沙棘葉中科羅索酸濃縮物的測(cè)定方法

張璐，田曉東，王斌，張瓊姝，張吉科，郭海利，張小民

（1.山西大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，山西太原030006；2.山西金科海生物科技有限公司，山西太原030006）

沙棘葉中科羅索酸濃縮物的測(cè)定方法

張璐1，田曉東1，王斌1，張瓊姝1，張吉科2，郭海利2，張小民1

（1.山西大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，山西太原030006；2.山西金科海生物科技有限公司，山西太原030006）

對(duì)沙棘葉中科羅索酸的濃縮和提取方法進(jìn)行了初步探究，提出了沙棘葉中科羅索酸含量的測(cè)定方法。結(jié)果顯示，最佳提取方法是水-乙醇提取法，提取率為0.8%；提取物測(cè)定的色譜條件為：20RBAXSB-C18（4.6 mm× 250 mm，5 μm）色譜柱，以甲醇-0.1%冰醋酸水溶液（體積比為88∶12）為流動(dòng)相，檢測(cè)波長(zhǎng)為215 nm，流速為1 mL/min，柱溫為30℃；科羅索酸在0.042 6～0.852 0 mg/mL范圍內(nèi)，峰面積與濃度有著良好的線性關(guān)系，平均回收率為105%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）為1.75%（n＝5）。該提取方法簡(jiǎn)便、安全、無(wú)有機(jī)物殘留，適合于工業(yè)生產(chǎn)；測(cè)定方法準(zhǔn)確、重復(fù)性好，可用于沙棘葉提取物的含量測(cè)定和質(zhì)量控制。

沙棘葉；HPLC；科羅索酸

沙棘（Hippophae rhamnoides L.）又名醋溜、酸刺、黑刺，屬于胡頹子科（Eleaeagnaceae）酸刺屬，是世界上公認(rèn)的珍貴藥食同源植物。其含有428種營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，被譽(yù)為血管的清道夫、心腦血管的克星等。目前，大多研究集中在對(duì)沙棘果實(shí)的研究利用上，用果實(shí)加工成的飲料、食品、保健品、藥品也越來(lái)越多[1]。對(duì)沙棘葉生物活性物質(zhì)的研究主要是集中在黃酮類[2]、多酚類[3]、綠原酸[4]、多糖類[5]等物質(zhì)上，而對(duì)沙棘葉中科羅索酸的提取和濃縮研究尚屬空白。

科羅索酸（corosolic acid）又名2α-羥基熊果酸，是一種五環(huán)三萜類化合物，為熊果酸的衍生物。近年來(lái)，研究表明，科羅索酸具有降血糖、減肥、抗炎、抗腫瘤、抗心血管疾病等藥理作用。尤其是其較好的降血糖活性，具有類似胰島素的作用，被稱為“植物胰島素”[6]。目前，研究較多的是從大花紫薇[7]、枇杷葉[8]、山茱萸[9]中提取分離科羅索酸。姚凌云等[10]從沙棘葉中檢測(cè)到科羅索酸。吳哲等[11]首次通過(guò)高效液相色譜法測(cè)定了科羅索酸的含量。

基于前人的研究，考慮到沙棘葉具有產(chǎn)量大、易收集、采集周期長(zhǎng)、易貯藏等天然優(yōu)勢(shì)，本試驗(yàn)首次以沙棘葉為原料進(jìn)行科羅索酸的濃縮、提取和分離，并通過(guò)高效液相色譜法測(cè)定其提取物中科羅索酸的含量，旨在為沙棘葉提取物的質(zhì)量控制及制劑的開發(fā)提供有效的測(cè)定方法，為進(jìn)一步開發(fā)沙棘藥品和沙棘保健品提供參考。

1 材料和方法

1.1 材料

沙棘葉購(gòu)自山西金科海生物科技有限公司，烘干、粉碎后過(guò)0.18 mm篩備用。科羅索酸（純度98%）對(duì)照品購(gòu)自上海詩(shī)丹德生物技術(shù)有限公司。

1.2 方法

1.2.1 色譜條件色譜柱：20RBA×SB-C18（4.6mm× 250 mm，5 μm）；流動(dòng)相為甲醇∶0.1%冰醋酸＝88∶12；流速為1 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)為215 nm；柱溫為30℃；進(jìn)樣量為10 μL。

1.2.2 供試樣品的制備將采集的沙棘葉烘干，在高速粉碎機(jī)里粉碎成粉末，過(guò)0.18 mm篩。樣品1.稱取一定量的沙棘葉粉末，用濾紙包好直接放入索氏提取器內(nèi)，加入適量的甲醇加熱回流至基本無(wú)色。將提取液經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀旋轉(zhuǎn)濃縮后，得到浸膏，烘干備用。樣品2.稱取一定量的沙棘葉粉末，置于裝有回流冷凝器的圓底燒瓶中，加入適量無(wú)水乙醇，90℃加熱回流3 h，趁熱過(guò)濾，濾液經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀旋轉(zhuǎn)濃縮后，得到浸膏，烘干備用。樣品3.稱取一定量的沙棘葉粉末，在60℃條件下水提2次，過(guò)濾，將濾液倒掉，將濾渣烘干后放入裝有回流冷凝器的圓底燒瓶中，90℃無(wú)水乙醇加熱回流3 h，趁熱過(guò)濾，濾液經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀旋轉(zhuǎn)濃縮后，得到浸膏，烘干備用。

1.2.3 對(duì)照品溶液的制備精密稱取干燥至恒質(zhì)量的科羅索酸20.3 mg，用甲醇超聲溶解后定容至25 mL，即得濃度為0.852 mg/mL的科羅索酸對(duì)照品溶液。

1.2.4 樣品溶液的制備精密稱取沙棘葉甲醇提取物（樣品1）、沙棘葉乙醇提取物（樣品2）以及沙棘葉水-乙醇提取物（樣品3）各3 g，置于100 mL具塞錐形瓶中，加入25 mL石油醚（30～60℃）浸泡40 min，浸泡2次。傾去石油醚，烘干，之后用甲醇冷浸超聲提取2次，每次25 mL，冷浸30 min，超聲40 min，合并提取液，過(guò)濾，濾液轉(zhuǎn)移至100 mL容量瓶中，用甲醇定容至刻度。取適量用0.45 μm微孔濾膜過(guò)濾后備用。

1.2.5 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立精密稱取科羅索酸對(duì)照品21.3 mg，置25 mL容量瓶中，加甲醇適量，超聲處理10 min使其溶解，放冷，稀釋至刻度，搖勻；再精密量取0.5，3，5，7.5，10mL對(duì)照液，分別置于10mL容量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得系列對(duì)照品溶液。分別精密吸取系列對(duì)照品溶液20 μL注入液相色譜儀中測(cè)定，記錄色譜圖的峰面積。以峰面積（Y）為縱坐標(biāo)，進(jìn)樣濃度（X）為橫坐標(biāo)，得到線性方程：y＝5 043.616 2x＋103.287 6（R2＝0.998 5（n＝5）），科羅索酸在0.042 6～0.852 0 mg/mL范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系。

1.2.6 穩(wěn)定性試驗(yàn)精密吸取樣品1溶液20 μL，分別在0，2，4，8，10 h按1.2.1色譜條件進(jìn)樣檢測(cè)，確定試驗(yàn)穩(wěn)定性。

1.2.7 精密度試驗(yàn)取質(zhì)量濃度為0.852 mg/mL對(duì)照品溶液20 μL，連續(xù)進(jìn)樣6次，計(jì)算峰面積，考察儀器的精密度。

1.2.8 重復(fù)性試驗(yàn)取同一批次樣品2粉末3 g，共5份。按照1.2.4條件制備樣品溶液，按照1.2.1色譜條件進(jìn)行檢測(cè)，測(cè)試該方法的重復(fù)性。

1.2.9 加樣回收試驗(yàn)稱取已知含量樣品2粉末5份。每份加入對(duì)照品溶液3.34 mL（0.852 mg/mL）。按照1.2.4方法制備供試液，在1.2.1色譜條件下進(jìn)樣檢測(cè)科羅索酸的含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 穩(wěn)定性和精密度

穩(wěn)定性試驗(yàn)在10 h之內(nèi)含量測(cè)定相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.91%，表明供試樣品溶液穩(wěn)定性較好，可以滿足樣品測(cè)試要求。精密度試驗(yàn)中含量測(cè)定相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.62%，說(shuō)明儀器精密度良好。

2.2 重復(fù)性和回收率

重復(fù)性試驗(yàn)中測(cè)得科羅索酸的平均含量為0.198 8%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.954%（表1）；經(jīng)過(guò)試驗(yàn)，測(cè)得加樣回收率平均為105%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.75%（表2）。

表1 重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果

表2 加樣回收試驗(yàn)結(jié)果

2.3 樣品含量的測(cè)定

按1.2.3，1.2.4條件制備對(duì)照液和樣品供試液，在1.2.1色譜條件下測(cè)試，結(jié)果表明，沙棘葉甲醇提取物科羅索酸含量為0.23%，沙棘葉乙醇提取物科羅索酸含量為0.19%，沙棘葉水-乙醇提取物科羅索酸含量為0.8%。對(duì)照品及樣品色譜圖如圖1～4所示。

3 討論

沙棘含有豐富的生物活性物質(zhì)，具有降血壓、降血脂、抗氧化等多種藥理作用，而且山西作為沙棘資源大省，對(duì)沙棘進(jìn)行更深層次的研究與開發(fā)具有重要的意義。降血糖因子科羅索酸為一種天然五環(huán)三萜酸，其不溶于水，易溶于熱乙醇、甲醇、乙酸乙酯、甲醛等有機(jī)溶劑。其在植物中的含量普遍很低。沙棘葉中科羅索酸含量為0.06%，在其含量較高的枇杷葉中僅為0.5%。賀建榮等[12]以其含量較高的枇杷葉為原料，通過(guò)水煮→低醇除雜→甲醇提取→活性炭脫水→過(guò)濾→濃縮等一系列的步驟得到三萜酸粗品，其科羅索酸含量為4.66%。陳劍鋒[13-14]也通過(guò)一系列的方法從枇杷葉中分離提取了科羅索酸。但其提取工藝都較為復(fù)雜，生產(chǎn)成本高，不利于工業(yè)化生產(chǎn)。本研究參考前人的研究，以甲醇和乙醇為提取劑通過(guò)3種方法對(duì)沙棘葉中的科羅索酸進(jìn)行提取，測(cè)得甲醇提取物中科羅索酸含量為0.23%，乙醇提取物中科羅索酸含量為0.19%，甲醇提取物中的含量略高于乙醇，考慮到甲醇有毒且在提取物中的殘留，故選擇用乙醇作為提取劑，通過(guò)水煮先去除水溶性物質(zhì)，然后再用乙醇提取，含量為0.8%。舒群等[15]研究表明，科羅索酸為20 mg/kg對(duì)糖尿病大鼠有治療作用，如果折算成人的劑量，則沙棘葉提取物中科羅索酸的含量達(dá)到1%便具有治療效果，本研究采用水煮→乙醇提取的方法，科羅索酸提取率達(dá)到0.8%。該提取方法簡(jiǎn)單、安全、成本低，為沙棘降糖保健品的開發(fā)及工業(yè)化生產(chǎn)奠定了基礎(chǔ)。

此外，本試驗(yàn)采用甲醇-水-冰醋酸體系為流動(dòng)相，試驗(yàn)過(guò)程中適當(dāng)降低了有機(jī)相的比例，達(dá)到了較好的分離。紫外光區(qū)在200～400 nm進(jìn)行掃描，測(cè)得最大吸收波長(zhǎng)為215 nm，故選用215 nm作為檢測(cè)波長(zhǎng)。該方法簡(jiǎn)單易行、定量準(zhǔn)確，可作為沙棘葉提取物中科羅索酸含量的測(cè)定方法。

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Method for Determination of Corosolic Acid Concentration in Seabuckthorn Leaf

ZHANG Lu1，TIAN Xiao-dong1，WANG Bin1，ZHANG Qiong-shu1，ZHANG Ji-ke2，GUO Hai-li2，ZHANG Xiao-min1
（1.College of Life Sciences，Shanxi University，Taiyuan 030006，China；2.Shanxi Jinkehai Biological Technology Co.Ltd.，Taiyuan 030006，China）

The concentration and extraction method of corosolic acid in the seabuckthorn leaves was explored preliminarily and the assay method of corosolic acid content from the seabuckthorn leaves extractive was proposed in this paper.The results showed that the best extraction method was water-ethanol extraction method,the extraction rate of0.8%.Chromatographic condition for the determination of extracts:20RBAXSB-C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）column was adopted.The mobile phase was methanol-0.1%acetic acid aqueous solution（88∶12）.The detection wavelength was set at 215 nm,flow rate was 1.0 mL/min,column temperature was 30℃.The concentration of corosolic acid was linear in the range of 0.042 6-0.852 0 mg/mL and the front area and concentration had good linear relationship.The average recovery rate was 105%and the RSD was 1.75%（n＝5）.The method was simple,safe,non-organic residue,it could be used for industrial production.Measuring method was accurate,reproducible,and it could be used for the determination and quality control of sea-buckthorn leaves extract.

seabuckthorn leaves;HPLC;corosolic acid

R284.2

A

1002-2481（2016）01-0030-04

10.3969/j.issn.1002-2481.2016.01.09

2015-09-25

張璐（1990-），女，山西靈石人，在讀碩士，研究方向：沙棘屬植物化學(xué)與藥理。張小民為通信作者。