2013年-2015年廣西寵物犬流感流行病學(xué)調(diào)查

周華波，趙衛(wèi)鋒，何 平，黃小武，楊文娟，李瑞凱，何劍橋，謝 婷，韋祖樟，黃偉堅(jiān)，陳 櫻*

(1. 廣西大學(xué)動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，廣西南寧 530004；2. 南寧市華波寵物醫(yī)院，廣西南寧 530004；3. 柳州市動物疫病預(yù)防控制中心，廣西柳州 545006；4. 河池市動物疫病預(yù)防控制中心，廣西河池 547000

2013年-2015年廣西寵物犬流感流行病學(xué)調(diào)查

周華波1,2，趙衛(wèi)鋒1，何 平1，黃小武3，楊文娟1，李瑞凱1，何劍橋1，謝 婷4，韋祖樟1，黃偉堅(jiān)1，陳 櫻1*

(1. 廣西大學(xué)動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，廣西南寧 530004；2. 南寧市華波寵物醫(yī)院，廣西南寧 530004；3. 柳州市動物疫病預(yù)防控制中心，廣西柳州 545006；4. 河池市動物疫病預(yù)防控制中心，廣西河池 547000

針對2013年-2015年廣西11個(gè)地級市的寵物犬群進(jìn)行犬流感調(diào)查，發(fā)現(xiàn)欽州犬流感感染的陽性率高達(dá)40%，除百色和玉林外，其余的陽性率在14.29%～34.29%之間，結(jié)果表明犬流感在廣西呈普遍流行態(tài)勢。此外，對不同品種、性別和生長階段的寵物犬感染CIVs進(jìn)行了調(diào)查分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，任何品種和性別的寵物犬都可以感染犬流感病毒，其中青年階段(6月齡～2歲)的犬最為易感。2015年的調(diào)查中，成年犬(2歲～7歲)成為潛在的易感群體。結(jié)果為更好地指導(dǎo)寵物醫(yī)生采取有效的措施控制疾病發(fā)生，從而切斷寵物犬作為中間傳播者的作用，為防控人類大流感的暴發(fā)提供了間接幫助。

寵物犬；犬流感病毒；臨床流行病學(xué)

犬流感(Canine influenza,CI)是由犬流感病毒(Canine influenza virus,CIV)引起的一種急性高度接觸傳染性呼吸道疾病。自從2004年美國佛羅里達(dá)州暴發(fā)H3N8亞型流感病毒感染賽犬事件，該病毒陸續(xù)波及到美國的30個(gè)州，并且通過血清學(xué)調(diào)查表明H3N8亞型病毒不僅感染賽犬，而且可感染寵物犬[1]，“犬流感”的命名由此而產(chǎn)生。隨著社會結(jié)構(gòu)和人們生活方式的改變，健康的生活模式已經(jīng)成為人們的追求方向。寵物作為人類伴侶，它所充當(dāng)?shù)慕巧粌H僅是娛樂，更重要的是從心理和生理上滿足人們對健康模式的需求。當(dāng)前中國寵物犬的數(shù)量已經(jīng)達(dá)到2 290萬只，養(yǎng)狗的家庭占1.7%，是世界第三大寵物國。寵物犬和人類一樣，對流感病毒是易感的，只是它們所感染的毒株與人類有所不同。當(dāng)前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)寵物犬可以感染多種亞型，多種來源的流感病毒，包括禽源H3N2[2]、禽源H5N1[3]、禽源H5N2[4]、禽源H9N2[5]、禽源H10N8[6]和新型重組毒株流感病毒[7-8]。令人關(guān)注的是，通過血清學(xué)調(diào)查和體外試驗(yàn)證實(shí)，犬“承載”多種亞型的人流感，包括季節(jié)性H3N2亞型人流感、B型人流感病毒和2009年H1N1亞型甲型流感病毒[9-11]，這將對人類健康造成潛在的威脅。為了更好的預(yù)防和治療犬流感病毒對寵物犬傷害，杜絕其中間傳播宿主的作用，本研究開展對其臨床流行病學(xué)的調(diào)查研究，全面分析了廣西不同地區(qū)犬流感病毒對不同年齡、不同品種犬的感染和治療情況。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品的來源 2013年-2015年期間，采集廣西11家寵物醫(yī)院臨床門診中疑似呼吸道癥狀的寵物犬鼻拭子共765份，并將所采集樣品進(jìn)行編號，將其品種、性別、年齡、采集時(shí)間、臨床癥狀及其治療情況做了詳細(xì)記錄。采集地包括南寧、玉林、柳州、河池、百色、欽州、梧州、東興、憑祥、桂林和北海等11個(gè)地級市。

1.1.2 主要試劑 細(xì)胞裂解液RNAiso plus、dNTP、AMV反轉(zhuǎn)錄酶、酶抑制劑購自寶生物工程(大連)有限公司；EasyTaqDNA polymerase購自全式金生物公司。

1.2 方法

1.2.1 引物設(shè)計(jì)與合成 根據(jù)GenBank中已知的M基因的保守序列設(shè)計(jì)擴(kuò)增CIV特異片段的鑒定引物。上游引物F：5′-CTTCTAACCGAGGTCGAAACG-3′；下游引物R:5′-AGGG CATTTTGGACAAAKCGTCTA-3′(244 bp)。引物由上海杰李生物技術(shù)有限公司合成。

1.2.2 病料處理 用滅菌棉拭子涂搽有呼吸道癥狀寵物犬的鼻咽部，放入含有適量青、鏈霉素PBS液(pH7.2～7.6)中，漩渦振蕩1 min后棄去棉拭子，8 000 r/min離心5 min，取上清液進(jìn)行檢測，剩余保存于-80℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 RT-PCR鑒定 取200 μL鼻拭子上清液，按照病毒RNA抽提試劑盒說明提取病毒總RNA(Axygen)。用流感病毒反轉(zhuǎn)錄通用引物Uni-12(5′-AGCAAAAGC AGG-3′)，并按照AMV反轉(zhuǎn)錄酶使用說明書進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。25 μL反轉(zhuǎn)錄體系為：5×buffer 5 μL,2.5 mmol/L dNTP mix 2 μL，Uni 12 1 μL，M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶 0.5 μL，RNasin抑制劑 0.5 μL，RNA 16 μL。加完后混勻并低速離心5 s，置PCR儀42℃反轉(zhuǎn)錄1 h。以病毒cDNA為模板，按照以下成分用量配制25 μL反應(yīng)體系：premixTaq12.5 μL，上、下游引物各0.5 μL，H2O 8.5 μL，模板3 μL。置于PCR儀：95℃ 3 min；95℃ 30 s，50℃ 30 s，72℃ 30s，共30個(gè)循環(huán)；最后72℃延伸10 min。待PCR反應(yīng)結(jié)束后，取10 μL PCR產(chǎn)物在10 g/L瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳。設(shè)CIV細(xì)胞毒為陽性對照，ddH2O為陰性對照。

2 結(jié)果

2.1 2013年-2015年廣西寵物CIVs檢測結(jié)果

對2013年-2015年所收集的765份犬鼻拭子進(jìn)行流感病毒M基因特異片段RT-PCR擴(kuò)增，發(fā)現(xiàn)110份鼻拭子擴(kuò)增可得到250 bp左右的特異條帶，與預(yù)期的244 bp相符(圖1)。犬流感樣品陽性率為14.38%，超過10%陽性率的城市有6個(gè)，依次為欽州(40%)、梧州(34.29%)、憑祥(28.57%)、桂林(21.74%)、南寧(16.84%)和東興(14.29%)；在玉林和百色兩地尚未檢測到陽性(圖2)。結(jié)果表明，近幾年來，廣西多個(gè)地級市的CIV持續(xù)感染寵物犬群。

M.DNA標(biāo)準(zhǔn)DL 500; 1～2.樣品RT-PCR產(chǎn)物；3.陽性對照；4.陰性對照

M.DNA Marker DL 500; 1-2.RT-PCR products of samples；3.Positive control; 4.Negative control

圖1 寵物犬鼻拭子樣品的RT-PCR檢測

Fig.1 Detection of nasal swab from pet dogs by RT-PCR

圖2 2013年-2015年廣西區(qū)寵物犬流感病毒檢測結(jié)果

2.2 不同生長階段寵物犬CIV的感染情況

本研究將所采集的鼻拭子按寵物犬群的不同生長階段來劃分，分別為幼年(6個(gè)月齡以下)、青年(6月齡～2歲)、成年(2歲～7歲)和老年(7歲以上)。從寵物犬的品種、性別和生長階段對3年來收集的91份陽性樣品來源進(jìn)行了分析。結(jié)果表明，不同品種、不同性別和不同年齡的寵物犬都可以感染流感病毒，但是感染程度不同，其中土狗感染后表現(xiàn)正常，其他品種(如阿拉斯加、拉布拉多、牧羊犬等)的臨床癥狀表現(xiàn)較為嚴(yán)重。從寵物犬生長階段分析發(fā)現(xiàn)，2013年-2015年間青年時(shí)期的寵物犬對流感病毒最為易感，其次是幼年和老年，2013年和2014年成年犬的感染程度相對較低，但是2015年成年犬的感染程度突然上升至25%(圖3)。

3 討論

隨著社會人口老齡化的進(jìn)一步加劇，伴侶動物在我國越來越普遍，促使了寵物行業(yè)的興起，這將為CIV在人群與寵物群之間進(jìn)行有效傳播提供了時(shí)間和空間條件。因此，加強(qiáng)對寵物犬流感的防控和治療，切斷寵物群將流感病毒擴(kuò)散到人群的中間途徑

圖3 寵物犬不同年齡階段的CIVs感染情況

顯得尤為重要。本研究的病原學(xué)調(diào)查發(fā)現(xiàn)，犬流感在2013年-2015年間在廣西梧州、欽州和憑祥等多個(gè)城市呈地方流行態(tài)勢，但是不排除其他尚未采樣的城市也存在犬流感流行，尤其是犬貓疫苗普及率相對比較低的小縣城和鄉(xiāng)村，值得進(jìn)一步調(diào)查了解。 臨床調(diào)查發(fā)現(xiàn)，不同生長階段犬群的CIV感染以幼年和青年犬群為主。原因分析可能有以下四方面：①幼犬期間常規(guī)傳染病(犬瘟熱，細(xì)小病毒病，冠狀病毒感染，腺病毒感染等)免疫失敗，動物整體免疫力不高，特別是當(dāng)母源抗體逐漸下降，因此容易患犬流感；②飼養(yǎng)管理不當(dāng)，比如食物和環(huán)境改變等應(yīng)激因素的影響，導(dǎo)致其更容易患“感冒”或者繼發(fā)其他感染；③接觸患病寵物，或者寵物主人患感冒，間接傳染給寵物；④青年犬有一定的抵抗力，即使感染CIV，也表現(xiàn)癥狀溫和，經(jīng)過治療容易耐過，是病毒攜帶者或者主要潛伏群體。2015年調(diào)查發(fā)現(xiàn)，感染范圍擴(kuò)散到成年犬，犬感染率高達(dá)25%，病毒的進(jìn)一步分離鑒定發(fā)現(xiàn)當(dāng)前流感發(fā)生多樣化重組，特別是與2009年甲型流感重組為新型流感病毒(數(shù)據(jù)未出示)，推斷該新型病毒可能危害性更大。為了防護(hù)寵物犬免受病毒侵襲，我們應(yīng)當(dāng)在秋冬或者冬春交換季節(jié)，及時(shí)保溫、提高幼犬的免疫能力、改善寵物的生活環(huán)境和衛(wèi)生狀況等措施。對于患病的犬只，良好的護(hù)理，并在此基礎(chǔ)上進(jìn)行整體治療，根據(jù)病犬的具體病況對癥下藥是治療病犬的最佳方案。目前，美國已經(jīng)批準(zhǔn)使用H3N8亞型犬流感滅活疫苗，用于犬流感的免疫預(yù)防，但是中國目前尚未使用任何犬流感疫苗。因此，制備一種安全有效、可對多種亞型流感病毒有交叉保護(hù)的犬流感疫苗將成為重要的研究課題。

綜上所述，犬流感已在廣西大部分地區(qū)呈地方流行，雖然臨床上犬流感感染的癥狀較為溫和，有些甚至并未出現(xiàn)較為明顯的呼吸道癥狀，但是寵物犬與人類之間密不可分的關(guān)系，讓我們不得不重視它在人與犬傳播中的重要性。寵物醫(yī)生在臨床上及時(shí)的發(fā)現(xiàn)、確診和治療，并將主人發(fā)病的相關(guān)信息做好詳細(xì)記錄，將為研究跨宿主傳播提供最有價(jià)值的資料。此外，寵物犬可作為“哨崗”來監(jiān)測人流感的暴發(fā)，這在人類公共衛(wèi)生方面具有重大意義。

致謝:本研究是柳州市魚峰區(qū)華波寵物診療中心、南寧市華波寵物醫(yī)院和廣西大學(xué)預(yù)防獸醫(yī)教研室共同努力完成。所得到的疑似呼吸道癥狀寵物犬鼻拭子樣品均由柳州市華波寵物診療中心、南寧市華波寵物醫(yī)院、南寧市惠康寵物診所、梧州市玫瑰湖寵物店、北海市陸浩動物診所、東興市思維寵物、玉菊寵物診所、南寧市十二叔寵物醫(yī)院、玉林市101寵物醫(yī)院、河池市動物疫病控制中心、南寧市小寶寵物醫(yī)院、桂林名寵寵物醫(yī)療養(yǎng)護(hù)中心、欽州市寵樂康動物診所、柳州至誠至寵寵物診療中心等11家寵物醫(yī)院負(fù)責(zé)采集，在此一并致以衷心的感謝！

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Clinical Epidemiological Investigation of Canine Influenza in Guangxi from 2013 to 2015

ZHOU Hua-bo1,2, ZHAO Wei-feng1, HE Ping1, HUANG Xiao-wu3, YANG Wen-juan1, LI Rui-kai1, HE Jian-qiao1, XIE Ting4, WEI Zu-zhang1, HUANG Wei-jiang1, CHEN Ying1

(1.CollegeofAnimalScienceandTechnology,GuangxiUniversity,Nanning，Guangxi，530004，China; 2.HuaboPetHospital,Nanning,Guangxi，530004,China; 3.LiuzhouAnimalDiseasePreventionandControlCenter,Liuzhou,Guangxi,545006,China; 4.HechiAnimalDiseasePreventionandControlCenter,Hechi,Guangxi,547000,China)

In this study, the infection of canine influenza virus(CIV) in pet dogs from 11 cities of Guangxi were investigated from 2013 to 2015.It was found that the highest positive infection happened in Qinzhou which reached to 40%.Except for Baise and Yulin,the positive rates of the other cities ranged from 14.29% to 34.29%.Results showed that CIVs in pet dogs were common and endemic in Guangxi.Besides,the investigation for different species,gender and ages of pet dogs found that every kinds of pet dogs could be infected with CIVs.Pet dogs in youth phage(6 months-2 years old) were susceptible,the adult dogs(2-7 years old) also became potential susceptible population in 2015.Through the investigation of infection of CIVs,combined with clinical symptoms,it was better to guide the pet doctor to control the disease by effective measures and cut off the mediated ways of the transmission of influenza virus which will provide indirect help to prevent the outbreak of human pandemics.

pet dog; canine influenza virus; clinical epidemiology

2015-11-05

廣西教育廳高校科學(xué)技術(shù)研究項(xiàng)目(YB2014005)；廣西大學(xué)科研基金項(xiàng)目(XJZ140236)；廣西自然科學(xué)基金回國項(xiàng)目(2015GXNSFCA139002);廣西大學(xué)博士啟動項(xiàng)目(XBZ160123)

周華波(1978-)，男，廣西岑溪人，執(zhí)業(yè)獸醫(yī)師，碩士，主要從事寵物臨床工作。*通訊作者

S852.655

B

1007-5038(2016)05-0122-04