張騰霄,王斌,魏雅冬
(1.綏化學(xué)院食品與制藥工程學(xué)院,黑龍江綏化152061;2.綏化學(xué)院農(nóng)業(yè)與水利工程學(xué)院,黑龍江綏化152061)
15種藥材脂溶性提取物對(duì)青霉孢子的抑制效果
張騰霄1,王斌1,魏雅冬2
(1.綏化學(xué)院食品與制藥工程學(xué)院,黑龍江綏化152061;2.綏化學(xué)院農(nóng)業(yè)與水利工程學(xué)院,黑龍江綏化152061)
青霉是一類適應(yīng)環(huán)境能力強(qiáng)且分泌多種毒素的真菌,是造成食品霉?fàn)€變質(zhì)及食用菌嚴(yán)重感染的主要微生物之一。以丙酮為提取溶劑分別對(duì)小薊、柴胡、白鮮皮、金銀花、黃柏、徐長(zhǎng)卿、苦參、大黃、荊芥、黃芪、板藍(lán)根、土荊皮、石榴皮、黃連和大蒜共15種藥材中的脂溶性抑菌成分進(jìn)行振蕩浸漬法提取,采用平板涂布法考察了15種中藥材提取物對(duì)桔青霉(Penicillium citrinum)、黃綠青霉(Penicillium citreoviride)、產(chǎn)黃青霉(Penicillium chrysogenum)的抑制效果,并與山梨酸鉀和多菌靈2種常用的防腐殺菌劑做對(duì)照比較。結(jié)果顯示,桔青霉孢子對(duì)藥物敏感性最低、抵抗力最強(qiáng),15種藥材提取物對(duì)青霉孢子的抑制效果存在很大差異,其中,大蒜和徐長(zhǎng)卿抑制效果最好,抑制率接近100%,抑菌性能高于山梨酸鉀和多菌靈;金銀花、柴胡、小薊和黃柏對(duì)3種青霉孢子有明顯的抑制效果,抑制率為56.7%~81.8%;黃芪、板藍(lán)根和黃連不僅無(wú)抑制效果甚至還能促進(jìn)其生長(zhǎng);作為陽(yáng)性對(duì)照的山梨酸鉀對(duì)青霉孢子有明顯的抑制作用,但多菌靈對(duì)青霉孢子幾乎無(wú)抑制作用。大蒜和金銀花提取物抑制效能受濃度的影響小,抑制效能穩(wěn)定可靠;徐長(zhǎng)卿、柴胡和小薊提取物隨著濃度的降低抑制率大幅度下降,受濃度的影響較大,抑制能力呈典型的濃度依賴型。
青霉;孢子;食用菌;藥材;丙酮;提取物
青霉(Penicillium)是半知菌亞門(mén)的一種真菌,大多數(shù)青霉菌株可產(chǎn)生真菌毒素,如桔青霉(Penicillium citrinum)產(chǎn)生的桔青霉毒素有很強(qiáng)的腎毒性,黃綠青霉(Penicillium citreoviride)產(chǎn)生的黃綠青霉毒素有神經(jīng)毒性,島青霉(Penicillium islandicum)產(chǎn)生的黃天精和含氯肽有很強(qiáng)的肝毒性。各種青霉是造成果菜、糧食霉變、食物中毒的主要微生物[1-6],青霉還是食用菌栽培過(guò)程中為害大、傳染性極高的一種競(jìng)爭(zhēng)性絲狀霉菌[7-8],它的特點(diǎn)是產(chǎn)孢子能力強(qiáng)、感染傳播快,短時(shí)間內(nèi)導(dǎo)致成批菌袋報(bào)廢,造成巨大經(jīng)濟(jì)損失。據(jù)綏化學(xué)院食用菌栽培技術(shù)研究課題組的雜菌監(jiān)測(cè)與鑒定,東北地區(qū)的青霉危害程度高于木霉,主要原因是青霉在8~20℃的低溫下菌絲生長(zhǎng)快且仍有快速產(chǎn)孢能力。定期對(duì)食用菌制種和栽培環(huán)境、菌袋表面噴灑抑菌殺菌藥劑可有效預(yù)防發(fā)病。傳統(tǒng)的化學(xué)藥劑防治,如多菌靈、甲基托布津、二氯異氰尿酸鈉、富馬酸二甲酯等存在不同程度的殘留,對(duì)食用菌產(chǎn)品的安全性造成隱患。某些植物中的天然化合物成分對(duì)致病真菌有抑制作用[9-17],在倡導(dǎo)食品安全的指導(dǎo)思想下,綏化學(xué)院食用菌栽培技術(shù)研究課題組開(kāi)展了從廉價(jià)常用的15種中藥材中篩選可以抑制霉菌生長(zhǎng)的脂溶性成分的研究,為開(kāi)發(fā)安全、無(wú)污染、無(wú)公害的青霉菌防治藥劑提供理論依據(jù)。
1.1 供試材料
1.1.1 試驗(yàn)藥品小薊、金銀花、柴胡、徐長(zhǎng)卿、黃柏、白鮮皮、苦參、大黃、荊芥、黃芪、黃連、板藍(lán)根、土荊皮、石榴皮中藥材購(gòu)買于黑龍江省綏化市泰華大藥房;大蒜購(gòu)于綏化市華辰超市。
60%多菌靈可濕性粉劑(上海升聯(lián)化工有限公司),山梨酸鉀(分析純,天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所),丙酮(分析純,天津致遠(yuǎn)化學(xué)試劑有限公司),氯霉素(吉林省博大制藥有限公司,片劑,0.125g/片),氯化鈉,葡萄糖,瓊脂,磷酸二氫鉀,硫酸鎂,蛋白胨,虎紅。
1.1.2 供試菌株桔青霉(Penicillium citrinum)、黃綠青霉(Penicillium citreoviride)、產(chǎn)黃青霉(Penicillium chrysogenum)由綏化學(xué)院食品與制藥工程學(xué)院微生物實(shí)驗(yàn)室分離保藏。
1.1.3 試驗(yàn)儀器HPX-9162MBE數(shù)顯電熱培養(yǎng)箱(上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠),SW-CJ-ZF型雙人雙面凈化工作臺(tái)(蘇州凈化設(shè)備有限公司),F(xiàn)A2104電子天平(上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司),YXQ-LS-50SII型立式壓力蒸汽滅菌器(上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠),HY-6A雙層調(diào)速多用振蕩器(江蘇省金壇市榮華儀器制造有限公司),M293592型索氏提取器(北京中西遠(yuǎn)大科技有限公司),微量移液器。
1.2 試驗(yàn)方法
1.2.1 藥材提取物的制備分別將小薊、柴胡、白鮮皮、金銀花、黃柏、徐長(zhǎng)卿、苦參、大黃、荊芥、黃芪、板藍(lán)根、土荊皮、石榴皮、黃連14種藥材粉碎成3~5 mm小段或顆粒;大蒜切成1~2 mm厚的薄片后50℃烘干12 h,得大蒜片干品,以利于脂溶性成分的提??;以山梨酸鉀(標(biāo)記為P1)、多菌靈(標(biāo)記為P2)2種霉菌抑制藥設(shè)置為2組陽(yáng)性對(duì)照,以生理鹽水設(shè)置為1組陰性對(duì)照(標(biāo)記為N),對(duì)15種中藥材按表1的順序進(jìn)行編號(hào)標(biāo)記。分別稱取15種藥材10.0g,藥材用雙層紗布包裹繩扎后放在250mL的錐形瓶中,加入100 mL的丙酮,錐形瓶封口后放在轉(zhuǎn)速為120 r/min的振蕩器上振蕩浸提24 h,得到藥材的丙酮浸提液,將浸提液裝入抽提瓶中,用索氏提取器在65℃下蒸干浸提液中的丙酮,得膏狀浸提物,加入5 mL丙酮,振蕩并攪拌將吸附在瓶壁上浸提物充分溶解,轉(zhuǎn)移到滅菌試管,得5 mL中藥材提取液,試管封口后備用。
表1 中藥材及對(duì)照物編號(hào)
1.2.2 陰性和陽(yáng)性對(duì)照物溶液的制備生理鹽水陰性對(duì)照液(N,陰性對(duì)照)的制備:稱取0.90 g氯化鈉,溶解于100 mL蒸餾水中,裝入三角瓶后,硅膠塞封口雙層報(bào)紙?jiān)诤螅?21℃滅菌20 min,得無(wú)菌0.9%的生理鹽水。
0.5 %山梨酸鉀陽(yáng)性對(duì)照液(P1,陽(yáng)性對(duì)照)的制備:稱取0.50 g山梨酸鉀,溶解于100 mL蒸餾水中,裝入三角瓶后,硅膠塞封口雙層報(bào)紙?jiān)诤螅?21℃滅菌20 min。
0.5 %多菌靈陽(yáng)性對(duì)照液(P2,陽(yáng)性對(duì)照)的制備:稱取0.84 g 60%多菌靈可濕性粉劑,溶解于100 mL蒸餾水中,裝入三角瓶后,硅膠塞封口雙層報(bào)紙?jiān)诤螅?21℃滅菌20 min。
1.2.3 青霉菌孢子懸液的制備從當(dāng)?shù)?個(gè)食用菌生產(chǎn)基地受霉菌感染的食用菌栽培袋內(nèi)分離得到桔青霉(Penicillium citrinum)、黃綠青霉(Penicillium citreoviride)、產(chǎn)黃青霉(Penicillium chrysogenum)3種(株)青霉,用PDA培養(yǎng)基試管斜面分別于25℃下純培養(yǎng)3種青霉,培養(yǎng)72 h斜面上產(chǎn)生一層綠色孢子層,用接種鏟刮取少量孢子懸浮于預(yù)先滅菌好的100 mL0.9%的生理鹽水中,加入氯霉素0.125 g,然后200 r/min振蕩2 h后得青霉孢子懸液。青霉孢子懸液中加入氯霉素的目的是殺滅藥材提取液及操作過(guò)程帶進(jìn)的細(xì)菌(因細(xì)菌形成菌落后會(huì)對(duì)結(jié)果造成干擾),氯霉素僅殺細(xì)菌但不抑制霉菌的生長(zhǎng),高壓蒸汽滅菌容易導(dǎo)致中藥材提取液中的成分分解或揮發(fā),加入抗生素后不需要再對(duì)中藥材提取液進(jìn)行滅菌處理,從而避免了對(duì)有效成分的破壞,提高了結(jié)果的準(zhǔn)確性。
1.2.4 藥材提取物對(duì)3種青霉孢子生長(zhǎng)抑制試驗(yàn)
用直徑為9 cm的培養(yǎng)皿制作含虎紅染料的PDA培養(yǎng)平板(加入虎紅染料的目的是提高培養(yǎng)平板背景顏色,孢子萌發(fā)后能形成清晰的菌落),用微量移液器吸取0.5 mL的1.2.1制備的中藥材提取液滴于虎紅PDA培養(yǎng)平板上,用涂布器反復(fù)涂抹,使藥液均勻鋪展于培養(yǎng)平板,按表1中的標(biāo)號(hào)序列在培養(yǎng)皿上進(jìn)行標(biāo)記,每個(gè)測(cè)試樣品做3個(gè)平行,取平均值作為統(tǒng)計(jì)計(jì)算的依據(jù)。涂布藥液后的培養(yǎng)皿置于真空箱中,真空抽氣5 min,使培養(yǎng)平板上的丙酮揮發(fā)除去,然后轉(zhuǎn)移到超凈工作臺(tái)內(nèi),用微量移液器吸取0.2 mL的青霉孢子懸液滴于上述含藥材提出物的虎紅PDA培養(yǎng)平板上,用涂布器將孢子懸液在虎紅PDA培養(yǎng)基上涂布均勻,設(shè)定培養(yǎng)溫度為28℃,培養(yǎng)56 h統(tǒng)計(jì)結(jié)果,記錄各個(gè)培養(yǎng)皿中的毛狀菌落數(shù)量,得青霉菌孢子在某一種中藥材提取物作用下萌發(fā)生長(zhǎng)形成的菌落數(shù)(cfu),與不含藥的陰性對(duì)照培養(yǎng)平板比較,并計(jì)算抑制率。
抑制率=(陰性對(duì)照平板上菌落數(shù)-含中藥材提取物的測(cè)試平板上菌落數(shù))/陰性對(duì)照平板上菌落數(shù)×100%。
1.2.5 藥材提取物濃度對(duì)抑菌效果的影響通過(guò)1.2.4篩選出有明顯抑菌效果的藥材,接著考察提取物濃度與抑菌效率的關(guān)系。將1.2.1制備的藥材提取液,分別進(jìn)行1倍、2倍、4倍和6倍稀釋,按照1.2.4步驟進(jìn)行抑菌試驗(yàn),每組3個(gè)平行,記錄各個(gè)培養(yǎng)皿中的毛狀菌落數(shù)量,得到青霉在各個(gè)藥材提取液濃度下菌落數(shù)(cfu),與不含藥的陰性對(duì)照培養(yǎng)平板比較,計(jì)算出抑制率,繪制藥物提取物濃度與抑制率的關(guān)系曲線。
2.1 中藥材提取物對(duì)青霉的抑制效果
表2 藥材提取物對(duì)桔青霉(Penicillium citrinum)的抑制率%
表3 藥材提取物對(duì)黃綠青霉(Penicillium citreoviride)的抑制率%
表4 藥材提取物對(duì)產(chǎn)黃青霉(Penicillium chrysogenum)的抑制率%
在28℃下培養(yǎng)56 h后,15種中藥材提取物對(duì)桔青霉(Penicillium citrinum)、黃綠青霉(Penicillium citreoviride)、產(chǎn)黃青霉(Penicillium chrysogenum)3種青霉孢子生長(zhǎng)抑制結(jié)果如表2~4所示。
從表2,3,4可以看出,桔青霉(Penicillium citrinum)、黃綠青霉(Penicillium citreoviride)、產(chǎn)黃青霉(Penicillium chrysogenum)3種青霉孢子對(duì)中藥提取物的敏感性存在差別,但整體上顯現(xiàn)出一致性,體現(xiàn)了青霉種屬水平上的生物學(xué)共性。15種中藥材提取物對(duì)桔青霉孢子抑制率均偏低,這說(shuō)明桔青霉孢子抵抗藥物能力最強(qiáng),而黃綠青霉孢子抑制率均偏高,顯示其對(duì)各個(gè)藥物敏感、抵抗力最差。15種中藥材提取物對(duì)3種青霉孢子的抑制能力表現(xiàn)出顯著差異,其中,徐長(zhǎng)卿、大蒜提取物的抑制作用最強(qiáng),對(duì)青霉孢子的抑制率接近100%,抑制能力明顯強(qiáng)于山梨酸鉀和多菌靈;金銀花、柴胡、小薊和黃柏提取物的抑制效果次之,抑制率為56.7%~81.8%,但對(duì)青霉孢子均有明顯的抑制作用;白鮮皮、土荊皮、大黃等中藥材提取物對(duì)青霉孢子有弱抑制能力,抑制率僅在15.2%~46.7%,抑制效果不夠理想;黃芪、板藍(lán)根、黃連3種藥材提取物對(duì)青霉孢子完全沒(méi)有抑制作用甚至還有促進(jìn)其生長(zhǎng)的作用;陽(yáng)性對(duì)照組中,山梨酸鉀是常用的食品防腐劑,對(duì)青霉的抑制率為90.7%~91.7%,有較好的抑制效果;多菌靈在側(cè)耳屬菇類的生料栽培、食用菌栽培場(chǎng)地消毒、防治植物病害中使用頻率最高,但多菌靈抑制青霉的能力很差,僅有6.7%~16.7%的抑制率,對(duì)于青霉污染嚴(yán)重的栽培場(chǎng)所和感染青霉的栽培袋不應(yīng)選用多菌靈防治。
2.2 提取物濃度對(duì)抑菌效果的影響
根據(jù)2.1的結(jié)果,選取對(duì)青霉孢子有明顯抑制作用的大蒜、徐長(zhǎng)卿、小薊、金銀花、柴胡5種藥材浸提物進(jìn)一步試驗(yàn);桔青霉孢子對(duì)藥物的抵抗力最頑強(qiáng),選作供試菌株進(jìn)一步試驗(yàn)。以各個(gè)藥材的丙酮提取物母液(每1 mL丙酮提取物母液相當(dāng)于含原藥材2.0 g)分別進(jìn)行1倍、2倍、4倍、6倍稀釋得4個(gè)濃度梯度溶液,測(cè)試藥材提取物在4個(gè)濃度梯度溶液下提取物濃度與抑菌效率的關(guān)系,以藥材提取物的濃度作為橫坐標(biāo),以抑制率為縱坐標(biāo)形成抑菌效率趨勢(shì)圖(圖1)。
由圖1可知,隨著藥材提取物濃度的降低,各個(gè)藥材提取物對(duì)青霉孢子的抑制作用整體呈降低的趨勢(shì),其中,大蒜提取物對(duì)青霉孢子的抑制率受濃度的影響小,抑制效能穩(wěn)定可靠;徐長(zhǎng)卿在較高濃度下抑制率高達(dá)100%,但隨著濃度的降低對(duì)青霉孢子的抑制率大幅度下降,說(shuō)明徐長(zhǎng)卿提取物的抑制作用受濃度影響較大,抑制能力呈典型的濃度依賴型。金銀花提取物隨濃度的梯度下降對(duì)青霉孢子的抑制率下降幅度小,抑制率呈比較平穩(wěn)的態(tài)勢(shì),說(shuō)明金銀花提取物的抑制效果受濃度的影響較小。柴胡和小薊的提取物隨藥物濃度的降低抑制率顯著下降,抑制率快速下降到50%以下,受濃度的影響較大。
本研究以15種常用的清熱解毒類的中藥材的丙酮提取物為篩選對(duì)象,測(cè)試了它們對(duì)3種青霉的抑制性能,并與山梨酸鉀和多菌靈2種常用的防腐殺菌劑做比較,結(jié)果發(fā)現(xiàn),這些藥材提取物對(duì)3種青霉的抑制效果存在巨大差異,成功篩選出抑菌性能明顯強(qiáng)于山梨酸鉀、多菌靈的大蒜和徐長(zhǎng)卿2種藥材,其中,大蒜提取物對(duì)青霉孢子抑制率為100%,完全抑制了青霉孢子的萌發(fā)和生長(zhǎng),且大蒜提取物對(duì)青霉孢子的抑制率受濃度的影響小,表現(xiàn)了高效穩(wěn)定的抑制效能。楊光等[18]研究了大蒜水提液對(duì)青霉的抑制作用并用抑菌圈試驗(yàn)證明了大蒜水提物有明顯的抑制青霉的作用,這說(shuō)明大蒜的脂溶性成分和水溶性成分均表現(xiàn)出高效抑制青霉的能力,非常適合開(kāi)發(fā)成新型抑殺青霉菌的藥物。金銀花、柴胡、小薊和黃柏有明顯的抑制效果,抑制率為56.7%~81.8%;黃芪、板藍(lán)根和黃連不僅無(wú)抑制效果甚至還能促進(jìn)其生長(zhǎng)。作為陽(yáng)性對(duì)照的山梨酸鉀僅對(duì)青霉孢子抑制效果好,多菌靈對(duì)青霉幾乎無(wú)抑制作用。徐長(zhǎng)卿提取物隨著濃度的降低對(duì)青霉孢子的抑制率大幅度下降,抑制能力呈典型的濃度依賴型;金銀花提取物的抑制效果受濃度的影響較?。徊窈托∷E的提取物隨藥物濃度的降低抑制率顯著下降,受濃度的影響較大。
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Inhibitory Effect of 15 Kinds of Herbal Medicine Lipophilic Extracts onPenicilliumSpore
ZHANGTengxiao1,WANGBin1,WEI Yadong2
(1.College ofFood and Pharmaceutical Engineering,Suihua University,Suihua 152061,China;2.College ofAgricultural and Hydraulic Engineering,Suihua University,Suihua 152061,China)
Penicillium is a kind offungus with excellent adaptation environment ability and secreting a variety of toxins,it is one of the main microorganisms caused serious food spoilage and deterioration of edible fungus infection.Extraction of fat soluble components from 15 kinds of herbal medicine materials by acetone,the 15 kinds of herbal medicine materials were cirsii herba,bupleuri radix,dictamni cortex,lonicerae japonicae flos,phellodendri chinensis cortex,cynanchi paniculati radix et rhizoma,sophorae flavescentis radix, rhei radix et rhizoma,schizonepetae herba,astragali radix,istidis radix,pseudolaricis cortex,granati pericarpium,coptidis rhizoma,allii ativi bulbus.The inhibitory effect of 15 kinds of herbal medicine extracts on Penicillium citrinum,Penicillium citreoviride,Penicillium chrysogenum were investigated by the method of plate coating,comparison of the control of potassium sorbate and carbendazim.The results showed that the inhibitory effect ofthese extracts on 3 kinds of Penicillium spore was different,allii ativi bulbus and cynanchi paniculati radix et rhizoma had the best inhibitory effect,its inhibition rate was close to 100%.Lonicerae japonicae flos,bupleuri radix,cirsii herba,phellodendri chinensis cortex had good effect to Penicillium spore,the inhibition rate was 56.7%-81.8%.Astragali radix,istidis radix and coptidis rhizoma had none inhibitory effect,on the contrary,they could promote the germination and growth.Positive control of potassiumsorbate had good inhibitoryeffect,but carbendazimalmost ineffective to Penicillium spore.For extract ofallii ativi bulbus inhibition and lonicerae japonicae flos inhibition efficiencywas affected bythe concentration weakly,inhibition efficiencywas stable and reliable.Extract of sophorae flavescentis radix,bupleuri radix,cirsii herba,whose inhibition ability was decreased with the decrease of the concentration,and those herbal medicine extract was a typical concentration dependent manner.
Penicillium;spore;edible fungi;herbal medicine;acetone;extract
S482.2
A
1002-2481(2016)09-1351-05
10.3969/j.issn.1002-2481.2016.09.30
2016-04-27
綏化市科技計(jì)劃資助項(xiàng)目(KJZD20130085)
張騰霄(1982-),男,山東兗州人,講師,碩士,主要從事微生物應(yīng)用、食用菌繁育技術(shù)及發(fā)酵技術(shù)的教學(xué)及研究工作。