豬瘟病毒E0蛋白的原核表達(dá)及多克隆抗體的制備

賈俊杰，張必凱，張 莉，謝金鑫，郭煥成，龔文杰，涂長(zhǎng)春

(軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院 軍事獸醫(yī)研究所，吉林省人獸共患病預(yù)防與控制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，吉林長(zhǎng)春 130122)

豬瘟病毒E0蛋白的原核表達(dá)及多克隆抗體的制備

賈俊杰，張必凱，張 莉，謝金鑫，郭煥成，龔文杰*，涂長(zhǎng)春

(軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院 軍事獸醫(yī)研究所，吉林省人獸共患病預(yù)防與控制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，吉林長(zhǎng)春 130122)

為表達(dá)豬瘟病毒E0蛋白并制備其多克隆抗體，本研究構(gòu)建E0蛋白的原核表達(dá)載體，轉(zhuǎn)化至BL21(DE3)菌株，IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，親和層析及切膠回收純化重組蛋白。SDS-PAGE和Western blot分析顯示E0重組蛋白主要以包涵體形式表達(dá)，親和層析純化獲得了E0重組蛋白，用其免疫Balb/c小鼠4次制備E0重組蛋白的多克隆抗體。間接ELISA顯示，免疫小鼠血清中E0蛋白抗體效價(jià)為1∶50 000。獲得的E0蛋白多抗能與病毒感染細(xì)胞及E0-EGFP融合表達(dá)細(xì)胞中天然結(jié)構(gòu)的E0蛋白發(fā)生特異性反應(yīng)。本研究制備的E0重組蛋白及其多克隆抗體為進(jìn)一步研究E0蛋白的功能和免疫原性奠定了基礎(chǔ)。

豬瘟病毒；E0蛋白；原核表達(dá)；多克隆抗體

豬瘟(Classical swine fever，CSF)是由豬瘟病毒(Classical swine fever virus，CSFV)引起的以免疫抑制和高病死率為主要特征的急性熱性傳染病。CSFV為黃病毒科(Flaviviridae)瘟病毒屬(Pestivirus)成員,為單股正鏈RNA病毒。病毒全基因組大小為12.3 kb，由5′端和3′端的非編碼區(qū)以及一個(gè)大的開放性閱讀框ORF組成，其編碼一個(gè)由3 898個(gè)氨基酸組成的多聚蛋白。多聚蛋白在病毒蛋白酶和宿主細(xì)胞酶的作用下被加工產(chǎn)生12個(gè)成熟蛋白，從N端至C端依次為Npro、C、Erns(E0)、E1、E2、p7、NS2、NS3、NS4A、NS4B、NS5A和NS5B[1]。

豬瘟病毒囊膜蛋白Erns(E0)為瘟病毒屬成員所特有，是形成感染性病毒粒子的必需組成部分，在病毒感染和致病過(guò)程中發(fā)揮重要功能。E0蛋白具有RNase 活性，屬于T2 RNase 家族，能水解雙鏈RNA阻止其誘導(dǎo)產(chǎn)生干擾素，從而抑制宿主的天然抗病毒免疫反應(yīng)[2]。據(jù)報(bào)道，昆蟲細(xì)胞表達(dá)的E0 蛋白在體外可以誘導(dǎo)多種哺乳動(dòng)物淋巴細(xì)胞發(fā)生凋亡[3]。E0 蛋白與細(xì)胞膜上層黏連蛋白結(jié)合以介導(dǎo)病毒吸附細(xì)胞[4]。此外，E0 和E2是能夠誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生中和抗體的保護(hù)性抗原蛋白，作為基因工程疫苗和診斷試劑，重組表達(dá)E0和E2蛋白，不僅能克服弱毒疫苗的不足，而且很容易用血清學(xué)方法鑒別疫苗免疫和野毒感染動(dòng)物[5-6]。為此，本研究利用大腸埃希菌原核表達(dá)系統(tǒng)成功表達(dá)、純化獲得了具有良好反應(yīng)原性的E0重組蛋白，將其免疫小鼠獲得了高效價(jià)的多克隆抗體。制備的E0重組蛋白及其多克隆抗體將有助于CSFV抗體檢測(cè)、蛋白功能和免疫原性等相關(guān)研究。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 病毒、菌株和質(zhì)粒 CSFV石門株血毒、豬抗CSFV高免血清和pET-28a(+)質(zhì)粒由軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院軍事獸醫(yī)研究所動(dòng)物病毒學(xué)與人獸共患病防控實(shí)驗(yàn)室保存；穩(wěn)定表達(dá)EGFP和E0-EGFP融合蛋白的豬睪丸(swine testicle，ST)細(xì)胞系ST-EGFP和ST-E0-EGFP由軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院軍事獸醫(yī)研究所動(dòng)物病毒學(xué)與人獸共患病防控實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建保存；E.coliDH5α和 BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞均購(gòu)自天根生化科技(北京)有限公司。

1.1.2 主要試劑 Fast HiFidelity PCR Kit購(gòu)自天根生化科技(北京)有限公司；RNAiso Plus、Reverse Transcriptase M-MLV、限制性內(nèi)切酶BamHⅠ、NotⅠ和IPTG均購(gòu)自TaKaRa公司；T4 DNA ligase購(gòu)自Thermo公司；膠回收試劑盒和質(zhì)粒提取試劑盒均購(gòu)自Axygen公司； Ni-NTA His-Bind Resin購(gòu)自Novegen公司；抗6×His標(biāo)簽蛋白單克隆抗體和抗GFP單克隆抗體購(gòu)自 Santacruz公司；弗氏完全佐劑和弗氏不完全佐劑均購(gòu)自Sigma公司；HRP標(biāo)記山羊抗鼠IgG(H+L)購(gòu)自Beyotime公司；HRP標(biāo)記兔抗豬IgG(H+L)購(gòu)自博奧森公司；FITC標(biāo)記的驢抗鼠IgG(H+L)、Alexa Fluor 680標(biāo)記驢抗小鼠IgG(H+L)均購(gòu)自Life technologies公司。

1.2 方法

1.2.1 原核表達(dá)載體的構(gòu)建 Trizol法提取CSFV石門株血毒總RNA，反轉(zhuǎn)錄獲得病毒基因組cDNA。根據(jù)GenBank收錄的CSFV 石門株全基因序列(GenBank登陸號(hào)：AF092448.2)設(shè)計(jì)一對(duì)特異性引物，上、下游引物分別為SM-E0-FP:5′-CGGGATCCGAAAATATAACTCAATG-3′,SM-E0-RP:5′-ATAAGAATGCGCCGCTTAGGCATAGGCACCAAACCAG-3′，引物序列下劃線部分分別為BamHⅠ和NotⅠ酶切位點(diǎn)。 以病毒基因組cDNA為模板，以SM-E0-FP和SM-E0-RP分別為上、下游引物，特異性擴(kuò)增E0基因片段，獲得的PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳分析，切膠回收DNA片段。純化的DNA片段與pET-28a載體分別用BamHⅠ和NotⅠ進(jìn)行雙酶切，切膠純化酶切處理的E0基因片段和線性化載體片段，利用T4 DNA Ligase將E0基因片段連接至pET-28a(+)載體上，轉(zhuǎn)化至DH5α感受態(tài)細(xì)胞，涂布于含有50 μg/mL卡那霉素瓊脂平板進(jìn)行克隆篩選。經(jīng)PCR鑒定為陽(yáng)性的菌落，提取重組質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切鑒定后，送至吉林庫(kù)美生物科技有限公司進(jìn)行序列分析，測(cè)序正確的重組質(zhì)粒命名為pET-SM-E0。

1.2.2 E0重組蛋白的原核表達(dá)、純化及鑒定 將重組質(zhì)粒pET-SM-E0和空載體質(zhì)粒pET-28a轉(zhuǎn)化至BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞，然后進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)。將過(guò)夜培養(yǎng)的菌液，以1∶100比例接種至新鮮培養(yǎng)基中，37℃、200 r/min振蕩培養(yǎng)，待菌液OD600達(dá)到0.6時(shí)，加入終濃度為1 mmol/L的IPTG繼續(xù)培養(yǎng)4 h后收集菌體，以空載體pET-28a/BL21(DE3)菌和未經(jīng)IPTG誘導(dǎo)的重組菌分別作為空白對(duì)照和陰性對(duì)照。超聲破碎誘導(dǎo)表達(dá)的重組菌體，10 000 r/min離心15 min，收集上清液，沉淀依次用20 g/L脫氧膽酸鈉溶液、2 mol/L尿素溶液洗滌，8 mol/L尿素溶液溶解獲得包涵體蛋白。按照Ni-NTA His-Bind Resin說(shuō)明，鎳柱親和層析純化E0-His重組蛋白，再利用切膠回收方法進(jìn)一步純化蛋白[7]。Bradford法測(cè)定獲得的重組E0蛋白的濃度。蛋白各組分進(jìn)行SDS-PAGE，考馬斯亮藍(lán)染色后分析重組蛋白的表達(dá)和純化效果。此外，將空載體菌和誘導(dǎo)重組菌裂解液進(jìn)行Western blot分析，即SDS-PAGE分離全菌蛋白，轉(zhuǎn)印至硝酸纖維素膜(nitrocellulose mem-brane，NC)，室溫封閉2 h，小鼠抗6×His標(biāo)簽蛋白單克隆抗體稀釋液室溫孵育2 h。PBST洗滌3次，再與Alexa Fluor 680標(biāo)記驢抗小鼠IgG(H+L)稀釋液室溫孵育1 h，PBST洗滌3次，Odyssey紅外線成像系統(tǒng)掃描NC膜。同時(shí)對(duì)純化的重組蛋白以豬抗CSFV高免血清為一抗進(jìn)行Western blot分析。

1.2.3 多克隆抗體的制備 將純化的E0重組蛋白與弗氏完全佐劑等體積乳化后免疫小鼠；蛋白溶液與弗氏不完全佐劑等體積乳化對(duì)小鼠二免、三免和加強(qiáng)免疫。選取3只Balb/c小鼠，前3次免疫劑量為50 μg/只，采取多點(diǎn)皮下注射免疫，每次免疫間隔1周；第3次免疫后第7天以100 μg/只劑量加強(qiáng)免疫，同時(shí)設(shè)置3只未免疫小鼠為陰性對(duì)照。心臟采血，收集血清，間接ELISA方法測(cè)定小鼠血清抗體效價(jià)，即將重組蛋白以100 ng/孔包被至96孔板，50 g/L脫脂奶粉37 ℃封閉1 h；將待檢血清分別以1∶500、1∶1 000、1∶5 000、1∶10 000、1∶50 000、1∶100 000倍稀釋后加入包被好的板孔中，陰性血清做對(duì)照， 37 ℃孵育1 h；PBST洗滌3次，HRP標(biāo)記的山羊抗鼠IgG(H+L)稀釋液37 ℃孵育1 h；PBST洗滌3次，加入新鮮配制的TMB-H2O2底物顯色液，避光室溫孵育10 min；加入200 mL/L濃硫酸終止反應(yīng)；酶標(biāo)儀檢測(cè)450 nm波長(zhǎng)處OD值。試驗(yàn)組數(shù)據(jù)與對(duì)照組數(shù)據(jù)比值(P/N)大于2.1時(shí)判定為陽(yáng)性。

1.2.4 多克隆抗體評(píng)價(jià)

1.2.4.1 多克隆抗體的Western blot檢測(cè) 分別收集ST-E0-EGFP和ST-EGFP細(xì)胞的裂解液，Bradford法測(cè)定胞漿蛋白濃度，各上樣 20 μg進(jìn)行SDS-PAGE，轉(zhuǎn)印至NC膜，室溫封閉2 h，與1∶500稀釋的小鼠抗E0 pAb 室溫孵育3 h，PBST洗滌3次，然后再與紅外標(biāo)記驢抗小鼠IgG(H+L)稀釋液室溫孵育1 h，PBST洗滌3次，Odyssey紅外線成像系統(tǒng)掃描NC膜。同時(shí)以1∶200稀釋的鼠抗GFP mAb稀釋液作為一抗陽(yáng)性對(duì)照。

1.2.4.2 多克隆抗體的IFA檢測(cè) 將CSFV石門血毒以病毒感染復(fù)數(shù)(multiplicity of infection，MOI)為1的比例接種ST細(xì)胞，未接毒細(xì)胞做陰性對(duì)照。ST細(xì)胞接毒后48 h，40 g/L多聚甲醛固定，與1∶500稀釋的小鼠抗E0 pAb于37℃孵育1 h，PBST洗滌3次，然后再與1∶200稀釋的FITC標(biāo)記的驢抗小鼠IgG(H+L)于37℃孵育1 h，PBST洗滌3次，熒光顯微鏡觀察結(jié)果。

2 結(jié)果

2.1 E0蛋白原核表達(dá)載體的構(gòu)建

以豬瘟病毒石門株基因組cDNA為模板， PCR擴(kuò)增獲得了681 bp的編碼E0蛋白的基因片段，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)BamHⅠ和NotⅠ酶切后連接至pET-28a(+)載體。重組表達(dá)質(zhì)粒雙酶切鑒定表明E0基因成功克隆至原核表達(dá)載體pET-28a(+)(圖1)，重組質(zhì)粒測(cè)序與參考序列完全一致。

M.DNA標(biāo)準(zhǔn)DL 15 000；1.質(zhì)粒pET-SM-E0雙酶切產(chǎn)物；2.質(zhì)粒pET-28a雙酶切產(chǎn)物

M.DNA Marker DL 15 000; 1.Plasmid pET-SM-E0 digested byBamHⅠ andNotⅠ;2.Plasmid pET-28a digested byBamHⅠ andNotⅠ

圖1 重組表達(dá)質(zhì)粒的雙酶切鑒定

Fig.1 Identification of recombinant expression plasmid byBamHⅠ andNotⅠ digestion

2.2 E0重組蛋白的表達(dá)、純化及Western blot鑒定

將重組菌株pET-SM-E0/BL21(DE3)誘導(dǎo)表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行包涵體洗滌、鎳柱親和層析和切膠純化回收。SDS-PAGE結(jié)果顯示，在約28 ku處有一條

明顯誘導(dǎo)表達(dá)的蛋白條帶，與E0重組蛋白預(yù)期大小一致，且重組蛋白主要以包涵體形式存在，經(jīng)親和層析和切膠回收獲得了高純度的重組蛋白(圖2)?；谛∈罂?×His蛋白單克隆抗體的Western blot檢測(cè)進(jìn)一步表明重組蛋白E0-His誘導(dǎo)表達(dá)成功(圖3A)。同時(shí)以豬抗CSFV陽(yáng)性血清對(duì)純化的E0蛋白進(jìn)行Western blot分析，結(jié)果表明E0蛋白能與CSFV陽(yáng)性血清發(fā)生特異性反應(yīng)(圖3B)。

M.蛋白分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1.未誘導(dǎo)空載體菌體；2.未誘導(dǎo)重組菌體；3.IPTG誘導(dǎo)重組菌體；4.超聲處理IPTG誘導(dǎo)重組菌體的上清；5.超聲處理IPTG誘導(dǎo)重組菌體的沉淀；6.親和層析純化重組蛋白；7.切膠回收重組蛋白

M. Protein molecular weight Marker; 1. Lysate of pET-28a/BL21(DE3); 2.Lysate of pET-SM-E0/BL21(DE3); 3.Lysate of pET-SM-E0/(DE3) induced by IPTG; 4. Ultrasonec suspernatant of pET-SM-E0/(DE3) induced by IPTG; 5. Ultrasonec precipitate of pET-SM-E0/(DE3) induced by IPTG; 6.E0-His purified by affinity chromatography; 7.E0-His purified by gel slice

圖2 原核表達(dá)和純化重組E0蛋白的SDS-PAGE檢測(cè)

Fig.2 Analysis of expression and purification of recombinant protein E0 by SDS-PAGE

A.6×His標(biāo)簽單克隆抗體Western blot檢測(cè)重組蛋白E0；M.蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn); 1.未誘導(dǎo)空載體菌體；2.IPTG誘導(dǎo)重組菌體

B.豬瘟病毒陽(yáng)性血清Western blot檢測(cè)重組蛋白E0；M.蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn); 1.純化重組蛋白E0

A.Detection of recombinant protein E0 with 6×His tag mAb by Western blot; M. Protein molecular weight Marker; 1.Lysate of pET-28a/ BL21(DE3); 2. Lysate of pET-SM-E0/ BL21(DE3) induced by IPTG

B. Detection of recombinant protein E0 with positive serum against CSFV by Western blot; M. Protein molecular weight Marker; 1.Purified recombinant protein E0

圖3 重組E0蛋白的Western blot鑒定

Fig.3 Identification of recombinant E0 protein by Western blot

2.3 抗E0蛋白多克隆抗體效價(jià)測(cè)定

間接ELISA方法檢測(cè)小鼠血清抗體效價(jià)，以空白對(duì)照組小鼠血清為陰性對(duì)照，結(jié)果顯示小鼠血清抗體效價(jià)為1∶50 000(表1)。

表1 小鼠血清抗體效價(jià)間接ELISA檢測(cè)結(jié)果

Table 1 Mouse antiserum titer detected by indirect ELISA

血清稀釋倍數(shù)Dilutionofserum免疫組Immunizationgroup陰性對(duì)照組Negativecontrolgroup試驗(yàn)數(shù)據(jù)/陰性對(duì)照P/N1:5003.185±0.2350.372±0.0469.561:10002.835±0.1870.297±0.0219.5451:50001.724±0.1490.194±0.0167.8871:100001.286±0.1610.135±0.0188.5351:500000.336±0.0410.074±0.0144.541:1000000.104±0.0120.062±0.0151.63

2.4 抗E0蛋白多克隆抗體評(píng)價(jià)

2.4.1 Western blot分析結(jié)果 以ST-EGFP和ST-C-E0細(xì)胞總蛋白為抗原，以抗GFP 單克隆抗體為一抗進(jìn)行Western blot鑒定，結(jié)果顯示E0-EGFP融合蛋白分子質(zhì)量約72 ku、51 ku，與預(yù)期結(jié)果一致，表明ST-C-E0細(xì)胞系成功表達(dá)了E0蛋白(圖4 A)；以抗E0 蛋白多克隆抗體為一抗進(jìn)行Western blot鑒定，結(jié)果顯示抗E0 蛋白多克隆抗體能與ST細(xì)胞表達(dá)的E0蛋白發(fā)生反應(yīng)(圖4B)，表明該多克隆抗體具有良好的反應(yīng)性。

2.4.2 IFA檢測(cè)結(jié)果 以感染和未感染CSFV石門株的ST細(xì)胞分別進(jìn)行IFA檢測(cè)，結(jié)果顯示，接種CSFV的細(xì)胞可見(jiàn)明顯的熒光，而未接種病毒的細(xì)胞未見(jiàn)熒光(圖5)，說(shuō)明小鼠多抗血清能識(shí)別天然構(gòu)象的E0蛋白。

A. 抗GFP單克隆抗體檢測(cè)；B.抗E0多克隆抗體檢測(cè)M. 蛋白分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1.ST-EGFP細(xì)胞裂解液；2.ST-E0-EGFP細(xì)胞裂解液A. Detection of E0-EGFP with anti-GFP mAb; B.Detection of E0-EGFP with anti-E0 pAbM. Protein molecular weight Marker； 1.Lysate of ST-EGFP cells；2.Lysate of ST-E0-EGFP cells

A.多克隆抗體與豬瘟病毒感染的ST細(xì)胞反應(yīng)；B.多克隆抗體與未感染的ST細(xì)胞反應(yīng)A.pAb reacted with ST cells infected with CSFV; B.pAb reacted with uninfected ST cells

3 討論

E0蛋白是CSFV重要的結(jié)構(gòu)蛋白，由227個(gè)氨基酸組成，糖基化后分子質(zhì)量增加一半，形成分子質(zhì)量約為96 ku的由二硫鍵連接的同源二聚體[8]。在CSFV培養(yǎng)的細(xì)胞上清液中能檢測(cè)到大量E0蛋白[9]。E0蛋白在CSFV導(dǎo)致動(dòng)物免疫抑制過(guò)程中發(fā)揮重要作用，其RNase活性影響宿主細(xì)胞中病毒RNA的復(fù)制，并抑制動(dòng)物感染早期防御作用，對(duì)淋巴細(xì)胞和上皮細(xì)胞有直接細(xì)胞毒性[10]。近年來(lái)，豬瘟流行特點(diǎn)發(fā)生重大變化，呈無(wú)規(guī)律的散發(fā)性流行，出現(xiàn)溫和型發(fā)病和持續(xù)性感染，許多豬場(chǎng)的免疫豬群頻繁發(fā)病，部分豬場(chǎng)甚至將疫苗劑量加大數(shù)倍，疫情仍然不能完全控制[11]。E0和E2是病毒誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生中和抗體的2個(gè)主要保護(hù)性抗原，產(chǎn)生的中和抗體可抵抗致死劑量CSFV的攻擊，E2蛋白亞單位疫苗得到廣泛應(yīng)用，E0蛋白作為診斷試劑進(jìn)行CSFV血清學(xué)檢測(cè)，能鑒別疫苗免疫和流行毒株感染，對(duì)于監(jiān)測(cè)CSFV的流行情況、疫苗免疫情況及制定免疫程序具有重要意義[12-14]。目前針對(duì)E0的CSFV 特異性單克隆抗體,均不能與所有CSFV毒株發(fā)生反應(yīng)，提示E0蛋白中可能缺乏保守的CSFV特異性抗原表位[15]。因此，制備多克隆抗體對(duì)CSFV不同毒株E0蛋白相關(guān)研究具有重要作用。目前，國(guó)內(nèi)學(xué)者已開展較多E0蛋白體外克隆與表達(dá)的相關(guān)研究，郭東光、李鵬等均在大腸埃希菌中表達(dá)了CSFV E0重組蛋白，但存在表達(dá)量低和純化效果不理想等問(wèn)題[16-17]，同時(shí)未對(duì)抗E0蛋白多克隆抗體展開相關(guān)研究。

本研究構(gòu)建的重組表達(dá)了載體pET-SM-E0在大腸埃希菌BL21(DE3)菌株中高效表達(dá)了重組E0蛋白，其主要以包涵體形式表達(dá)；通過(guò)親和層析和切膠回收純化獲得了高純度重組蛋白E0，純化的蛋白能與CSFV高免血清特異性反應(yīng)；重組蛋白免疫小鼠制備的抗E0蛋白多克隆抗體，能與天然構(gòu)象的E0蛋白特異性反應(yīng)。制備的重組蛋白E0及其多克隆抗體為E0蛋白功能、免疫原性研究以及CSFV抗體檢測(cè)試劑盒研制奠定了基礎(chǔ)。

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Prokaryotic Expression of E0 Protein of Classical Swine Fever Virus and Preparation of Its Polyclonal Antibodies

JIA Jun-jie,ZHANG Bi-kai,ZHANG Li,XIE Jin-xing,GUO Huan-cheng,GONG Wen-jie,TU Chang-chun

(KeyLaboratoryofJilinProvinceforZoonosisPreventionandControl,InstituteofMilitaryVeterinaryMedicine,AcademyofMilitaryMedicalSciences,Changchun，Jilin,130122,China)

To express E0 protein of CSFV and prepare its polyclonal antibodies (pAb),the recombinant E0 protein of CSFV Shimen strain was expressed inE.coliBL21(DE3) with IPTG induction and successively purified by affinity chromatography and gel slice. Balb/c mice were immunized four times with the purified recombinant E0 protein. SDS-PAGE and Western blot analysis showed that recombinant protein was expressed mainly in the inclusion body.The indirect ELISA showed that the antibody titers in the serum of immunized mice was at 1:50000.Moreover,the obtained anti-E0 pAb can specifically react with the E0 protein expressed in virus-infected cells and E0-EGFP-expressing cells.The obtained E0 protein and its polyclonal antibodies in this study will be useful for future studies on the function and immunogenicity of CSFV E0 protein.

Classical swine fever virus; prokaryotic expression; E0 protein; polyclonal antibody

2015-11-23

中國(guó)博士后科學(xué)基金項(xiàng)目(2013M532129)； 國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(31130052；31572528)

賈俊杰(1989-)，男，重慶人，碩士研究生，主要從事豬瘟致病機(jī)制研究。*通訊作者

S852.651

A

1007-5038(2016)05-0005-06