基于生物信息學(xué)方法的蕎麥屬microRNAs及其靶基因預(yù)測

高帆，宋韡，謝樹蓮

（1.山西大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，山西太原030006；2.山西體育職業(yè)學(xué)院，山西太原030006）

基于生物信息學(xué)方法的蕎麥屬microRNAs及其靶基因預(yù)測

高帆1，宋韡2，謝樹蓮1

（1.山西大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，山西太原030006；2.山西體育職業(yè)學(xué)院，山西太原030006）

MicroRNA是一類具有轉(zhuǎn)錄后基因調(diào)控功能的非編碼小分子RNA。以傳統(tǒng)的試驗(yàn)方法發(fā)現(xiàn)和鑒定新的miRNA是一項(xiàng)繁瑣的工作。以生物信息學(xué)方法從數(shù)據(jù)庫中篩選miRNAs及其靶基因能夠極大地提高效率。植物中已報(bào)道了大量的miRNAs，但蕎麥屬的尚未見報(bào)道。通過蕎麥ESTs和GSSs的嚴(yán)格篩選，共預(yù)測到13個(gè)蕎麥屬miRNAs（分屬11個(gè)miRNA家族）。預(yù)測的miRNAs在不同的植物中表現(xiàn)出保守性，miRNA家族成員表現(xiàn)出多樣性。共預(yù)測到17個(gè)潛在的靶基因，這些靶基因的功能包括代謝、生長發(fā)育、脅迫響應(yīng)、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)等，表明miRNAs在植物生命活動(dòng)中具有重要作用。miRNA家族系統(tǒng)進(jìn)化分析表明，金蕎麥的miRNAs進(jìn)化與甜蕎麥關(guān)系密切。以生物信息學(xué)方法從已知的數(shù)據(jù)庫中預(yù)測并挖掘蕎麥屬新的miRNAs及其靶基因是可行的。

MicroRNA（miRNA）；生物信息學(xué)；蕎麥屬；靶基因

蕎麥屬（Fagopyrum）是蓼科（Polygonaceae）植物中被人們熟知的類群，其中，有些種是常見雜糧作物，如甜蕎麥（F.esculentum）和苦蕎麥（F.tataricum）在許多國家都有栽培[1]；有的種具有藥用價(jià)值[2]，如苦蕎麥、金蕎麥（F.cymosum）和其他一些野生種的提取物具有降低血糖和血脂[3-5]、抗菌、抗氧化等功效[6-7]。發(fā)展和提高作物產(chǎn)量、有效改善作物品質(zhì)、挖掘并探究某些作物特殊的藥用成分及其作用機(jī)制是當(dāng)前作物研究的熱點(diǎn)[8-9]。預(yù)測并鑒定蕎麥microRNAs（miRNAs）及其靶基因，探究靶基因轉(zhuǎn)錄后表達(dá)調(diào)控機(jī)制將有助于進(jìn)一步了解蕎麥生長發(fā)育、營養(yǎng)代謝、藥用機(jī)制以及遺傳進(jìn)化的詳細(xì)進(jìn)程。

miRNA是一類具有調(diào)控功能的非編碼小分子RNA。Lee等[10]在秀麗隱桿線蟲（Caenorhabditis elegans）中首次發(fā)現(xiàn)了這類特殊的RNA分子。大多數(shù)miRNAs長度約為19～25 nt[11]。RNA聚合酶II和III在miRNA基因轉(zhuǎn)錄中起著重要作用[12]。研究顯示，miRNAs在植物生長發(fā)育、生物代謝、脅迫響應(yīng)、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)及其他生命活動(dòng)中均發(fā)揮著重要的作用[13]。自2002年以來，植物miRNA的研究有了快速地發(fā)展[14]。截止2016年8月，miRBase數(shù)據(jù)庫已正式公布了33種植物共約8 450條miRNAs[15]。盡管如此，作為一種重要的小雜糧作物，蕎麥的miRNAs還未有任何報(bào)道。預(yù)測蕎麥屬miRNAs將擴(kuò)展植物miRNAs信息，并有助于深入研究該作物生命活動(dòng)過程中的某些基因的表達(dá)調(diào)控機(jī)制。這將為定向改良蕎麥種質(zhì)，詳細(xì)了解其藥用機(jī)理，高效、精準(zhǔn)、充分地利用現(xiàn)有蕎麥資源，提高我國蕎麥品質(zhì)奠定基礎(chǔ)。

目前，獲得miRNAs的主要方法有直接克隆[16]、正向遺傳[17]、深度測序[18-19]和生物信息[20]。由于材料獲取和試驗(yàn)成本等方面的困難，生物信息學(xué)方法以其簡單、快速、高效而倍受研究者的青睞[21-22]。與動(dòng)物相比，一些植物的miRNA序列相對保守[23]，因此，通過生物信息學(xué)方法預(yù)測蕎麥屬miRNAs是可行的[24]。

本研究利用蕎麥的ESTs和GSSs數(shù)據(jù)庫，以已知植物miRNAs為探針，采用多種生物信息手段篩選候選序列并預(yù)測其前體結(jié)構(gòu)，最終確定了蕎麥的miRNAs，此外還預(yù)測了miRANs的靶基因及其功能，最后分析了蕎麥miRNAs在植物中的保守性、多樣性及其不同家族間的系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系。

1 材料和方法

1.1 序列獲得

從miRBase21.0數(shù)據(jù)庫中（http://www.mirbase. org/）下載所有植物的miRNAs及其前體序列，去除冗余序列，保留的序列在同一miRNAs家族中不重復(fù)并按照不同種類分組。由于蕎麥的全基因組測序尚未完成，本研究以ESTs（273條）和GSSs（85條）為模板序列（從Genbank中下載獲得，http://www. ncbi.nlm.nih.gov），以整理的植物miRNAs數(shù)據(jù)庫為搜索序列，通過多重序列比對獲取同源性較高的序列作為蕎麥候選miRNA序列。

1.2 潛在miRNA序列的預(yù)測

通過考察候選miRNA序列，并將其與Rfam（http://rfam.sanger.ac.uk）及Genbank數(shù)據(jù)庫比對，從中可獲得潛在的蕎麥miRNAs[25]。根據(jù)以下原則篩選miRNA序列：（1）不一致的堿基不超過3個(gè)；（2）百分比不超過（L-4＋m）/L，其中，L是長度（堿基數(shù)），m是不一致的堿基數(shù)；（3）去除tRNA和rRNA及蛋白編碼序列[26-27]；（4）去除重復(fù)序列。

1.3 前體miRNA次級結(jié)構(gòu)的預(yù)測

為了進(jìn)一步確認(rèn)潛在的miRNA序列為蕎麥miRNAs，同時(shí)考察其前體是否能形成典型的頸環(huán)狀二級結(jié)構(gòu)，是否含有星狀miRNA（miRNA*），本研究對蕎麥miRNA的前體進(jìn)行了預(yù)測。根據(jù)有關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道，植物中前體miRNA長度通常約為144.57±56.91 nt[28]，本研究以200 nt miRNAs上游和下游序列包括其本身作為源序列，分析預(yù)測前體序列的二級結(jié)構(gòu)[29]，長度限于60～250 nt。參數(shù)設(shè)置為：（1）選擇概率值為0.5；（2）掃描窗口值為5個(gè)堿基對、延伸窗口值為3個(gè)堿基對；（3）所需的前體miRNA構(gòu)建次級結(jié)構(gòu)，其中，miRNA和miRNA*必需位于“發(fā)夾”結(jié)構(gòu)的一個(gè)臂上；（4）在臂上沒有更大或更多的隆起結(jié)構(gòu)；（5）最小折疊自由能不超過-75.3 kJ/mol；（6）（A＋U）占比在30%～70%；（7）不一致的堿基數(shù)目不超過6，在miRNA和其互補(bǔ)鏈中無環(huán)狀結(jié)構(gòu)或間斷出現(xiàn)。

1.4 靶基因的預(yù)測

用WMD3在線分析軟件（http://wmd3.weigelworld.org/）結(jié)合BLASTX及Pfam軟件（http://pfam. sanger.ac.uk/）預(yù)測并分析miRNAs靶基因及其功能[25-27]，預(yù)測原則為：（1）不一致的堿基數(shù)不超過5個(gè)；（2）在位點(diǎn)2～12之間不一致的堿基數(shù)不超過1個(gè)，其中在位點(diǎn)10～11之間不允許有堿基錯(cuò)配；（3）在位點(diǎn)13～21之間錯(cuò)配的堿基數(shù)不超過4個(gè)，且不能有2個(gè)連續(xù)的錯(cuò)配堿基；（4）選擇的結(jié)構(gòu)具有最低的MFE值和最高的最小折疊自由能指數(shù)（MFEI）[30]。以WMD3中主要植物的mRNAs作為模板序列，包括模式植物和主要作物，如擬南芥、水稻和玉米。由于WMD3和Pfam中尚未公布蕎麥mRNAs信息，本研究以ESTs和Genbank中的mRNAs作為比對數(shù)據(jù)。

1.5 miRNA的保守性、多樣性及其家族成員間的系統(tǒng)進(jìn)化分析

通過BLASTn比對分析不同植物中miRNAs的保守性[31-32]，進(jìn)而分析不同種中miRNA家族成員的數(shù)目及其保守性和多樣性。在此基礎(chǔ)上，利用MEGA3.1工具，以鄰接法構(gòu)建不同蕎麥miRNAs家族成員間的系統(tǒng)進(jìn)化樹[33]。

2 結(jié)果與分析

2.1 miRNAs及其前體序列預(yù)測與特征分析

本研究從數(shù)據(jù)庫中下載獲得了33種植物的miRNAs，通過序列比對在蕎麥中預(yù)測到13個(gè)新的miRNAs，篩選率僅為1.1%（表1）。

從表2可以看出，這13個(gè)預(yù)測的miRNAs的長度為17～23 nt，符合植物miRNA長度的標(biāo)準(zhǔn)[34]。有文獻(xiàn)報(bào)道，miRNA中（A＋U）比例高于（G＋C），但也不絕對[35]。本研究結(jié)果中（A＋U）在35.30%～73.68 %，基本與文獻(xiàn)報(bào)道一致。

從圖1可以看出，本研究獲得的所有前體具有典型的“發(fā)夾”結(jié)構(gòu)，miRNAs總是位于前體結(jié)構(gòu)的一個(gè)臂上，以5′端居多。前體miRNAs長度為66～153 nt，平均106.77 nt，大于動(dòng)物（70～80 nt）的長度[30]。研究表明，miRNAs的MFEI應(yīng)不小于0.85，本研究結(jié)果在1.22～3.84，因此，預(yù)測結(jié)果是基本可信的。13個(gè)預(yù)測的miRNAs隸屬11個(gè)miRNA家族，fes-miR162和fcy-miR1298家族各有2個(gè)，其余家族各有1個(gè)。

表1 潛在和特有的小分子RNAs匯總

表2 預(yù)測的蕎麥中miRNAs及特征

2.2miRNAs的保守性和多樣性預(yù)測

本研究采用序列比對的方法分析了蕎麥miRNAs的保守性和多樣性。結(jié)果表明，大多數(shù)miRNAs家族是保守的，但miR162家族例外（圖2）。miR473和miR1298家族在5′端的前4個(gè)堿基完全相同，與有關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道一致[36]。其他miRNAs也顯示出與水稻、擬南芥、玉米、葡萄、毛果楊和小立碗蘚的同源性。不同植物miRNAs的保守性也在一定程度上反映出其進(jìn)化的保守性。

從圖2還可以看出，fcy-miR1298a與現(xiàn)代人的hsa-miR-1298以及小鼠的mmu-miR-1298高度相似，僅在第15個(gè)位點(diǎn)有1個(gè)堿基的差異。在三者中發(fā)現(xiàn)的miR1298具有如此高的相似率是值得注意的，通常不同物種間miRNAs的保守現(xiàn)象只見于同界的不同種類中[37-38]，并且其調(diào)控的靶基因產(chǎn)物往往相似。然而，動(dòng)物和植物間miRNAs的保守性通常不高，且其基因產(chǎn)物往往不同。由于這3個(gè)物種的miR1298靶基因均是未知蛋白，并且三者的前體miRNA序列和結(jié)構(gòu)完全不同。因此，不能單純地從miR1298成熟體的保守性來推測其在人類和小鼠中也完全是保守的。

本研究發(fā)現(xiàn)蕎麥中預(yù)測的13個(gè)miRNAs也存在于其他植物中（表3），miR378，miR542，miR671和miR1298家族至少存在于10種植物中。同時(shí)，本研究也發(fā)現(xiàn)一些罕見的miRNAs，如miR3979，miR5038和miR2916，僅見于1種植物中，基本屬于物種特異miRNAs（novel miRNAs），這也反映了植物miRNAs的多樣性。

表3 預(yù)測的miRNAs家族靶標(biāo)信息

2.3 靶基因及其功能預(yù)測

基于植物miRNAs與其靶位點(diǎn)間嚴(yán)格堿基互補(bǔ)的原則，本研究預(yù)測了蕎麥miRNAs潛在的靶基因及靶位點(diǎn)[20]，并通過蛋白質(zhì)序列比對預(yù)測了靶基因的功能[27]。本研究通過ESTs從蕎麥的9個(gè)miRNA家族中獲得了17個(gè)靶基因。在fcy-miR2916和fta-miR3979中未預(yù)測到任何靶位點(diǎn)及靶基因。fes-miR473預(yù)測到的靶基因最多（5個(gè)靶基因）。預(yù)測靶基因的功能包括代謝、生長發(fā)育、脅迫響應(yīng)、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)等方面。

9個(gè)靶基因與植物代謝過程相關(guān)，如NP226785編碼非手性馬兜鈴烯合成酶[39]，DY539240編碼pfkB型糖激酶蛋白[40]，AT2G22980.1編碼絲氨酸羧肽酶[41]。這幾個(gè)酶蛋白在植物代謝中均起著十分重要的調(diào)控作用。另外，本研究也預(yù)測了1個(gè)由AT2G17200.1編碼的泛素家族蛋白，與生物體的蛋白質(zhì)降解、細(xì)胞分裂、發(fā)育、免疫和其他一些復(fù)雜的生理過程緊密相關(guān)[42]。由BM038209編碼的單鏈脫氧核糖核酸結(jié)合蛋白是DNA復(fù)制過程中的一種重要蛋白[43]。更多關(guān)于fta-miR632家族基因的研究將有助于更好地了解真核細(xì)胞DNA復(fù)制的調(diào)控機(jī)制。值得注意的是，1個(gè)由BI800203編碼的與生物脅迫響應(yīng)相關(guān)的靶基因也被預(yù)測到，發(fā)現(xiàn)該基因序列與抗病基因家族（NBS-LRR）中的亮氨酸重復(fù)保守區(qū)十分相似[44]，這對于深入了解蕎麥的抗病機(jī)制有重要意義。其他靶基因可能與生物體的轉(zhuǎn)錄和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)等有關(guān)（表3）。

2.4 生物信息學(xué)預(yù)測蕎麥miRNAs評價(jià)

以生物信息學(xué)方法預(yù)測miRNAs及靶標(biāo)較其他方法簡便且成本低，適用于從那些沒有任何miRNAs信息的物種中獲取miRNAs。但是也存在不足。首先是已報(bào)道的相似RNA序列較少會導(dǎo)致較低的篩選率。本研究中被篩選出的miRNAs所占比例僅為1.1%，低于玉米的5%，原因就在于玉米已報(bào)道的相似序列較多[45]。因此，對于蕎麥miRNAs的深度挖掘，該種屬的高通量測序工作仍是十分必要的。其次，信息學(xué)手段預(yù)測到的miRNAs還需要進(jìn)一步的試驗(yàn)驗(yàn)證。如反轉(zhuǎn)錄實(shí)時(shí)定量PCR，RNA干擾實(shí)驗(yàn)，過表達(dá)，northern雜交等，以及進(jìn)一步地分析miRNAs調(diào)控下的靶基因在不同組織、不同器官、不同發(fā)育階段的表達(dá)和目的蛋白的功能。這些驗(yàn)證結(jié)果將有助于詳細(xì)地了解在蕎麥miRNAs是如何具體調(diào)控轉(zhuǎn)錄后基因表達(dá)的。

2.5 蕎麥miRNAs系統(tǒng)進(jìn)化分析

對蕎麥屬不同miRNA家族的前體序列進(jìn)行聚類，分析不同miRNA家族成員間的系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系。由圖3可知，所有miRNAs被分成3組。組I含有的家族成員數(shù)最多（9個(gè)家族成員），其又可分為2個(gè)亞組。從圖3還可以看出，同一家族的miRNAs通常聚在一起且遺傳一致性為100%，說明了同一家族miRNAs成員間的進(jìn)化保守性。不同家族成員的miRNAs通常不會聚到一起，如組Ⅱ和組Ⅲ中fta和fes-miRNA家族分別聚類在2個(gè)組中，其原因可能是：一方面預(yù)測到的miRNA基因家族成員數(shù)較少，造成比對數(shù)據(jù)范圍狹窄；另一方面，可能是這些m iRNAs確實(shí)參與調(diào)控了該物種不同的生理生化活動(dòng)[33]。

有研究報(bào)道了蕎麥的起源問題[46]，認(rèn)為甜蕎起源于我國西南部較溫暖地區(qū)，其祖先是大野蕎（F. megaspartanium），苦蕎起源于青藏高原東部海拔較高的寒冷地區(qū)，其祖先是毛野蕎（F.pilus）。圖3顯示，金蕎麥的3個(gè)miRNAs均與甜蕎的miRNAs聚為一簇，這似乎也暗示了2個(gè)物種的親緣關(guān)系較近?？紤]到金蕎麥多為野生，廣泛分布于與甜蕎起源地氣候條件相似的溫暖潮濕地區(qū)[47]，本研究推測金蕎麥與甜蕎可能有共同的祖先——大野蕎，甜蕎可能是大野蕎經(jīng)過長期進(jìn)化，其中一部分種經(jīng)過人為采集、種植、馴化逐漸演變成的栽培種；金蕎麥則進(jìn)化相對保守，未經(jīng)過人為馴化或不適宜大面積種植，僅能適應(yīng)原始的野生條件。

3 結(jié)論

本研究以生物信息學(xué)方法預(yù)測了蕎麥屬的13個(gè)miRNAs，屬于11個(gè)miRNA家族。不同物種間的miRNAs序列既有保守性，也有多樣性；蕎麥miR1298家族與智人和家鼠同源性很高，推測其在動(dòng)植物界中可能廣泛存在。本研究共預(yù)測到17個(gè)靶基因，其中多數(shù)與植物的代謝調(diào)控有關(guān)。不同蕎麥種間的miRNA家族系統(tǒng)進(jìn)化分析顯示，甜蕎與金蕎麥可能起源于共同的祖先。本研究有助于蕎麥屬miRNAs及靶基因表達(dá)調(diào)控機(jī)制的研究，這對蕎麥的生長調(diào)控、抗病、藥理、遺傳和進(jìn)化等方面的研究具有十分重要的意義。

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Prediction of microRNAs and Their Target Genes Using Bioinformatics Methods in GenusFagopyrum

GAOFan1，SONGWei2，XIE Shulian1

（1.College ofLife Sciences，Shanxi University，Taiyuan 030006，China；2.Shanxi Sports Vocational School，Taiyuan 030006，China）

MicroRNAs（miRNAs）are small molecular non-coding RNAs which play important roles in post-transcriptional gene regulation.Discovering and identifying newmiRNAs is tedious using traditional experimental methods.Searching for miRNAs from RNA databases with bioinformatics methods can improve the efficiency of seeking new miRNAs and their targeted genes greatly.A large number ofmiRNAs are reported in plants,but research on the genusFagopyrumhas returned no results so far.After prediction searching expressed sequence tags（ESTs）and genome survey sequences（GSSs）from buckwheat with miRNAs reported from all plants,we predicted 13 miRNAs in 11 miRNA families using strict screening.The predicted miRNAs sequences embodied conservative in different plants,but the number of the miRNAs distribution embodied diverse.Seventeen potential targets were predicted by our analysis of the predicted miRNAs with mRNAs and ESTs in plants.The targeted proteins were necessary in metabolism,growth and development,stress response,signal transduction and so on,which suggested the miRNAs played an essential role in life processes.Phylogenetic analysis suggested that miRNAs evolution ofF.cymosummight be related withF.esculentum's.Discovered and identified newmiRNAs and their targeted genes in genusFagopyrumfromthe known databases with bioinformatics methods should be feasible.

MicroRNA（miRNA）;bioinformatics;Fagopyrum;target gene

Q752

A

1002-2481（2016）09-1237-07

10.3969/j.issn.1002-2481.2016.09.01

2016-04-05

山西省煤基重點(diǎn)科技攻關(guān)項(xiàng)目（FT201402-15）

高帆（1985-），男，山西長治人，實(shí)驗(yàn)師，博士，主要從事生物信息研究工作。謝樹蓮為通信作者。