎng), 通過(guò)鰻弧菌()以及白斑綜合癥病毒感染實(shí)驗(yàn)分析了該基因在病原感染后72 h內(nèi)血細(xì)胞和肝胰腺中的表達(dá)量變化, 為探討脊尾白蝦C-型凝集素基因在脊尾白蝦受病原的刺激下發(fā)揮免疫功能的途徑和抗病機(jī)理, 同時(shí)也為脊尾白蝦的抗病品系的選育提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

實(shí)驗(yàn)所用健康脊尾白蝦購(gòu)買于昌邑市海豐水產(chǎn)養(yǎng)殖有限責(zé)任公司, 體長(zhǎng)(4.13±0.27)cm, 體質(zhì)量(1.15±0.28)g。每30尾脊尾白蝦一組, 于200 L PVC桶中暫養(yǎng)一周。養(yǎng)殖水溫(24±1)℃, 鹽度25, pH 8.0, 每日換水1/3, 投喂配合飼料。

SMART?RACE Amplification Kit和Advantage 2 PCR Kit購(gòu)買于Clontech公司; TRIzol Reagent購(gòu)買于Invitrogen公司; DNA膠回收試劑盒購(gòu)買于生工生物工程(上海)股份有限公司; 大腸桿菌()Top 10感受態(tài)細(xì)胞和PMD18-T載體均購(gòu)買于北京天根生化科技有限公司; SYBR??Ⅱ(2×)購(gòu)買于寶生物工程(大連)有限公司。

1.2 脊尾白蝦基因全長(zhǎng)cDNA的克隆

根據(jù)本實(shí)驗(yàn)室前期獲得的脊尾白蝦C-型凝集素基因的EST序列設(shè)計(jì)3′RACE和5′RACE特異性引物, 并送由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。使用SMART?RACE Amplification Kit和Advantage 2 PCR Kit進(jìn)行3′和5′RACE擴(kuò)增。將引物CTLF1(表1)和通用引物UPM配對(duì), 進(jìn)行3′端擴(kuò)增; 引物CTLR1(表1)和通用引物UPM配對(duì), 進(jìn)行5'端擴(kuò)增。反應(yīng)程序如下: 94℃ 5 min; 94℃ 30 s, 72℃ 3 min, 5個(gè)循環(huán); 94℃ 30 s, 70℃ 30 s, 72℃ 3 min, 5個(gè)循環(huán); 94℃ 30 s, 68℃ 30 s, 72℃ 3 min, 25個(gè)循環(huán); 72℃ 10 min。

表1 實(shí)驗(yàn)所用引物名稱及序列

3′RACE和5′RACE擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè), 使用DNA膠回收試劑盒回收純化目的片段, 純化產(chǎn)物連接PMD18-T Vector后轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞; 將經(jīng)菌落PCR鑒定的陽(yáng)性克隆菌液送往上海桑尼生物科技有限公司進(jìn)行測(cè)序。

1.3 序列分析

利用VecScreen (http: //www.ncbi.nlm.nih.gov/ tools/vecscreen/)去除載體序列, 然后用DNAStar軟件進(jìn)行序列拼接、開(kāi)放閱讀框(ORF)的預(yù)測(cè)和氨基酸翻譯。使用BLAST(http: //www.blast.ncbi.nlm.nih. gov/Blast.cgi)對(duì)獲得的基因序列進(jìn)行同源性比對(duì)。使用ExPASy(http: //www.expasy.org/tools/)進(jìn)行蛋白質(zhì)功能結(jié)構(gòu)域分析、理化性質(zhì)預(yù)測(cè)及信號(hào)肽序列分析。使用DNAMAN軟件對(duì)脊尾白蝦EcCTL與其他物種的CTL氨基酸序列進(jìn)行多序列比對(duì), 采用MEGA 4.0軟件構(gòu)建NJ系統(tǒng)進(jìn)化樹。

1.4基因組織表達(dá)分析

根據(jù)脊尾白蝦基因cDNA全長(zhǎng)和內(nèi)參基因18S rRNA的全長(zhǎng)序列, 分別設(shè)計(jì)一對(duì)正反引物(CTLF2/R2及18S F/R)(表1), 利用Real-time PCR檢測(cè)鰻弧菌和WSSV感染后的脊尾白蝦血細(xì)胞和肝胰腺中不同時(shí)間點(diǎn)基因的相對(duì)表達(dá)量。反應(yīng)體系和程序參考SYBR??Ⅱ說(shuō)明書, 采用20 μL反應(yīng)體系, 包括10 μL SYBR? Premix Ex TaqTMⅡ(2×), 0.4 μL ROX Reference Dye Ⅱ(50×)*3, 0.8 μL 10 μmol/L引物CTLF2, 0.8 μL 10 μmol/L引物CTLR2, 6.0 μL DEPC水, 2.0 μL cDNA。反應(yīng)程序?yàn)? 95℃ 30 s; 95℃ 5 s, 60℃ 34 s, 40個(gè)循環(huán); 95℃ 15 s, 60℃ 1 min, 95℃ 15 s?；虻南鄬?duì)表達(dá)量通過(guò)2–DDCT法計(jì)算得到, 使用SPSS 17.0軟件對(duì)結(jié)果進(jìn)行顯著性分析。

1.5 鰻弧菌和WSSV感染實(shí)驗(yàn)

實(shí)驗(yàn)前用白斑病毒綜合癥檢測(cè)試劑盒對(duì)隨機(jī)挑取的10尾脊尾白蝦進(jìn)行檢測(cè), 證實(shí)其均未感染W(wǎng)SSV。暫養(yǎng)一周后將健康脊尾白蝦每50尾一組隨機(jī)分為3組: 鰻弧菌感染組、WSSV感染組和對(duì)照組。鰻弧菌感染組每尾蝦注射20μL鰻弧菌菌懸液, 實(shí)驗(yàn)用鰻弧菌為本實(shí)驗(yàn)室保存, 于實(shí)驗(yàn)前一天進(jìn)行菌種活化, 以磷酸緩沖液(PBS)稀釋至終濃度為2×108cfu/mL; WSSV感染組每尾蝦注射20 μL WSSV粗提液, 方法參照段亞飛[10], 對(duì)照組每尾蝦注射20 μL PBS, 注射部位均為第二腹節(jié)基部。于注射后0、3、6、12、24、48及72 h每組分別隨機(jī)取6尾蝦的血細(xì)胞和肝胰腺, 用于RNA提取。另取6尾健康脊尾白蝦的卵巢、眼柄、胃、腸、血細(xì)胞、肝胰腺、肌肉和鰓, 分別提取RNA, 檢測(cè)脊尾白蝦基因在不同組織中的表達(dá)水平。

2 結(jié)果

2.1基因cDNA全長(zhǎng)的克隆及序列分析

經(jīng)紫外分光光度計(jì)和1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè),脊尾白蝦血細(xì)胞提取獲得的總RNA OD260/OD280為1.88, 18S和28S rRNA條帶清晰且完整, 表明所提取的總RNA質(zhì)量和純度較高, 能夠滿足后續(xù)實(shí)驗(yàn)的要求。分別用特異性引物CTLF1和CTLR1與通用引物UPM配對(duì)進(jìn)行RACE擴(kuò)增, 獲得939 bp和1106 bp的PCR產(chǎn)物。將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物分別測(cè)序, 測(cè)序結(jié)果與已有的EST序列拼接, 獲得脊尾白蝦C-型凝集素基因cDNA全長(zhǎng)序列(GenBank登錄號(hào)為KF791035)并將其命名為。

該基因全長(zhǎng)1285bp, 包含1041bp的開(kāi)放閱讀框, 62bp的5′端非編碼區(qū)(UTR)以及182bp的3′端非編碼區(qū), 編碼一個(gè)由346個(gè)氨基酸殘基組成的蛋白質(zhì), 分子量為38.56 kDa, 理論等電點(diǎn)為4.29, 其N端含有17個(gè)氨基酸組成的信號(hào)肽。生物信息學(xué)分析表明, 脊尾白蝦EcCTL氨基酸序列中含有2個(gè)糖識(shí)別結(jié)構(gòu)域(CRD), 分別在47~179、206~340位置, 并且具有12個(gè)保守的半胱氨酸(cys)位點(diǎn), 參與到糖識(shí)別結(jié)構(gòu)域的形成, 12個(gè)保守的cys位點(diǎn)分別位于47、58、76、154、170、178、206、217、235、315、331、339位置上。EcCTL的CRD中決定糖結(jié)合特異性的基序是“EPD”(Glu306-Pro307-Asp308), 能夠結(jié)合甘露糖及甘露糖的衍生物。

細(xì)實(shí)線框標(biāo)注的ATG是起始密碼子, 粗實(shí)線框標(biāo)注的AATAAA代表加尾信號(hào); 粗單線下劃線代表信號(hào)肽; 細(xì)下劃線代表糖識(shí)別結(jié)構(gòu)域; *表示終止密碼子

The start codon (ATG) is marked with thick box, and tail signal (AATAAA) is marked with thick box the signal peptide sequence is marked with a thick line, the carbohydrate recognition domain is marked with a thin underline, and thestop codon is marked with an*

2.2基因的相似性及系統(tǒng)進(jìn)化分析

對(duì)脊尾白蝦基因編碼的氨基酸序列使用BLAST進(jìn)行同源性分析, 發(fā)現(xiàn)脊尾白蝦EcCTL氨基酸序列與秀麗白蝦()的同源性最高, 為91%。與其它節(jié)肢動(dòng)物如羅氏沼蝦()、墨吉對(duì)蝦()、日本對(duì)蝦()、中國(guó)對(duì)蝦、凡納濱對(duì)蝦的C-型凝集素的同源性較低分別為37%、37%、36%、36%和36%。將脊尾白蝦EcCTL與中國(guó)對(duì)蝦、墨吉對(duì)蝦、羅氏沼蝦、秀麗白蝦等動(dòng)物的C-型凝集素氨基酸序列進(jìn)行比對(duì)發(fā)現(xiàn), 脊尾白蝦EcCTL糖結(jié)合特異性相關(guān)的基序?yàn)镋PD, 推測(cè)其為甘露糖型凝集素(圖2)。利用MEGA 4.0軟件進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化分析表明, 脊尾白蝦EcCTL與秀麗白蝦C-型凝集素緊密聚為一支, 之后與中國(guó)對(duì)蝦、墨吉對(duì)蝦、斑節(jié)對(duì)蝦、凡納濱對(duì)蝦等節(jié)肢類C-型凝集素聚為一支(圖3)。

用▲標(biāo)注參與CRD分子內(nèi)二硫鍵形成的cys, 用下劃線標(biāo)出與C-型凝集素糖結(jié)合特異性相關(guān)的基序。各物種C-型凝集素序列登錄號(hào)為中國(guó)對(duì)蝦(ACJ06429)、墨吉對(duì)蝦(AGS42194)、凡納濱對(duì)蝦(ABI97374)、日本對(duì)蝦(AGW27416)、羅氏沼蝦(AFN20600)、短溝對(duì)蝦()(ABI97372)、秀麗白蝦(AGZ95688)

Conserved cysteine residues are marked with a ▲, and the conserved amino acid residues specific to binding by mannose are underlined. The GenBank accession numbers of C-type lectin are as follows:(ACJ06429),(AGS42194),(ABI97374),(AGW27416),(AFN20600),(ABI97372), and(AGZ95688)

2.3基因的組織表達(dá)分析

利用Real-time PCR分析了脊尾白蝦基因在不同組織中的表達(dá)情況, 發(fā)現(xiàn)基因在多種組織均有表達(dá)。其中, 在肝胰腺中的表達(dá)量最高, 胃、卵巢次之, 在肌肉, 眼柄中的表達(dá)量最少(圖4)。

注射鰻弧菌和WSSV后不同時(shí)間點(diǎn)脊尾白蝦血細(xì)胞中基因的表達(dá)情況使用Real-time PCR檢測(cè)。結(jié)果表明: 鰻弧菌感染組和WSSV感染組基因表達(dá)量都是大于對(duì)照組的。注射后0~12 h鰻弧菌感染組和WSSV感染組基因表達(dá)量都是上升的, 12 h時(shí)表達(dá)量達(dá)到峰值且均顯著高于對(duì)照組(<0.05), 12 h后表達(dá)量開(kāi)始下降, 72 h到達(dá)最低值,且表達(dá)量仍然高于對(duì)照組(<0.05)(圖5)。在0~12 h 鰻弧菌感染組基因表達(dá)量均高于WSSV感染組, 而24~72 h WSSV感染組基因表達(dá)量均高于鰻弧菌感染組。

脊尾白蝦C-型凝集素蛋白用▲標(biāo)注。各物種C-型凝集素序列登錄號(hào)為斑節(jié)對(duì)蝦(ABI97373)、秀麗白蝦(AGZ95688)、擬穴青蟹()(AEO92001)、墨吉對(duì)蝦(AGS42194)、中國(guó)對(duì)蝦(ACJ06429)、中華絨螯蟹()(BAM17746)、凡納濱對(duì)蝦(ABI97374)、短溝對(duì)蝦(ABI97372)、日本對(duì)蝦(AGW27416)、赤點(diǎn)石斑魚()(ACJ12598)、櫛孔扇貝() (ACJ12598)、文昌魚()(ABY54815)、雞()(NP_001026644)、小鼠()(CAC82936)、人()(AAG00514)

is marked with a ▲.The GenBank accession numbers of C-type lectin are as follows:(ABI97373),(AGZ95688),(AEO92001),(AGS42194),(ACJ06429),( BAM17746),(ABI97374),(ABI97372),(AGW27416),(ACJ12598),(ACJ12598),(ABY54815),(NP_001026644),(CAC82936) and(AAG00514)

脊尾白蝦感染鰻弧菌和WSSV后, 肝胰腺中基因的表達(dá)情況如圖6所示。結(jié)果表明: 鰻弧菌感染組基因表達(dá)量于注射后0~6 h上升, 于6 h達(dá)到最高值, 且其表達(dá)量顯著高于對(duì)照組(<0.05); 然后于6~48 h表達(dá)量保持下降趨勢(shì), 并于48 h到達(dá)最低值; 隨后于72 h表達(dá)量略有回升, 表達(dá)量與對(duì)照組相比差異不顯著。而WSSV感染組也保持了相似的變化趨勢(shì)(圖6)。

3 討論與小結(jié)

無(wú)脊椎動(dòng)物機(jī)體缺乏抗體介導(dǎo)的獲得性免疫,C-型凝集素作為先天免疫反應(yīng)中模式識(shí)別受體, 可以在鈣離子存在的條件下識(shí)別并結(jié)合外源微生物表面糖類物質(zhì), 引起一系列免疫反應(yīng), 達(dá)到抵抗病原微生物侵害機(jī)體的目的[4]。本研究克隆得到脊尾白蝦C-型凝集素基因序列, 同其他物種的C-型凝集基因一樣也存在糖識(shí)別結(jié)構(gòu)域(CRD), 目前已報(bào)道的蝦蟹類C-型凝集素都有糖識(shí)別結(jié)構(gòu)域的存在, 如斑節(jié)對(duì)蝦PmAV[15]、凡納濱對(duì)蝦Lvlc2[17]、中國(guó)對(duì)蝦Fclec1[13]中都含有1個(gè)CRD, 而斑節(jié)對(duì)蝦Pmlt[16]、凡納濱對(duì)蝦LvLT[18]、中國(guó)對(duì)蝦Fclectin[14]中含有2個(gè)CRD。本研究獲得的脊尾白蝦EcCTL含有2個(gè)串聯(lián)的CRD結(jié)構(gòu)。根據(jù)結(jié)構(gòu)和糖結(jié)合活性的不同, C-型凝集素可大致分為甘露糖結(jié)合型和半乳糖結(jié)合型兩大類。半乳糖結(jié)合型凝集素對(duì)應(yīng)的糖結(jié)合位點(diǎn)是保守的“QPD”, 可以結(jié)合半乳糖和半乳糖衍生物, 而甘露糖結(jié)合型凝集素的結(jié)合位點(diǎn)是“EPN”, 在低等的無(wú)脊椎動(dòng)物中“EPN”常常被“EPD”、“EPS”替代, 結(jié)合甘露糖與甘露糖的衍生物。凡納濱對(duì)蝦LvLT有兩個(gè)結(jié)合位點(diǎn), 分別是“QPD”和“EPD”而凡納濱對(duì)蝦Lvlc2結(jié)合位點(diǎn)是“EPS”[17], 本研究獲得的脊尾白蝦EcCTL糖結(jié)合位點(diǎn)正是“EPD”, 推測(cè)其為甘露糖型凝集素。

*.同一時(shí)間點(diǎn), 與對(duì)照組相比, 組間差異顯著(0.05), 下同

Compared with the control group, significant differences (0.05) over the same observation period are marked with an asterisk, the same as in the following

系統(tǒng)進(jìn)化樹分析發(fā)現(xiàn), 脊尾白蝦先與同屬白蝦屬的秀麗白蝦聚為一支, 再與其他蝦蟹類聚在一起, 以上結(jié)果證明該序列為脊尾白蝦C-型凝集素基因。搜索NCBI得知中國(guó)對(duì)蝦中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)7種C-型凝集素(AAX63905.1、ABA54612.1、 ACJ06429.1、ACJ06431.1、ACJ06432.1、ACJ06428.1、ACJ06430.1), 凡納濱對(duì)蝦中也有多種C-型凝集素的發(fā)現(xiàn)[17-18], 而本研究?jī)H發(fā)現(xiàn)脊尾白蝦C-型凝集素的一種基因類型, 因此是否存在其他類型還有待進(jìn)一步研究。

脊尾白蝦基因表達(dá)具有組織特異性, 在多種組織中均有表達(dá)。其中, 在肝胰腺中的表達(dá)量最高, 這與中國(guó)對(duì)蝦、凡納濱對(duì)蝦當(dāng)中的研究結(jié)果一致[5, 18], 說(shuō)明肝胰腺是脊尾白蝦基因存儲(chǔ)釋放的主要器官。

三疣梭子蟹重組C-型凝集素對(duì)革蘭氏陰性菌大腸桿菌有明顯凝集作用[6], 凡納濱對(duì)蝦感染溶壁微球菌)和WSSV后C-型凝集素Lvlectin1表達(dá)量明顯上升[19]。凡納濱對(duì)蝦重組LVCTL1可以與WSSV囊膜蛋白結(jié)合, 阻斷WSSV感染[5]。因此C-型凝集素可能在脊尾白蝦對(duì)細(xì)菌和病毒的防御過(guò)程中起到了重要作用。為了研究C-型凝集素在脊尾白蝦非特異性免疫中的作用, 本研究分別使用鰻弧菌和WSSV對(duì)脊尾白蝦進(jìn)行了細(xì)菌和病毒感染實(shí)驗(yàn), 通過(guò)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)在細(xì)菌和病毒感染后的脊尾白蝦血細(xì)胞和肝胰腺中的表達(dá)均有明顯時(shí)間差異性。注射鰻弧菌和WSSV后, 血細(xì)胞當(dāng)中的基因表達(dá)量在12 h達(dá)到峰值, 與對(duì)照組差異顯著(<0.05), 這與中國(guó)對(duì)蝦中的研究結(jié)果一致[20]。感染后12~48 h,表達(dá)量下降, 逐漸恢復(fù)到正常水平, 這與中國(guó)對(duì)蝦注射WSSV后表達(dá)量變化趨勢(shì)一致[20]。注射鰻弧菌和WSSV后, 肝胰腺當(dāng)中的基因表達(dá)量在6 h達(dá)到峰值, 與對(duì)照組差異顯著, 然后呈下降趨勢(shì), 回到正常水平。凡納濱對(duì)蝦注射WSSV后肝胰腺也在6 h達(dá)到峰值, 隨后下降[17], 這一現(xiàn)象可能是參與識(shí)別鰻弧菌和WSSV過(guò)程的表現(xiàn)。

為了研究脊尾白蝦的生物學(xué)功能及其在免疫反應(yīng)中的作用, 本研究成功克隆獲得了脊尾白蝦基因cDNA序列全長(zhǎng), 初步探究了該基因在脊尾白蝦受到鰻弧菌和WSSV感染后血細(xì)胞和肝胰腺中的表達(dá)變化, 證明其確實(shí)參與了脊尾白蝦的免疫應(yīng)答, 結(jié)果將為脊尾白蝦免疫機(jī)制研究和病害防治提供理論依據(jù)。

[1] 牟海津, 江曉路, 劉樹青, 等.雙殼貝類血清中凝集素凝集性能初步研究——對(duì)脊椎動(dòng)物血細(xì)胞的凝集作用[J]. 青島海洋大學(xué)學(xué)報(bào), 1999, 29(2): 249-254. Mou Haijin, Jiang Xiaolu, Liu Shuqing, et al. Properties of hemagglutinins from the serums of shellfishes[J]. Journal of Ocean University of Qingdao, 1999, 29(2): 249-254.

[2] 陳皓文, 孫丕喜. 中國(guó)的來(lái)克丁研究[J]. 廣西科學(xué), 1997, 4(3): 161-169. Chen Haowen, Sun Pixi. Lectin research in China[J]. Guangxi Sciences, 1997, 4(3): 161-169.

[3] 陳浩文, 孫丕喜, 宋慶云. 外源凝集素——水產(chǎn)動(dòng)物御敵的有力兵器[J]. 黃渤海海洋, 1995, 13(3): 61-68. Chen Haowen, Sun Pixi, Song Qingyun. Lectins, a powerful defensive weapon of aquatic animals[J]. Journal of Oceanography of Huanghai & Bohai Seas, 1995, 13(3): 61-68.

[4] 于金紅, 潘魯青. 三疣梭子蟹C-型凝集素的原核表達(dá)和活性檢測(cè)[J]. 漁業(yè)科學(xué)進(jìn)展, 2013, 34(5): 58-63.Yu Jinhong, Pan Luqing. Prokaryotic expression of C-type lectin like-domain protein gene ofand activity analysis of recombinant protein[J]. Progress in Fishery Sciences, 2013, 34(5): 58-63.

[5] Zhao Z Y, Yin Z X, Xu X P, et al. A novel C-type lectin from the shrimppossesses anti-white spot syndrome virus activity[J]. Journal of Virology, 2009, 83(1): 347-356.

[6] Drickamer K, Taylor M E. Biology of animal lectins[J]. Annual Review of Cell Biology, 1993, 9: 237-264.

[7] Ni Y, Tizzard I. Lectin-carbohydrate interaction in the immune system[J].Veterinary Immunology and Immunopathology, 1996, 44: 251-267.

[8] 曹廣力, 朱越雄, 薛仁宇, 等. 中華絨螯蟹血清中外源凝集素的凝集作用及影響因素[J]. 水產(chǎn)養(yǎng)殖, 1999, 5: 16-18. Cao Guangli, Zhu Yuexiong, Xue Renyu, et al. Agglutination and effective elements of bernagglutinin from serum of[J]. Journal of Aquaculture, 1999, 5: 16-18.

[9] 劉瑞玉.中國(guó)北部的經(jīng)濟(jì)蝦類[M]. 北京: 科學(xué)出版社, 1955. Liu Ruiyu. The commercial shrimp in Northern China[M]. Beijing: Science Press, 1955.

[10] 段亞飛, 劉萍, 李吉濤, 等. 脊尾白蝦組織蛋白酶L基因的克隆及其表達(dá)分析[J]. 動(dòng)物學(xué)研究, 2013, 34(1): 39-46. Duan Yafei, Liu Ping, Li Jitao, et al. Cloning and expression analysis of cathepsin L cDNA of[J]. Zoological Research. 2013, 34(1): 39- 46.

[11] 王興強(qiáng), 閻斌倫, 馬甡, 等. 脊尾白蝦生物學(xué)及養(yǎng)殖生態(tài)學(xué)研究進(jìn)展[J]. 齊魯漁業(yè), 2005, 22(8): 21-24. Wang Xingqiang, Yan Binlun, Ma Shen, et al. Study on the biology and cultural ecology of[J]. Shandong Fisheries, 2005, 22(8): 21-24.

[12] 許文軍, 謝建軍, 施慧, 等. 池塘養(yǎng)殖脊尾白蝦()感染血卵渦鞭蟲的研究[J]. 海洋與湖沼, 2010, 41(3): 396-402. Xu Wenjun, Xie Jianjun, Shi Hui, et al. Infection ofsp. in farmed ridgetail white prawn[J]. Oceanologia Et Limnologia Sinica, 2010, 41(3): 396-402.

[13] Sun Y D, Fu L D, Jia Y P, et al. A hepatopancreas-specific C-type lectin from the Chinese shrimpexhibits antimicrobial activity[J]. Molecular Immunology, 2008, 45(2): 348-361.

[14] Liu Y C, Li F H, Dong B, et al. Molecular cloning, characterization and expression analysis of a putative C-type lectin (Fclectin) gene in Chinese shrimp[J]. Molecular Immunology, 2007, 44(4): 598-607.

[15] Luo T, Li F, Lei K, et al. Genomic organization, promoter characterization and expression profiles of an antiviral gene PmAV from the shrimp[J]. Molecular Immunology, 2007, 44(7): 1516- 1523.

[16] Ma T H T, Benzie J A H, He J G, et al. PmLT, a C-type lectin specific to hepatopancreas is involved in the innate defense of the shrimp[J]. Journal of Invertebrate Pathology, 2008, 99(3): 332-341.

[17] 羅展, 張繼泉, 李富花, 等. 凡納濱對(duì)蝦 C-型凝集素 LvLec2 對(duì)不同刺激的免疫應(yīng)答[J]. 海洋科學(xué), 2010, 11: 103-110. Luo Zhan, Zhang Jiquan, Li Fuhua, et al.Cloning of a novel C-type lectin LvLec2 from the shrimpand its immune response to different challenges[J]. Marine Sciences, 2010, 11: 103-110.

[18] Ma T H T, Tiu S H K, He J G, et al. Molecular cloning of a C-type lectin (LvLT) from the shrimp: Early gene down-regulation after WSSV infection[J]. Fish & Shellfish Immunology, 2007, 23(2): 430-437.

[19] Wei X, Liu X, Yang J, et al. Two C-type lectins from shrimpthat might be involved in immune response against bacteria and virus[J]. Fish & Shellfish Immunology, 2012, 32(1): 132-140.

[20] Wang X W, Xu W T, Zhang X W, et al. A C-type lectin is involved in the innate immune response of Chinese white shrimp[J]. Fish & Shellfish Immunology, 2009, 27(4): 556-562.

Cloning and expression analysis of C-type lectin gene of

WANG You-kun1, 3, LIU Ping1, 2, LI Ji-tao1, 2, LI Jian1, 2

(1. Yellow Sea Fisheries Research Institute, Chinese Academy of Fishery Sciences, Key Laboratory of Sustainable Development of Marine Fisheries, Ministry of Agriculture, Qingdao 266071, China; 2. Function Laboratory for Marine Fisheries Science and Food Production Processes, Qingdao National Laboratory for Marine Science and Technology, Qingdao 266071, China; 3. College of Fisheries and Life Science, Shanghai Ocean University, Shanghai 201306, China)

Based on a hemocyte cDNA library ofgenerated in our laboratory, the C-type lectin cDNA of(named) was cloned by rapid amplification of cDNA ends.was 1285-bp long, containing an open reading frame of 1041 bp and encoding a mature protein of 346 amino acids, with a molecular mass of 38.56 kDa. Homology analysis revealed that its amino acid sequence was highly conserved, with homologs in other crustaceans. The degree of similarity ofwith cDNA ofwas 91%.expression levels in different tissues were analyzed using quantitative real-time PCR. Its expression was detected in all tested tissues, including hemocytes, gill, hepatopancreas, muscle, ovary, intestine, stomach, and eyestalk, with the highest expression level in the hepatopancreas. After challenge withand white spot syndrome virus,expression was upregulated in the hemocytes and hepatopancreas. Our results imply thatplays an important role in the immune response in prawns and lays a foundation for studies on theimmune system.

; C-type lectin; gene cloning; gene expression

(本文編輯: 譚雪靜)

[Modern Agro-industry Technology Research System, No. CARS-47; The Program of Shandong Leading Tolent, No. LNJY2015002; National Natural Science Foundation of China, No. 31472275; Scientific and Technological Innovation Project Financially Supported by Qingdao National Laboratory for Marine Science and Technology , No.2015ASKJ02]

Dec. 31, 2014

S917

A

1000-3096(2016)08-0027-08

10.11759/hykx/20141231001

2014-12-31;

2016-06-01

國(guó)家蝦產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系 (CARS-47); 山東省泰山產(chǎn)業(yè)領(lǐng)軍人才工程項(xiàng)目(LNJY2015002); 國(guó)家自然科學(xué)基金(31472275); 青島海洋科學(xué)與技術(shù)國(guó)家實(shí)驗(yàn)室鰲山科技創(chuàng)新計(jì)劃項(xiàng)目(2015ASKJ02)

王有昆(1989-), 女, 山東青島人, 碩士研究生, 主要從事甲殼類分子免疫研究,電話: 15020022778, E-mail: wangyoukun1989@ sina.com; 劉萍, 通信作者, E-mail: liuping@ysfri.ac.cn