根結(jié)線蟲提取液對番茄愈傷組織誘導(dǎo)的影響

孫亮亮，江春，張超，陳林晶，夏雨，張雅清

（1.晉中學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院，山西晉中030600；2.山西農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，山西太谷030801）

根結(jié)線蟲提取液對番茄愈傷組織誘導(dǎo)的影響

孫亮亮1，2，江春1，張超1，陳林晶1，夏雨1，張雅清1

（1.晉中學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院，山西晉中030600；2.山西農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，山西太谷030801）

采用不同濃度的南方根結(jié)線蟲浸泡培養(yǎng)液和研磨液配制成番茄培養(yǎng)基，以期加快番茄葉片愈傷組織的形成。結(jié)果表明，MS為較適的基礎(chǔ)培養(yǎng)基，MS培養(yǎng)基中添加一定量的根結(jié)線蟲提取液，番茄葉片愈傷組織誘導(dǎo)率明顯提高；根結(jié)線蟲浸泡液的較適濃度為A4，誘導(dǎo)率為85%；根結(jié)線蟲研磨液的較適濃度為B3，誘導(dǎo)率為93%；根結(jié)線蟲研磨液培養(yǎng)基優(yōu)于根結(jié)線蟲浸泡液培養(yǎng)基。

根結(jié)線蟲；提取液；番茄葉片；愈傷組織

南方根結(jié)線蟲（M.incognita）作為一種病原性農(nóng)業(yè)土壤害蟲，廣泛分布于世界各地，是為害農(nóng)業(yè)作物、林業(yè)植物最嚴(yán)重的病原生物之一[1]。

近年來，由于輪作無法實(shí)現(xiàn)土地休耕，導(dǎo)致蔬菜種植區(qū)土壤中蟲口基數(shù)不斷增多，蔬菜根結(jié)線蟲為害日趨嚴(yán)重，嚴(yán)重影響到了蔬菜的產(chǎn)量和質(zhì)量，一般致使蔬菜減產(chǎn)20%～50%[2]；而且根結(jié)線蟲還加重了枯萎病、根腐病等土傳性病害的發(fā)生，已成為當(dāng)前蔬菜生產(chǎn)上的一大障礙[3-4]。根結(jié)線蟲主要侵染植物根部，尤其側(cè)根受害較多，其為害主要表現(xiàn)在2個(gè)方面：一方面，根結(jié)線蟲口針刺激寄生部位細(xì)胞，產(chǎn)生巨型細(xì)胞或在植物根部形成根結(jié)，這些根結(jié)從形態(tài)上和生理功能上改變根系的正常疏導(dǎo)功能[5-6]；另一方面，根結(jié)線蟲侵入造成的傷口易被其他病原物侵入，形成復(fù)合病害[7-8]。受害病株矮小，生長不良，結(jié)實(shí)少，干旱時(shí)中午萎蔫或提早枯死。到目前為止，國內(nèi)對于番茄根結(jié)線蟲在防治方面研究較多[9]，其包括農(nóng)業(yè)防治、物理防治、化學(xué)防治、生物防治等[10-12]，但關(guān)于將根結(jié)線蟲浸泡培養(yǎng)液和研磨液配制成植物培養(yǎng)基，以期加快植物葉片愈傷組織快速形成的研究尚無報(bào)道。植物組織培養(yǎng)是在離體條件下，在適合的培養(yǎng)基上誘導(dǎo)植物外植體，將有組織有結(jié)構(gòu)的高度分化的植物體細(xì)胞經(jīng)過脫分化，變?yōu)闊o特定組織結(jié)構(gòu)的薄壁細(xì)胞團(tuán)，并使細(xì)胞重新進(jìn)入分裂狀態(tài)[13]，從而形成愈傷組織。

本研究以加入根結(jié)線蟲提取液和研磨液制成培養(yǎng)基培養(yǎng)番茄葉片誘導(dǎo)植物愈傷組織形成，以期找出較適濃度的根結(jié)線蟲提取液培養(yǎng)基，為加快、加大誘導(dǎo)植物組培產(chǎn)生愈傷組織提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試番茄品種為阿佛拉。選擇生長健壯、無病蟲害的幼嫩番茄葉片作為材料。

供試根結(jié)線蟲由晉中市榆次區(qū)下戈村溫室棚土壤中分離。

1.2 方法

1.2.1 番茄葉片的處理先用軟刷刷凈番茄葉片表面附著物，然后在一定濃度的吐溫20溶液中浸泡15 min；再將浸泡好的葉片放入小燒杯中，罩上紗布，流水下沖洗30 min左右。將沖洗好的葉片裝進(jìn)無菌三角瓶中，置于超凈工作臺上，首先加入75%酒精浸泡30 s，倒出酒精加入無菌水沖洗2～3次；其次加入0.1%HgCl2浸泡8 min，倒出HgCl2溶液加入無菌水沖洗3～5次；最后將無菌葉片切成0.5 cm×0.5 cm左右的小塊，葉面朝上接種于準(zhǔn)備好的培養(yǎng)基中，每瓶接4～6塊葉片[14]。

1.2.2 根結(jié)線蟲的處理

1.2.2.1 根結(jié)線蟲的獲取在體視解剖鏡下解剖感病嚴(yán)重的番茄根部，并從中分離根結(jié)線蟲卵囊，置于26℃無菌水中培養(yǎng)，孵化出2齡幼蟲（圖1）[15]。

1.2.2.2 根結(jié)線蟲的處理室溫條件下，分別將10，20，30，40，50條根結(jié)線蟲在少量蒸餾水中培養(yǎng)24 h，后各自過濾取濾液，每份濾液加蒸餾水定容至50 mL，對應(yīng)標(biāo)記為A1，A2，A3，A4，A5，即為不同濃度的根結(jié)線蟲浸泡液。

將10，20，30，40，50條根結(jié)線蟲分別放入研缽中，加入石英砂研磨，用少量蒸餾水溶解研磨液，過濾取濾液，每份濾液定容至50 mL，對應(yīng)標(biāo)記為B1，B2，B3，B4，B5，即為不同濃度的根結(jié)線蟲研磨液。

1.3 培養(yǎng)基

以MS為基礎(chǔ)培養(yǎng)基[16]（基本培養(yǎng)基試驗(yàn)除外），添加不同濃度的根結(jié)線蟲浸泡液或研磨液10 mL/L，蔗糖30 g/L，瓊脂4.2 g/L，pH值調(diào)至5.8。

1.4 培養(yǎng)條件

培養(yǎng)溫度為（22～26）℃，光照時(shí)數(shù)為12 h/d，光照強(qiáng)度為2 000 lx。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同培養(yǎng)基對番茄葉片愈傷組織誘導(dǎo)的影響

把處理好的番茄葉片接入表1所示的不同培養(yǎng)基中，觀察統(tǒng)計(jì)愈傷組織的誘導(dǎo)率。

表1 不同培養(yǎng)基對番茄葉片愈傷組織誘導(dǎo)的影響

從表1可以看出，在培養(yǎng)基中不添加根結(jié)線蟲提取液的情況下，番茄葉片愈傷組織誘導(dǎo)率普遍較低。并且，在培養(yǎng)過程中觀察到，B5培養(yǎng)基的葉片只出現(xiàn)卷曲現(xiàn)象，不能誘發(fā)愈傷組織的形成，誘導(dǎo)率為0；MS和1/2 MS培養(yǎng)基都能誘導(dǎo)出愈傷組織，MS培養(yǎng)基誘導(dǎo)率高于1/2 MS。所以，番茄葉片誘導(dǎo)愈傷組織較適的基礎(chǔ)培養(yǎng)基為MS（圖2，3）。

2.2 不同濃度根結(jié)線蟲浸泡液對番茄愈傷組織誘導(dǎo)的影響

由表2可知，MS培養(yǎng)基中添加不同濃度的根結(jié)線蟲浸泡液，愈傷組織誘導(dǎo)率明顯增大，且隨著浸泡液濃度的增加，其誘導(dǎo)率逐步增大，當(dāng)根結(jié)線蟲浸泡液濃度為A4時(shí)，番茄葉片愈傷組織的誘導(dǎo)最大，為85%（圖4）；但當(dāng)浸泡液濃度繼續(xù)增至A5時(shí)，其誘導(dǎo)率反而減小。

表2 不同濃度根結(jié)線蟲浸泡液對番茄愈傷組織誘導(dǎo)的影響

2.3 不同濃度根結(jié)線蟲研磨液對番茄愈傷組織誘導(dǎo)的影響

由表3可知，在添加根結(jié)線蟲研磨液的MS培養(yǎng)基中，愈傷組織誘導(dǎo)率明顯增大，但高濃度的根結(jié)線蟲研磨液不利于番茄愈傷組織的誘導(dǎo)。隨研磨液濃度增加，誘導(dǎo)率先增大后減小，當(dāng)根結(jié)線蟲研磨液濃度為B3時(shí)，番茄葉片愈傷組織誘導(dǎo)最大，為93%（圖5）；當(dāng)研磨液濃度增至B5時(shí)，誘導(dǎo)率最低。

表3 不同濃度根結(jié)線蟲研磨液對番茄愈傷組織誘導(dǎo)的影響

3 討論

本試驗(yàn)結(jié)果表明，根結(jié)線蟲研磨液誘導(dǎo)率優(yōu)于浸泡液，其原因可能是由于研磨液中含有浸泡液中所不含的某種可以促進(jìn)番茄葉片愈傷化的物質(zhì)，或者通過研磨線蟲更能充分提取到具有誘導(dǎo)番茄葉片愈傷化的物質(zhì)。但高濃度的研磨液誘導(dǎo)率明顯減小，可能是由于根結(jié)線蟲體內(nèi)含有對植物有害的物質(zhì)，或者是由于根結(jié)線蟲研磨液對誘導(dǎo)番茄葉片愈傷化具有低濃度促進(jìn)、高濃度抑制的作用效應(yīng)，這還有待進(jìn)一步研究。

愈傷組織具有高度的胚性或再分化能力、可獲得再生植株及具有旺盛的自我增殖能力、經(jīng)過長期繼代保存而不喪失胚性等的優(yōu)良特性[17]，在適宜培養(yǎng)基培養(yǎng)下，愈傷組織上會分化出芽點(diǎn)并陸續(xù)分化形成具有生長點(diǎn)的不定芽[18]。本試驗(yàn)在添加根結(jié)線蟲提取液的培養(yǎng)基中培養(yǎng)出愈傷組織，進(jìn)一步證實(shí)根結(jié)線蟲提取液對愈傷組織的形成有明顯促進(jìn)作用。

4 結(jié)論

本試驗(yàn)表明，MS為較適基礎(chǔ)培養(yǎng)基，在MS培養(yǎng)基中添加根結(jié)線蟲提取液，番茄葉片愈傷組織誘導(dǎo)率明顯增大。其中，根結(jié)線蟲浸泡液的較適濃度為A4，誘導(dǎo)率達(dá)85%；根結(jié)線蟲研磨液的較適濃度為B3，誘導(dǎo)率達(dá)93%，根結(jié)線蟲研磨液培養(yǎng)基優(yōu)于根結(jié)線蟲浸泡液培養(yǎng)基。所以，番茄葉片愈傷組織誘導(dǎo)的較適根結(jié)線蟲培養(yǎng)基為根結(jié)線蟲研磨液B3。

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Influence of Extract of Root-knot Nematodes on Tomato Callus Induction

SUNLiangliang1，2，JIANGChun1，ZHANGChao1，CHENLinjing1，XIAYu1，ZHANGYaqing1
（1.College ofLife Sciences，JinzhongUniversity，Jinzhong030600，China；2.College ofAgronomy，Shanxi Agricultural University，Taigu 030801，China）

Tomato culture medium was prepared by different concentrations of two kinds of root-knot nematodes'extract（grinding extract and soaking extract）,and to accelerate formation of tomato-leaf callus.The results showed that MS was the better medium.The medium which mixed with a certain amount of root-knot nematodes'extract could improve the probability of inducing tomato-leaf to callus.The better root-knot nematodes'soaking and grinding extract density of medium were A4 and B3,and their inductivities were 85%and 93%,respectively.And the mediumwith root-knot nematodes'grindingextract was better than soaking.

root-knot nematode;extract;tomato-leaf;callus

S641.2

A

1002-2481（2016）09-1345-03

10.3969/j.issn.1002-2481.2016.09.28

2016-05-06

省級大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練項(xiàng)目（2014417）

孫亮亮（1989-），男，河南周口人，在讀碩士，研究方向：種子科學(xué)與技術(shù)。江春為通信作者。