兩株球孢白僵菌對核桃舉肢蛾幼蟲的感染試驗

王 云，周西貝，陳春艷，張海軍，謝映平

（1.山西大學生命科學學院，山西太原030006；2.陽泉市林業(yè)科學研究所，山西陽泉045000）

兩株球孢白僵菌對核桃舉肢蛾幼蟲的感染試驗

王 云1，周西貝1，陳春艷1，張海軍2，謝映平1

（1.山西大學生命科學學院，山西太原030006；2.陽泉市林業(yè)科學研究所，山西陽泉045000）

核桃舉肢蛾的發(fā)生影響著核桃的產(chǎn)量和品質。為了尋找新的生物防治途徑，于2014年8月從山西盂縣核桃產(chǎn)區(qū)收集受核桃舉肢蛾鉆蛀的蟲果進行解剖觀察，發(fā)現(xiàn)在核桃舉肢蛾鉆蛀的初期、中期、后期和末期，核桃果實受害癥狀呈現(xiàn)不同的特點，包括果皮黑斑、果實內幼蟲蛀食果肉形成的坑道和蛀孔的大小、排泄的蟲糞量、幼蟲的體色和體長。在蟲果內核桃舉肢蛾的幼蟲數(shù)量平均為6～7頭，最多的可達13頭。利用球孢白僵菌的2個菌株TST05和FDB01的孢子懸浮液（孢子濃度為1.0×108個/mL）對新脫果的核桃舉肢蛾老熟幼蟲進行了感染試驗。結果顯示，2菌株對該幼蟲均具有很好的感染和致病效果，感染第2天就表現(xiàn)出染病癥狀，隨后蟲體表面出現(xiàn)菌絲，最后完全被菌絲覆蓋；第8天的校正死亡率分別為87.8%和84.4%；致死中時分別為4.743，4.934 d。

核桃舉肢蛾；球孢白僵菌；感染；生物防治

核桃是我國主要的傳統(tǒng)經(jīng)濟樹種之一，近十幾年來核桃產(chǎn)量穩(wěn)步增長，發(fā)展速度較快。全國核桃總產(chǎn)量由2001年的25.23萬t增加到2011年的165.55萬t[1-2]。山西是核桃主要產(chǎn)區(qū)，目前栽植面積約34萬hm2，產(chǎn)量約9萬t，位居全國前列[3]，對發(fā)展山區(qū)經(jīng)濟和農民脫貧致富具有重要作用。核桃舉肢蛾（Atrijuglans hetaohei Yang）是核桃的蛀果害蟲，其屬鱗翅目（Lepidoptera）舉肢蛾科（Heliodinidae），以幼蟲蛀入果內取食果肉和核仁，受害的核桃果實干縮，果皮變黑，故稱“核桃黑”。在河南、河北、山西、陜西、四川、山東、甘肅、北京等省市均有發(fā)生[4]。山西省的太行山區(qū)是核桃舉肢蛾嚴重發(fā)生區(qū)，盂縣調查數(shù)據(jù)顯示，核桃舉肢蛾危害的蟲果率達60%左右，嚴重的可達90%以上[5]。在陜西商洛，核桃舉肢蛾危害造成的黑果率為82.60%[6]。核桃舉肢蛾的防治以在成蟲期用化學農藥噴灑樹冠為主，但對已經(jīng)蛀入果實內的幼蟲起不到防治作用，而且化學農藥的長期使用造成了農藥殘留、環(huán)境污染和果品安全等問題。

利用昆蟲病原真菌作為生物防治因子對害蟲進行種群控制是當前世界害蟲生物防治的一個發(fā)展方向，其已在松毛蟲等食葉性害蟲的防治中取得顯著成績[7]。David等將球孢白僵菌噴灑在樹干上防治美洲山核桃象鼻蟲（Curculio caryae Horn），致死率可達80%以上[8]。但在防治核桃舉肢蛾這類蛀果害蟲方面還很少有報道，這與害蟲鉆蛀進入果實后施用病原菌制劑無法接觸到害蟲有關。陶訓等[9]利用從桃小食心蟲幼蟲上分離的白僵菌進行防治試驗，結果證明具有較好的感染效果。近幾年，山西大學昆蟲分子與害蟲生物防治實驗室根據(jù)松毛蟲幼蟲、松葉蜂幼蟲和桃小食心蟲幼蟲具有入土越冬習性，研究在土壤中施用昆蟲病原真菌，對害蟲進行防治，結果發(fā)現(xiàn)具有較好的感染效果。同樣，我們發(fā)現(xiàn)，核桃舉肢蛾雖然幼蟲鉆蛀在果實內危害，但秋季幼蟲老熟后會鉆出核桃果實，在核桃樹下表土層內結繭越冬，一直到第2年的五六月份才羽化出土，在土壤中棲息的時間長達9個月。在此期間，對入土的幼蟲進行生物防治，充分利用表土層利于昆蟲病原真菌存活和感染的溫濕度等條件，形成防治核桃舉肢蛾的新技術，從而減少在樹冠上噴灑農藥。

本研究在山西陽泉地區(qū)的盂縣核桃產(chǎn)區(qū)進行布點觀察，采集蟲果，解剖并觀察核桃舉肢蛾幼蟲對核桃果實的蛀食情況，掌握幼蟲的發(fā)育和脫果進度。并利用實驗室從桃小食心蟲幼蟲和松葉蜂幼蟲上分離的2株高致病性球孢白僵菌菌株，對核桃舉肢蛾幼蟲進行感染試驗，旨在為核桃舉肢蛾的生物防治提供參考。

1 材料和方法

1.1 試驗地概況

試驗林地設在山西省陽泉市盂縣南小坪村核桃林。核桃樹為30年生的大樹，樹高為10～15 m，核桃結果較多，未采取任何防治措施，近幾年的蟲果率達80%以上。

1.2 核桃舉肢蛾幼蟲在果實內的危害和脫果觀察

2014年8月中旬，在核桃林地采集被核桃舉肢蛾鉆蛀的蟲果，帶回實驗室進行解剖，鏡檢觀察核桃舉肢蛾幼蟲在果實內的取食和危害情況。根據(jù)果皮黑斑、幼蟲在果內鉆蛀形成的孔和坑道、排泄的蟲糞、幼蟲的體長和體色、幼蟲鉆蛀數(shù)量等指標，分析核桃舉肢蛾幼蟲在果內為害的時間長短和發(fā)育進度。并觀察核桃舉肢蛾幼蟲的自然脫果情況。

1.3 2株球孢白僵菌對核桃舉肢蛾幼蟲的感染試驗

昆蟲的收集：將采集的蟲果放置于室內，收集自然脫果的核桃舉肢蛾健康幼蟲，放于潔凈的培養(yǎng)皿內保存，用于感染試驗。

菌株培養(yǎng)及孢子液的制備：將實驗室已有的2株球孢白僵菌TST05（由山西省襄汾縣桃小食心蟲越冬幼蟲上分離獲得，已保藏于中國普通微生物菌種保藏管理中心，編號為CGMCC4526）和FDB01（由吉林省伊通縣紅松林帕克阿扁松葉蜂幼蟲上分離獲得）接種于PDA培養(yǎng)基上，置于人工氣候箱中（溫度（25±1）℃、相對濕度70%±10%，光照周期14∶10（L∶D））培養(yǎng)7～10 d，然后將菌絲刮于含有0.1%Tween-80的無菌水中制成孢子懸浮液，檢測分生孢子濃度，配制成濃度為1.0×108個/mL的孢子懸浮液。

幼蟲的感染和效果觀察：從收集的老熟幼蟲里挑選大小一致的健康幼蟲，每組30頭，設3個重復，采用浸蟲法感染體表。置于人工氣候箱中進行培養(yǎng)（溫度（25±1）℃、相對濕度70%±10%，光照周期14∶10（L∶D）），每天觀察、記錄死亡情況。幼蟲死亡后進行保濕培養(yǎng)，看是否有白色菌絲長出，并計算校正死亡率和致死中時。

2 結果與分析

2.1 核桃舉肢蛾幼蟲在核桃果實內的為害狀

2014年8月從陽泉盂縣采集核桃舉肢蛾鉆蛀的蟲果（圖1-A）。將蟲果按受害程度分為為害初期、中期、后期和末期（圖1-B）。為害初期，核桃舉肢蛾幼蟲鉆蛀進核桃內的時間尚短，核桃的果皮仍為青綠，在核桃青皮和果肉內可觀察到幼蟲較小，鉆蛀的蟲孔和坑道都比較細?。▓D1-C）。為害中期，核桃的青皮上出現(xiàn)黑色斑塊，幼蟲在核桃果實內取食和發(fā)育已經(jīng)有較長時間，蟲體已經(jīng)長大，核桃果肉被大量蛀食，形成縱橫交錯的黑色坑道，并有明顯的蟲糞（圖1-D）。為害后期，核桃果皮大部分變黑，果肉的大部分已被幼蟲蛀食，形成許多的蟲孔和坑道，坑道內充滿大量蟲糞（圖1-E）。為害末期，核桃果皮完全變黑，幼蟲發(fā)育接近成熟，果肉幾乎被完全蛀食，只剩下大量的蟲糞（圖1-F）。另外，可以看到一些幼蟲已經(jīng)在核桃種皮木質化前蛀入種仁，在種仁內蛀食，并排泄糞便（圖1-G，H）；由于幼蟲蛀食，導致核桃種仁發(fā)育不良、干縮變黑（圖1-I）。

據(jù)統(tǒng)計，在核桃舉肢蛾鉆蛀的核桃內幼蟲的數(shù)量平均為6～7頭，多的可達13頭。幼蟲老熟后在果實上蛀孔鉆出，剛脫果幼蟲的體長為6～9 mm；頭部黃褐色，蟲體色淺，淡紅，半透明，腹部末端2節(jié)呈白色（圖1-K，L）。

2.2 2株球孢白僵菌對核桃舉肢蛾幼蟲的感染效果

探究2株球孢白僵菌對核桃舉肢蛾幼蟲的感染情況，制備TST05和FDB01等2個菌株的孢子懸浮液，感染健康的核桃舉肢蛾幼蟲。試驗結果表明，被2個菌株感染的核桃舉肢蛾幼蟲，在第2天幼蟲活力有所下降，第3天幼蟲開始相繼死亡，蟲體的表皮失去光澤，發(fā)黃變暗，逐漸萎縮干癟（圖2-A，E）；第5天從蟲體表面長出一些白色菌絲（圖2-B，F(xiàn)）；第8天死亡蟲體僵硬，體表長滿白色菌絲（圖2-C，G）；第12天蟲體完全被菌絲萌發(fā)出的白色孢子覆蓋（圖2-D，H）。證明2個菌株對核桃舉肢蛾幼蟲均有侵染效果。

經(jīng)檢測，2株球孢白僵菌TST05和FDB01（孢子懸浮液濃度為1.0×108個/mL）對核桃舉肢蛾幼蟲均表現(xiàn)出較高的致病力。由圖3可知，感染后第3天，TST05和FDB01菌株感染的校正死亡率分別為14.4%和10.0%；感染后4～6 d，幼蟲的死亡率迅速增高，第6天TST05校正死亡率達66.67%，F(xiàn)DB01校正死亡率達到73.3%；感染后6～8 d，幼蟲死亡速率減慢，到達第8天時，TST05校正死亡率為84.4%，F(xiàn)DB01的校正死亡率達到了87.8%。在感染后1～4 d，菌株TST05的校正死亡率大于菌株FDB01，4 d后菌株FDB01的校正死亡率超過了菌株TST05。菌株TST05，F(xiàn)DB01對核桃舉肢蛾越冬幼蟲的致死中時（LT50）分別為4.934，4.743 d，差別較?。ū?）。2株球孢白僵菌對核桃舉肢蛾幼蟲都有較高的校正死亡率和較短的致死中時。

表1 2個菌株對核桃舉肢蛾幼蟲的致死中時

3 討論

核桃在我國栽培歷史悠久，分布廣泛。核桃舉肢蛾為害是造成核桃減產(chǎn)絕收的主要原因之一。核桃舉肢蛾幼蟲在核桃果實內蛀食，形成縱橫交錯的坑道，造成果皮變黑、皺縮，早期落果，給果農造成巨大的經(jīng)濟損失。據(jù)20世紀90年代調查，在山西的盂縣、左權、黎城等9個縣的核桃產(chǎn)區(qū)，平均蟲果率為47.7%，嚴重的達90%以上[5]。陜西商洛地區(qū)危害嚴重年份，黑果率可達42%～70%，產(chǎn)量損失40%，出仁率降低30%，含油量降低35%[10]。

以往的化學防治是在樹冠連續(xù)多次噴灑藥劑，消滅成蟲和蛀果前的幼蟲，可以達到一定的防治效果[11]。張坤朋等[12]在成蟲發(fā)生高峰期，樹冠噴灑毒死蜱、苦參堿等化學農藥，防治效果可達80%以上。田士波等[13]將水溶性藥劑注入核桃樹干，使之在樹干內運行，進入核桃果皮和果仁內，結果證明可達到較好的防治效果。另外，結合刨樹盤和土壤施用化學殺蟲劑，防治入土越冬的幼蟲和羽化出土的成蟲，具有一定的效果[14]。但是，連續(xù)的化學防治會引起環(huán)境污染、害蟲抗藥性等問題。采用性引誘劑誘殺，對核桃舉肢蛾的防治效果僅有12.5%～22.2%，蟲果率僅下降2.2%～2.6%，防治效果不明顯[15]。田敏爵等[16]研究表明，在核桃舉肢蛾成蟲期、卵期、幼蟲蛀果前期采用蘇云金桿菌噴霧可有效降低蟲果率。王永宏等[17-18]利用斯氏線蟲和蕪菁夜蛾線蟲懸浮液，在不同時期噴灑核桃樹下土壤，對核桃舉肢蛾有一定的防治效果。

白僵菌是國內外研究和應用最為廣泛的蟲生真菌類群[19]。本研究通過選用球孢白僵菌TST05和FDB01菌株對核桃舉肢蛾幼蟲進行感染試驗，結果發(fā)現(xiàn)2個菌株對核桃舉肢蛾老熟幼蟲都有較高的致病力，表現(xiàn)為致死速度快，致死率高，其致死中時（LT50）分別為4.934，4.743 d，第8天的致死率分別為84.4%和87.8%。這為核桃舉肢蛾的生物防治提供了菌種資源。另外，球孢白僵菌與田間使用的幾種主要化學殺蟲劑有著較好的相容性，當白僵菌在土壤中遇到化學殺蟲劑時，對菌株的宿存和防治效果不會有較大影響[20]。白僵菌在自然界的生存和感染通常需要合適的溫度、濕度等條件，根據(jù)核桃舉肢蛾老熟幼蟲脫果后具有入土結繭的習性，再結合通常的刨樹盤的管理措施，在土壤中施用白僵菌制劑，既能發(fā)揮土壤環(huán)境利于白僵菌存活的優(yōu)勢，又能利用白僵菌高效感染致病的特點，為核桃舉肢蛾生物防治提供了一種簡便易行的新方法。

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Infestation Experiment of Atrijuglans hetaohei Yang Larvae with the Two Strains of Beauveria bassiana

WANG Yun1，ZHOU Xi-bei1，CHEN Chun-yan1，ZHANG Hai-jun2，XIE Ying-ping1
（1.College of Life Sciences，Shanxi University，Taiyuan 030006，China；2.Yangquan Forestry Science Research Institute，Yangquan 045000，China）

The infestation and damage of the pest Atrijuglans hetaohei Yang greatly reduced the yield and quality of walnut.To develop a new way for the pest biological control,the walnut fruits with larvae of Atrijuglans hetaohei were collected from Yuxian county in Shanxi province and were dissected and observed.The investigation showed that as the larvae boring the walnut fruits in early, medium,later,and final stage,different symptoms exhibited on the damage walnut fruits,including the black spots of walnut pericarp,the size of galleries and holes caused by larvae boring,quantity of faeces,color and length of larvae.The average number of the larvae inside of the infested walnut fruits was 6-7,but the most number could reach to13 in one walnut fruit.Two strains of Beauveria bassiana TST05 and FDB01（sporeconcentration was 1.0×108/mL）were used to infect the mature Atrijuglans hetaohei larvae.The result showed that the two strains were very good in infection and pathogenicity to the larvae.On the second day after infection,the larvae showed the diseased symptom,later mycelia appeared on the surface of the larvae,at last the dead larvae was completely covered with a thick of mycelia.On the eighth day,the mortality rate reached 87.8%and 84.4%in the two strains infection,respectively,while the LT50of the two strains were 4.743,4.934 d,respectively.

Atrijuglans hetaohei Yang;Beauveria bassiana;infestation;biological control

S436.64

A

1002-2481（2016）05-0662-04

10.3969/j.issn.1002-2481.2016.05.21

2016-01-05

山西省科技攻關項目（20140311017-6）

王 云（1988-），男，山西晉城人，在讀碩士，研究方向：昆蟲病原真菌與生物防治。謝映平為通信作者。