sifA基因缺失沙門菌增強(qiáng)巨噬細(xì)胞炎性體活化研究

宋佩烜，胡桂秋，秦曉霞，雷倩倩，馮世源，戚 帥，李坤瑀，杜崇濤，楊勇軍，陳 巍

(吉林大學(xué)動物醫(yī)學(xué)學(xué)院，吉林長春 130062)

研究論文

sifA基因缺失沙門菌增強(qiáng)巨噬細(xì)胞炎性體活化研究

宋佩烜，胡桂秋，秦曉霞，雷倩倩，馮世源，戚 帥，李坤瑀，杜崇濤，楊勇軍*，陳 巍

(吉林大學(xué)動物醫(yī)學(xué)學(xué)院，吉林長春 130062)

利用 λRed 重組系統(tǒng)敲除鼠傷寒沙門菌SL1344的sifA基因以獲取△sifA沙門菌。無菌分離培養(yǎng)小鼠骨髓來源巨噬細(xì)胞，分別用SL1344沙門菌及△sifA沙門菌刺激細(xì)胞，Western blot、ELISA及LDH釋放檢測方法檢測IL-1β分泌, caspase-1表達(dá)及LDH的釋放。結(jié)果表明，△sifA沙門菌促進(jìn)IL-1β分泌、caspase-1表達(dá)增強(qiáng)、LDH釋放量增多，即△sifA沙門菌增強(qiáng)炎性體活化。

沙門菌；sifA；基因敲除；炎性小體；增強(qiáng)； 巨噬細(xì)胞

沙門菌(Salmonella)是流行最為廣泛的病原菌之一，嚴(yán)重危害畜禽和人類健康。沙門菌屬有2 500多個血清型，依據(jù)其宿主譜分為泛嗜性、偏嗜性和專嗜性沙門菌[1]。由于沒有合適的傷寒沙門菌易感動物作為研究模型，多以鼠傷寒沙門菌探討其致病機(jī)理[2]。鼠傷寒沙門菌為泛嗜性腸道致病菌，具有廣泛宿主譜，能導(dǎo)致各種家畜、家禽、野生動物及人的沙門菌病，對于幼畜或新生兒等免疫缺陷或低下動物和人群甚至能引起死亡[3]。

炎性體是由模式識別受體(pattern recognition receptor，PRR)、胱冬肽酶-1(caspase-1)前體以及凋亡相關(guān)微粒蛋白(apoptosis-associated speck-like protein containing CARD，ASC)組成的多蛋白復(fù)合體，募集的caspase-1前體發(fā)生多聚化并水解為活化形式，能夠通過caspase-1的半胱天冬酶活性酶切IL-1β和IL-18前體。IL-1β和IL-18作為促炎細(xì)胞因子介導(dǎo)局部或系統(tǒng)免疫反應(yīng)，是天然免疫系統(tǒng)抵御病原侵襲的重要組成部分[4-5]。 研究表明，沙門菌能夠被NOD樣受體(NOD-like receptor，NLR)家族蛋白的NLRP3和NLRC4識別，激活NLRP3和NLRC4炎性體，誘導(dǎo)IL-1β的分泌，并且NLRP3與NLRC4所識別的沙門菌配體有所不同。由此，我們通過λ-red重組系統(tǒng)構(gòu)建缺失sifA相關(guān)基因的缺失株[6]，并研究sifA蛋白在沙門菌感染機(jī)體產(chǎn)生炎性體的免疫過程中的作用，為深入研究sifA相關(guān)功能提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

鼠傷寒沙門菌SL1344(Salmonellaentericasubsp.entericaserovar.typhimuriumSL1344)，λ-red重組系統(tǒng)質(zhì)粒pKD46,pKD3，pCP20等均由本實驗室保存。TaqDNA聚合酶、高保真DNA聚合酶、dNTPs、DNA marker、凝膠回收試劑盒及細(xì)菌質(zhì)粒提取試劑盒，購自寶生物工程(大連)有限公司；PCR引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成(表1)；anti-caspase-1、anti-IL-1β、anti-rabbit IgG-HRP抗體，購自Santa Cruz公司；mouse IL-1β ELISA試劑盒，購自R&D公司；mouse LDH試劑盒，購自Progema公司。其他常規(guī)試劑均為國產(chǎn)或進(jìn)口分析純產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 sifA基因缺失鼠傷寒沙門菌的構(gòu)建 用λ-red重組系統(tǒng)構(gòu)建缺失株，電轉(zhuǎn)pKD46質(zhì)粒進(jìn)入SL1344菌株中，用阿拉伯糖刺激后制備SL1344+pKD46 感受態(tài)，電轉(zhuǎn)含同源臂與氯霉素抗性的線性PCR產(chǎn)物進(jìn)入重組菌株，鑒定重組后電轉(zhuǎn) pCP20質(zhì)粒到重組菌株SL1344+cm+感受態(tài)中，42℃培養(yǎng)消除氯霉素抗性，獲得重組鼠傷寒沙門菌△sifA。

1.2.2 小鼠骨髓來源巨噬細(xì)胞(BMDM)的分離培養(yǎng)及處理 無菌分離小鼠后肢骨，RPMI1640培養(yǎng)基沖洗內(nèi)腔，沖洗液于4℃、1 000 r/min離心10 min，沉淀重懸于含200 g/L LCCM+100 mL/L FBS+1/1000 F/S的RPMI1640，接種于90 mm皿中，培養(yǎng)6 d，消化貼壁細(xì)胞，接種于6孔培養(yǎng)板中，貼壁過夜。細(xì)胞處理：將小鼠BMDM分為4個處理組,即空白對照組(NT)，LPS組(LPS)，LPS+SL1344組(SL1344)，LPS+△sifA組(△sifA)。500 ng/mL LPS預(yù)處理4 h，以不同的MOI(1∶20)細(xì)菌處理1 h后洗去培養(yǎng)上清而后添加含抗生素培養(yǎng)基，3 h后收集培養(yǎng)上清用于ELISA,或LDH釋放試驗，并以細(xì)胞裂解液裂解細(xì)胞，收集細(xì)胞裂解液用于Western blot檢測。

表1 PCR擴(kuò)增引物序列

Table 1 The primer sequences for PCR amplification

引物名稱Primername引物序列(5'～3')Primersequence(5'-3')pKD46F5'-TAGCGGATCCTACCTGAC-3'R5'-ATCAGTTCCTGTGGGTCG-3'CM+F5'-ACCGTAACACGCCACATC-3'R5'-ATCCCAATGGCATCGTAA-3'sifAF5'-CCCAAGGAATACGAAA-3'R5'-CAGCAGGATTGAGACATA-3'Linear-for5'-ATGCCGATTACTATAGGGAATGGTTTTTTAAAAAGTGAAATCCTTACCGATTGTGTAGGCTGGAGCTGC-3'Linear-rev5'-TTATAAAAAACAACATAAACAGCCGCTTTGTTGTTCTGAGCGAACGTGCACTTAACGGCTGACATGGGAA-3'

1.2.3 Western blot檢測 取上述各組細(xì)胞吸取上清后，剩余細(xì)胞中加入適量RIPA裂解液，勻漿提取總蛋白，BCA法測定蛋白濃度，取相同量蛋白溶于1×SDS，100℃煮沸 5 min，置-20℃保存，備用。取各處理組相同體積的培養(yǎng)上清，加入相同體積的甲醇，再加入1/4體積的氯仿， 4℃、13 000 r/min離心10 min，棄上清，加入1 mL甲醇，4℃、13 000 r/min 離心10 min，棄上清液，1×SDS 溶解，100℃煮沸5 min，置-20℃保存，備用。

150 g/L SDS-PAGE分離樣品；將蛋白轉(zhuǎn)至PVDF膜上，50 g/L脫脂牛奶室溫封閉2h，一抗結(jié)合 4℃過夜，1×TBST洗4次，二抗室溫結(jié)合1 h，1×TBST洗4次，每次15 min，ECL發(fā)光，暗室壓片曝光顯影。

1.2.4 ELISA檢測 按照mouse IL-1β Duo Set ELISA試劑盒說明書，檢測小鼠骨髓來源巨噬細(xì)胞處理后培養(yǎng)上清中IL-1β。

1.2.5 LDH的測定 按照CytoTox 96?Non-Radioactive Cytotoxicity Assay LDH試劑盒說明書，檢測小鼠骨髓來源巨噬細(xì)胞處理后LDH的釋放。

1.2.6 統(tǒng)計學(xué)分析 采用SPSS 13.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，計量資料以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，組內(nèi)比較采用t檢驗。P<0.05表示差異顯著，P<0.01表示差異極顯著。

2 結(jié)果

2.1 △sifA鼠傷寒沙門菌的鑒定

應(yīng)用λ-red基因重組系統(tǒng)，敲除SL1344菌株的sifA基因，獲得sifA基因缺失鼠傷寒沙門菌。野生型SL1344含有sifA基因，而重組△sifA菌株缺失sifA基因，并且成功敲除重組氯霉素抗性(圖1)。

A:1.DNA標(biāo)準(zhǔn)DL 500;2.陰性對照;3.沙門菌SL1344;4.重組pKD46質(zhì)粒沙門菌;5.含氯霉素抗性sifA缺失沙門菌;6～9.sifA基因缺失沙門菌B:1.DNA標(biāo)準(zhǔn)DL 500;2.陰性對照;3.沙門菌SL1344;4.重組pKD46質(zhì)粒沙門菌;5.含氯霉素抗性sifA缺失沙門菌;6-9.sifA基因缺失沙門菌A:1.DNA Marker DL 500;2.NC;3.SL1344;4.SL1344+pKD46;5.SL1344 △sifA+Cm;6-9.SL1344 △sifAB：1.DNA Marker DL 500;2.NC;3.SL1344;4.SL1344+pKD46;5.SL1344 △sifA+Cm;6-9.SL1344 △sifA

2.2 △sifA鼠傷寒沙門菌促進(jìn)IL-1β分泌

為了進(jìn)一步分析鼠傷寒沙門菌sifA毒力因子在引起宿主免疫反應(yīng)過程中是否影響IL-1β的分泌，分別用野生型SL1344菌株與△sifA菌株感染LPS預(yù)處理4h 的小鼠BMDM細(xì)胞(圖2)。在相同條件下△sifA菌株刺激IL-1β分泌增多。說明sifA基因缺失能夠促進(jìn)IL-1β的分泌。

Y軸表示每毫升培養(yǎng)液中白細(xì)胞介素-1β分泌量；X軸表示處理組

NT.對照組;SL1344.野生型沙門菌處理組;△sifA.sifA基因缺失沙門菌處理組

Y-axis represents interleukin -1β secretion per ml in culture medium; X-axis represents the treatment groups.NT.Control group;SL1344.Wild-typeSalmonellatreatment group,△ sifA.SifA gene deletionSalmonellatreatment group

圖2 △sifA增強(qiáng)BMDM的IL-1β的分泌

Fig.2 △sifA induced IL-1β release of mouse BMDM

2.3 △sifA鼠傷寒沙門菌促進(jìn)caspase-1活化

為了進(jìn)一步證明IL-1β分泌增多是否與caspase-1的活化增強(qiáng)有關(guān)，通過Western blot 檢測了caspase-1裂解片段p10的表達(dá)(圖3)，其中裂解液中的caspase-1的p45片段作為內(nèi)參。與野生型SL1344菌株相比，△sifA菌株能顯著促進(jìn)caspase-1裂解片段p10的表達(dá)。

2.4 △sifA鼠傷寒沙門菌促進(jìn)LDH的釋放

乳酸脫氫酶(LDH)是活細(xì)胞內(nèi)含酶之一，正常的細(xì)胞LDH較難透過細(xì)胞膜。而當(dāng)細(xì)胞受到損傷或死亡時，細(xì)胞膜通透性會產(chǎn)生變化，胞漿中的LDH會被釋放到培養(yǎng)液中。通過檢測細(xì)胞培養(yǎng)上清液中的LDH的含量可判斷細(xì)胞受損的程度。我們通過檢測不同MOI試驗組間細(xì)胞培養(yǎng)上清中的LDH釋放判斷鼠傷寒沙門菌sifA毒力因子是否影響細(xì)胞的損傷(圖4)?！鱯ifA菌株促進(jìn)宿主細(xì)胞LDH的釋放，即△sifA菌株相比野生型SL1344菌株誘導(dǎo)細(xì)胞的損傷增強(qiáng)，且在MOI=50時LDH的釋放存在極顯著差異(P<0.01)。

SN表示培養(yǎng)液，PELL表示細(xì)胞裂解液； 1.對照組;2.脂多糖組;3.野生型SL1344組;4.sifA基因缺失沙門菌組

SN represents culture medium,PELL represents cell lysate; 1.Control group;2.LPS group;3.Wild-typeSalmonellaSL1344 group; 4.△sifASalmonellagroup

圖3 △sifA促進(jìn)IL-1β分泌及caspase-1活化

Fig.3 △sifA promotes secretion of IL-1β and activation of caspase-1

Y軸表示乳酸脫氫酶釋放量的百分比；X軸表示不同感染復(fù)數(shù)處理組 10.感染復(fù)數(shù)為10；50.感染復(fù)數(shù)為50；100.感染復(fù)數(shù)為100

Y-axis represents the percentage of release of LDH; X-axis represents different MOI treatment groups 10.MOI= 10；50.MOI=50；100.MOI= 100

圖4 △sifA促進(jìn)小鼠BMDM中LDH的釋放

Fig.4 △sifA promotes LDH release from mouse BMDM

3 討論

鼠傷寒沙門菌是重要的人獸共患病原菌之一，由于鼠傷寒沙門菌具有較強(qiáng)的胞內(nèi)侵襲性，侵入細(xì)胞后存在于獨特的囊泡結(jié)構(gòu)SCV(Salmonella-containing vacuole)中，SCV的形成及成熟為沙門菌在宿主細(xì)胞中存活及繁殖提供了有利的微環(huán)境[7]。研究表明,沙門菌SPI-2 T3SS效應(yīng)蛋白能影響宿主細(xì)胞基因表達(dá)，從而維持SCV膜的完整性、限制SCV移行及與溶酶體的融合[8-9]。其中，sifA是沙門菌維持SCV膜完整性的重要SPI-2 T3SS 效應(yīng)蛋白，sifA突變的沙門菌不能維持SCV膜完整性而侵入細(xì)胞質(zhì)內(nèi)[10-11]。并且sifA對于細(xì)菌的體外穩(wěn)定性生長并沒有明顯的影響[12]。我們發(fā)現(xiàn)sifA突變的沙門菌在侵入細(xì)胞質(zhì)內(nèi)后，能夠引起caspase-1這一重

要的炎性小體標(biāo)志蛋白的活化增強(qiáng)，能夠顯著促進(jìn)細(xì)胞向胞外分泌IL-1β，并且能夠顯著提高細(xì)胞的損傷程度，推斷sifA缺失沙門菌能夠增強(qiáng)炎性體活化。然而，對于細(xì)胞是通過何種模式識別受體(PRR)來識別sifA缺失沙門菌的目前仍不清楚，sifA毒力因子在沙門菌逃逸細(xì)胞免疫反應(yīng)過程中的作用也有待進(jìn)一步的研究。sifA缺失所引起的炎性體活化增強(qiáng)與其SCV完整性破壞、病原侵入細(xì)胞質(zhì)相關(guān)，或者由于sifA缺失引起沙門菌其他毒力因子更易被宿主所識別等問題的解決，將為進(jìn)一步揭示沙門菌sifA蛋白的作用，為沙門菌病防控和治療提供理論依據(jù)。

[1] Feasey N A，Dougan G，Kingsley R A，et al.Invasive non-typhoidalSalmonelladisease:an emerging and neglected tropical disease in Africa[J].Lancet,2012,379(9835):2489-2499.

[2] Broz P，Ohlson M B，Moncak D M. Innate immune response toSalmonellatyphimurium,a model enteric pathogen[J].Gut Microbes,2012,3(2):62-70.

[3] Franchi L.Role of inflammasomes inSalmonellainfection[J].Front Microbiol,2011, 2(1):111-117.

[4] Greaney A J,Leppla S H,Moayeri M.Bacterial exotoxins and the inflammasome[J].Front Immunol，2015,6:570.doi: 10.3389/fimmu.2015.00570.

[5] Triantafilou M,Hughes T R,Morgan B P,et al.Complementing the inflammasome[J].Immunology,2016, 147(2):152-164.

[6] 李 曄,張西軒,郭夢征,等.利用λRed重組系統(tǒng)敲除鼠傷寒沙門菌sopB基因[J].生物技術(shù)通報,2014(9):171-177.

[7] Vonaesch P，Sellin M E，Cardini S，et al.TheSalmonellatyphimuriumeffector protein SopE transiently localizes to the early SCV and contributes to intracellular replication[J].Cell Microbiol,2014,16(12):1723-1735.

[8] Mcgourty K，Thurston T L，Matthews S A，et al.Salmonellainhibits retrograde trafficking of mannose-6-phosphate receptors and lysosome function[J].Science,2012,338(6109):963-967.

[9] Agbor T A，Mccormick B A.Salmonellaeffectors:important players modulating host cell function during infection[J].Cell Microbiol,2011,13(12):1858-1869.

[10] Schroeder N，Henry T，Chastellier C D，et al.The virulence protein SopD2 regulates membrane dynamics ofSalmonella-containing vacuoles[J].PLoS Pathog,2010,6(7):e1001002.

[11] Zhao W,Moest T,Zhao Y,et al.TheSalmonellaeffector protein SifA plays a dual role in virulence[J].Sci Rep,2015,5:12979.doi: 10.1038/srep12979.

[12] 殷俊磊,徐黎娟,王志鵬,等.雞白痢沙門菌sifA基因缺失株的構(gòu)建及其生物學(xué)特性的研究[J].中國獸醫(yī)科學(xué),2015((4):345-351.

Deletion of SifA Gene ofSalmonellaEnhances Inflammasome Activation in Macrophages

SONG Pei-xuan,HU Gui-qiu,QIN Xiao-xia,LEI Qian-qian,FENG Shi-yuan1，QI Shuai，LI Kun-yu，DU Chong-tao，YANG Yong-jun，CHEN Wei

(CollegeofVeterinaryMedicine,JilinUniversity，Changchun,Jilin,130062,China)

To investigate the effect of SifA inSalmonella-induced inflammasomes，in this study，we used λ Red recombination system to knockout SifA gene ofSalmonellatyphimuriumSL1344 and obtain △sifA mutant strain.The peritoneal macrophages from mouse bone marrow wereisolated and cultured.Subsequently,cell culture supernatant and cell lysate were collected after LPS combined with different bacterial stain treated cells.Finally,ELISA，Western blot and LDH release assay were used to detect IL-1β secretion，caspase-1 expression and cell death.The results showed that △sifA promotes IL-1β secretion,caspase-1 expression and cell death.Together, these findings demonstrated that △sifA can enhance the activation of inflammasomes.

Salmonella；sifA；gene knockout; inflammasome；enhancement；macrophage

2015-11-13

國家自然科學(xué)基金(3A411V246604)

宋佩烜(1990-)，男，吉林長春人，碩士，主要從事獸醫(yī)微生物及免疫學(xué)研究。*通訊作者

S852.612

A

1007-5038(2016)05-0001-04