基于氧化石墨烯熒光適體傳感器的多巴胺檢測(cè)

姜利英， 周鵬磊， 肖小楠， 張 培， 劉 帥， 閆艷霞， 陳青華， 姜素霞

(鄭州輕工業(yè)學(xué)院 電氣信息工程學(xué)院， 河南 鄭州 450002)

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基于氧化石墨烯熒光適體傳感器的多巴胺檢測(cè)

姜利英*， 周鵬磊， 肖小楠， 張 培， 劉 帥， 閆艷霞， 陳青華， 姜素霞

(鄭州輕工業(yè)學(xué)院 電氣信息工程學(xué)院， 河南 鄭州 450002)

以修飾有熒光基團(tuán)(FAM)的多巴胺核酸適體作為識(shí)別元件，氧化石墨烯為猝滅劑，構(gòu)建了光學(xué)適體傳感器用于檢測(cè)多巴胺。通過π-π堆積作用力，氧化石墨烯以共振方式把核酸適體上FAM能量轉(zhuǎn)移到其表面，熒光信號(hào)消失；加入多巴胺后熒光恢復(fù)，熒光強(qiáng)度恢復(fù)的大小與多巴胺濃度呈正相關(guān)關(guān)系。實(shí)驗(yàn)優(yōu)化結(jié)果表明，在反應(yīng)時(shí)間5 min和10 μg/mL氧化石墨烯條件下，氧化石墨烯可以達(dá)到對(duì)FAM的最高猝滅效率；25 min孵育后，多巴胺恢復(fù)熒光強(qiáng)度達(dá)到穩(wěn)定；傳感器線性檢測(cè)范圍為1～500 μmol/L，檢測(cè)限達(dá)到1 μmol/L。所制備傳感器具有檢測(cè)范圍寬、檢測(cè)速度快、特異性強(qiáng)以及檢測(cè)成本低等優(yōu)點(diǎn)。

氧化石墨烯； 熒光； 適體傳感器； 多巴胺

1 引 言

多巴胺 (Dopamine, DA)是神經(jīng)遞質(zhì)類物質(zhì)[1-3]，參與人體多項(xiàng)生理功能的調(diào)節(jié)，如激勵(lì)[4]、運(yùn)動(dòng)[5]、情緒[6]等。DA系統(tǒng)功能紊亂可以引起多種疾病，如帕金森癥[7]、精神分裂癥[8]、注意力缺陷多動(dòng)癥[9]等。目前檢測(cè)DA的常用方法包括酶法[10]、分光光度法[11]、高效液相色譜法[12]等，但均存在操作過程復(fù)雜、檢測(cè)設(shè)備昂貴、檢測(cè)成本高等缺點(diǎn)。

核酸適體由于具有高親和性和高特異性的特點(diǎn)，被廣泛用于生物傳感器研究。納米技術(shù)[13]與適體傳感器的結(jié)合進(jìn)一步提高了傳感器的靈敏度和精確度。氧化石墨烯[14](Graphene oxide, GO)具有優(yōu)良的光、電、力學(xué)特性，已被越來越多地用于生物傳感器的構(gòu)建。GO能與熒光標(biāo)記的核酸結(jié)合并進(jìn)行能量轉(zhuǎn)移，從而猝滅FAM-適體的熒光。Wen等[15]以GO作為基層的化學(xué)適體傳感器檢測(cè)出了ATP的濃度。Kun等[16]利用GO的π-π堿基堆積力吸附標(biāo)記有FITC的IgE適體，并通過能量轉(zhuǎn)移猝滅FITC從而檢測(cè)出IgE濃度。本文利用GO的納米特性，結(jié)合核酸適體標(biāo)記FAM制備了光學(xué)適體傳感器，實(shí)現(xiàn)了對(duì)多巴胺的檢測(cè)。

2 實(shí) 驗(yàn)

2.1 儀器與試劑

F-7000型熒光分光光度計(jì)(HITACHI)；ME204型天平(梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司)；FE20K酸度計(jì)(梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司)；DHG-9030A型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱(上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司)；GL-16Ⅱ型離心機(jī)(上海安亭科學(xué)儀器廠)；07HWS-2數(shù)顯恒溫磁力攪拌器(杭州儀表電機(jī)有限公司)；KQ 2200E型超聲波清洗器；LA612型 ELGA Lab Water水浴鍋。

多巴胺適體由上海生工生物工程股份有限公司合成，序列：5′-FAM-GTCTCTGTGTGCGCCA-GAGAACACTGGGGCAGATATGGGCCAGCACAG-AATGAGGCCC-3′。氧化石墨烯溶液購自蘇州恒球科技有限公司。多巴胺鹽酸鹽、氫氧化鈉、濃鹽酸、NaCl、tris-HCl、L-Ascorbic acid(AA)、腎上腺素(L-A)和去腎上腺素(L-NA)均購自索萊寶科技有限公司。實(shí)驗(yàn)用水為18.2 MΩ超純水，由ELGA Lab Water制得。

2.2 熒光適體傳感器的制備

用電子天平和酸度計(jì)配制出pH=7.4的濃度為50 mmol/L的tris-HCl緩沖液，其中含有30 mmol/L的NaCl。吸取一定體積的緩沖液，加入適體中離心。配制出 10 nmol/L的熒光適體和10 μg/mL的氧化石墨烯的猝滅溶液。隨后向猝滅溶液中加入DA。常溫孵育25 min后，取3 mL加入石英比色皿。設(shè)定熒光分光光度計(jì)激發(fā)波長(zhǎng)為480 nm，入射出射狹縫均為10 nm，熒光發(fā)射光譜檢測(cè)范圍為510～600 nm。

2.3 傳感器檢測(cè)原理及方法

圖1為傳感器檢測(cè)原理。當(dāng)沒有加入目標(biāo)底物DA時(shí)，通過π-π堆積作用，核酸適體FAM熒光能量被傳遞到氧化石墨烯，熒光猝滅；加入DA后，核酸適體與DA特異性結(jié)合而從氧化石墨烯的表面游離，由于π-π堆積作用的消失，熒光信號(hào)恢復(fù)。

圖1 熒光適體傳感器檢測(cè)DA的原理圖

Fig.1 Schematic illustration of the detection of DA based on GO FRET aptasensor

3 結(jié)果與討論

3.1 納米熒光適體傳感器特性

傳感器的光學(xué)特性如圖2所示，曲線a是FAM-DNA猝滅前的熒光發(fā)射光譜，曲線d是在FAM-DNA中加入氧化石墨烯后的猝滅光譜。由圖可以看出，加入氧化石墨烯后，85.1%的熒光信號(hào)被猝滅。曲線b和c是在曲線a基礎(chǔ)上分別以不同順序加入DA和GO的光譜?？梢钥闯?，無論DA和GO的加入順序如何，熒光信號(hào)都能有一定程度的恢復(fù)。這說明DA的加入可以使熒光信號(hào)恢復(fù)，構(gòu)建的熒光適體傳感器可以用于DA檢測(cè)。同時(shí)可以看出，GO和DA的加入順序?qū)?shí)驗(yàn)有一定的影響。這可能是先加DA時(shí)，F(xiàn)AM-DNA會(huì)與DA優(yōu)先結(jié)合形成四聯(lián)體，阻礙FAM-DNA與GO的堆積作用。若能采用某種放大策略最大化釋放被猝滅的熒光信號(hào)，則能進(jìn)一步提高傳感器的靈敏度。

圖2 不同條件下的傳感器熒光發(fā)射光譜：(a) FAM;(b) FAM +DA+GO;(c) FAM+GO+DA;(d) FAM +GO。

Fig.2 Fluorescence spectra of FAM-DNA under different conditions: (a) FAM; (b) FAM +DA+ GO; (c) FAM +GO+DA; (d) FAM + GO.

3.2 實(shí)驗(yàn)條件優(yōu)化

本實(shí)驗(yàn)分別對(duì)氧化石墨烯濃度及孵育時(shí)間進(jìn)行了優(yōu)化研究。在室溫、FAM-DNA濃度10 nmol/L和猝滅時(shí)間5 min條件下，分別加入2，4，6，8，10，12，14，16 μg/mL的氧化石墨烯，檢測(cè)猝滅后的熒光發(fā)射譜，結(jié)果見圖3。圖3(a)為分別加入2，4，6，8，10，12，14，16 μg/mL的氧化石墨烯與10 nmol/L 的FAM-DNA反應(yīng)的發(fā)射光譜?？梢钥闯?，隨著氧化石墨烯濃度的增加，熒光強(qiáng)度越來越小。由圖3(b)可以看出，在氧化石墨烯濃度高于10 μg/mL后，猝滅效率(F/F0)下降，且熒光猝滅程度較高，故選擇10 μg/mL的氧化石墨烯作為猝滅濃度。

FAM-DNA加入氧化石墨烯后，分別檢測(cè)5，10，15，20，25，30，40，50，60 min的熒光強(qiáng)度，結(jié)果見圖4。可以看出，猝滅在5 min內(nèi)就已經(jīng)完成，故猝滅時(shí)間定為5 min。猝滅完成后加入DA孵育，檢測(cè)5，10，15，20，25，30，40，50，60 min的熒光強(qiáng)度。由圖4可以看出， 25 min內(nèi)熒光強(qiáng)度逐漸恢復(fù)，25～60 min熒光強(qiáng)度穩(wěn)定，故選擇25 min為孵育時(shí)間。

圖3 (a) FAM-DNA在不同GO濃度條件下的熒光發(fā)射光譜；(b)不同濃度的GO在加入和未加入DA后的相對(duì)熒光強(qiáng)度(F/F0)，其中 DA濃度為1 μmol/L。

Fig.3 (a) Fluorescence spectra of FAM-DNA in the presence of different GO concentrations. (b) Effect of GO concentration on the fluorescence intensity of FAM-DNA in the absence and presence of DA (1 μmol/L).

圖4 不同時(shí)間下，未加入DA和加入DA時(shí)的FAM-DNA-GO的熒光強(qiáng)度，DA濃度為85 μmol /L。

Fig.4 Fluorescence intensity of FAM-labeled aptamer in the presence of GO (10 μg/mL) without and with DA (85 μmol/L). The aptamer concentration is 10 nmol/L.

3.3 DA濃度與熒光強(qiáng)度的關(guān)系

在10 nmol/L FAM-DNA、10 μg/mL GO溶液中，分別加入1，35，50，85，100，200，375，400，500 μmol/L的DA，在室溫下孵育25 min，然后分別測(cè)出DA熒光恢復(fù)后的發(fā)射光譜。可以看出，隨著DA濃度的逐漸增大，熒光強(qiáng)度逐漸增大，線性關(guān)系為y=36.660+0.1474x，其中y代表熒光強(qiáng)度，x代表DA濃度，相關(guān)度達(dá)到0.988。表1為不同方法檢測(cè)DA的線性范圍、檢測(cè)限及所用適體類型。通過比較可以看出，本實(shí)驗(yàn)方法具有應(yīng)用意義。

圖5 不同濃度DA和熒光強(qiáng)度的關(guān)系。(a)DA濃度在1～500 μmol/L變化時(shí)的FAM熒光發(fā)射光譜；(b) DA濃度和熒光強(qiáng)度的線性擬合曲線。

Fig.5 Dependence of fluorescence intensity on the concentration of DA. (a) Fluorescence spectra of FAM-DNA-GO with different DA concentrations from 1 to 500 μmol/L. (b) Fluorescence intensity of FAM-DNA-GOvs. DA concentration.

表1 不同方法對(duì)DA的檢測(cè)

3.4 特異性實(shí)驗(yàn)

DA有多種結(jié)構(gòu)相似物，通過特異性實(shí)驗(yàn)可以檢驗(yàn)傳感器的分辨力。分別檢測(cè)濃度均為200 μmol/L的DA、腎上腺素、去腎上腺素和維生素C的熒光強(qiáng)度，結(jié)果見圖6，其中F0和F分別表示加入不同選擇性物質(zhì)前后的熒光強(qiáng)度，F(xiàn)DA表示多巴胺的熒光強(qiáng)度?？梢钥闯?，本實(shí)驗(yàn)構(gòu)建的傳感器特異性較強(qiáng)，分辨DA性能較好。

圖6 本文方法對(duì)DA檢測(cè)的特異性研究結(jié)果

Fig.6 Selectivity of the DA analysis using the method shown in Fig. 1

3.5 實(shí)際樣品的分析

多巴胺加入到正常人的血清中，配成不同濃度的待測(cè)溶液。我們采用同樣的實(shí)驗(yàn)方法，對(duì)樣品的熒光強(qiáng)度進(jìn)行檢測(cè)，每個(gè)濃度樣品平行測(cè)定3次，結(jié)果如表2所示?？梢钥闯?，樣品實(shí)際熒光強(qiáng)度均值與標(biāo)準(zhǔn)曲線的相對(duì)偏差均小于5%，測(cè)定結(jié)果誤差較小，表明該方法具有較好的準(zhǔn)確度。

表2 實(shí)際樣品中多巴胺的測(cè)定結(jié)果

4 結(jié) 論

以修飾有熒光基團(tuán)的多巴胺核酸適體作為識(shí)別元件，氧化石墨烯為猝滅劑，構(gòu)建了光學(xué)適體傳感器用于檢測(cè)多巴胺。通過π-π堆積作用力，氧化石墨烯以共振方式把核酸適體上FAM能量轉(zhuǎn)移到其表面，熒光信號(hào)消失；加入多巴胺后熒光恢復(fù)，熒光強(qiáng)度恢復(fù)的大小與多巴胺濃度呈正相關(guān)關(guān)系。所制備的傳感器具有靈敏度高、操作簡(jiǎn)單等特點(diǎn)，傳感器線性檢測(cè)范圍為1～500 μmol/L，檢測(cè)限達(dá)到1 μmol/L。

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姜利英(1981-)，女，河南郾城人，博士，教授，2007年于中國(guó)科學(xué)院電子學(xué)研究所獲得博士學(xué)位，主要從事生物傳感器及檢測(cè)微系統(tǒng)方面的研究。

E-mail： jiangliying@zzuli.edu.cn

Fluorescent Aptamer Biosensor for The Detection of Dopamine with Graphene Oxide

JIANG Li-ying*, ZHOU Peng-lei, XIAO Xiao-nan, ZHANG Pei, LIU Shuai, YAN Yan-xia, CHEN Qing-hua, JIANG Su-xia

(InstituteofElectricalandInformationEngineering,ZhengzhouUniversityofLightIndustry,Zhengzhou450002,China)

A fluorescent aptamer biosensor was constructed for the determination of dopamine. The dopamine aptamer modified 6-carboxyfluorescein (FAM) was used as the recognition element, and graphene oxide was the quencher. Through π-π stacking interaction, FAM energy can be transferred to the surface of the graphene oxide in resonant manner, and the fluorescence disappears. In the presence of DA, the fluorescence can be recovered and the fluorescence intensity is found to be in proportion to the concentration of DA. The optimized research results show that 10 μg/mL graphene oxide may achieve maximum quenching efficiency within 5 min reaction time. The fluorescence intensity can reach a stable recovery after 25 min incubation. The response to dopamine proves to be linear with the correlation coefficient up to 0.988 in the relevant concentration range of 1-500 μmol/L, and the detection limit is 1 μmol/L. The biosensor is characterized by its wide range of measurement, fast detection, low cost and so on.

graphene oxide; fluorescence; aptamer biosensor; dopamine

2016-02-29；

2016-03-24

國(guó)家自然科學(xué)基金(61002007,61271147)； 鄭州輕工業(yè)學(xué)院博士科研基金(2014BSJJ04)； 鄭州輕工業(yè)學(xué)院2014年度研究生科技創(chuàng)新基金(2014010)； 基于集成共面薄膜金電極的核酸適體傳感器項(xiàng)目(2014XJJ019)資助

1000-7032(2016)07-0881-06

TP212

A

10.3788/fgxb20163707.0881

*CorrespondingAuthor,E-mail:jiangliying@zzuli.edu.cn