擬南芥amiR-RUS4 ms35雄性不育雙突變體的構(gòu)建、鑒定及表型分析

董晶晶，趙淑清

（山西大學(xué)生物技術(shù)研究所，化學(xué)生物學(xué)與分子工程教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山西太原030006）

擬南芥amiR-RUS4 ms35雄性不育雙突變體的構(gòu)建、鑒定及表型分析

董晶晶，趙淑清

（山西大學(xué)生物技術(shù)研究所，化學(xué)生物學(xué)與分子工程教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山西太原030006）

控制雄性育性是研究植物生殖和選擇育種的一個(gè)重要目標(biāo)。對(duì)雄性不育分子機(jī)制的深入理解將為控制雄性育性和雜種繁育提供有效途徑。利用人工microRNA技術(shù)對(duì)DUF647蛋白家族成員RUS4基因進(jìn)行特異沉默，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，amiR-RUS4植株敗育，藥室內(nèi)壁次生加厚異常，花藥不開(kāi)裂，表明RUS4與藥室內(nèi)壁的木質(zhì)化有關(guān)。MS35/MYB26是木質(zhì)素生物合成途徑上游一個(gè)重要的激活因子，為了進(jìn)一步了解RUS4和MYB26在調(diào)控花藥藥室內(nèi)壁次生加厚過(guò)程中的作用，以ms35為母本、amiR-RUS4為父本進(jìn)行人工雜交，得到雜交子2代（F2）；并對(duì)雜交子2代（F2）的基因型、表型和基因表達(dá)進(jìn)行了鑒定，結(jié)果獲得一個(gè)純合的amiR-RUS4 ms35雙突變體，這為進(jìn)一步分析RUS4和MS35在調(diào)控藥室內(nèi)壁次生加厚中的作用提供了寶貴的試驗(yàn)材料。

擬南芥；雄性不育；RUS4；MYB26

雄性不育是高等植物中較為普遍存在的一種遺傳現(xiàn)象，是指植物雄性生殖器官不能產(chǎn)生正常功能的雄配子——花粉的現(xiàn)象，如植物花藥中無(wú)花粉、花粉敗育和花藥不開(kāi)裂等。雄性不育在農(nóng)作物的雜種優(yōu)勢(shì)利用上具有重要的價(jià)值。近年來(lái)，人們對(duì)花藥和花粉發(fā)育基本過(guò)程的認(rèn)識(shí)有了很大的提高，其中，許多信息來(lái)自于對(duì)擬南芥雄性不育突變體的詳細(xì)研究[1-4]。

花粉在植物雄性生殖器官花藥中發(fā)育成熟，早期花藥原基中造孢細(xì)胞通過(guò)一系列的細(xì)胞分裂、分化過(guò)程，形成小孢子母細(xì)胞和圍繞在外面的絨氈層、中層和藥室內(nèi)壁3層營(yíng)養(yǎng)組織，這3層營(yíng)養(yǎng)組織和最外層表皮對(duì)小孢子母細(xì)胞起著重要的保護(hù)作用，同時(shí)為其發(fā)育成熟提供必要的物質(zhì)和營(yíng)養(yǎng)保障。當(dāng)花藥內(nèi)部表皮、藥室內(nèi)壁、中層和絨氈層已經(jīng)分化、減數(shù)分裂已經(jīng)完成時(shí)，隨即進(jìn)入花粉成熟以及花藥開(kāi)裂進(jìn)程。擬南芥花藥開(kāi)裂發(fā)生主要包括中間層和絨氈層的退化，內(nèi)壁細(xì)胞的膨脹，在內(nèi)壁細(xì)胞和連接細(xì)胞間的纖維層累積即次生壁加厚，隔膜退化形成二室花藥，花藥脫水，花粉粒膨大，最終導(dǎo)致花藥開(kāi)裂，釋放花粉粒。其中，藥室內(nèi)壁次生加厚可為花藥開(kāi)裂提供一種機(jī)械力量[5]。對(duì)花藥發(fā)育和花粉釋放機(jī)制的深入研究將為控制作物雄性育性和雜種繁育提供有效的途徑。

RUS4（ROOT UV-B SENSITIVE 4）是擬南芥DUF647（Domain of unknown function647）蛋白家族的一個(gè)成員[6]。通過(guò)人工microRNAs（artificial microRNAs,amiRNAs）技術(shù)獲得了特異沉默RUS4（At2g23470）基因的突變體[7]。amiR-RUS4突變體由于自花授粉失敗而產(chǎn)生短小的角果，但是通過(guò)人工授予有活力的花粉可以挽救其不育表型。研究結(jié)果顯示，突變體的花粉活力降低，同時(shí)藥室內(nèi)壁次生加厚出現(xiàn)異常，導(dǎo)致花藥開(kāi)裂失敗。

MYB26/MALE STERILE 35為R2R3型MYB轉(zhuǎn)錄因子，在花藥開(kāi)裂過(guò)程中具有重要作用[8]。MYB26功能異常導(dǎo)致植株敗育，花藥不開(kāi)裂，但花粉具有活力[9-10]。研究發(fā)現(xiàn)，MYB26定位于細(xì)胞核，在花藥藥室內(nèi)壁早期發(fā)育時(shí)開(kāi)始表達(dá)，花粉有絲分裂和雙核時(shí)期表達(dá)量達(dá)到最大，通過(guò)細(xì)胞特異的方式對(duì)花藥藥室內(nèi)壁木質(zhì)化和開(kāi)裂起作用。MYB26過(guò)表達(dá)導(dǎo)致植株的異位次生加厚，在表皮組織表現(xiàn)尤為明顯。MYB26可調(diào)控多種次生壁加厚相關(guān)基因的表達(dá)，包括IRREGULAR XYLEM1（IRX1），IRX3，IRX8和IRX12，且myb26突變體中NAC SECONDARY WALL THICKENING PROMOTING FACTOR1（NST1）和NST2的表達(dá)發(fā)生變化，說(shuō)明MYB26可調(diào)控NST1和NST2的表達(dá)，可能位于木質(zhì)素合成途徑的上游，從而控制次生壁的木質(zhì)化過(guò)程，推測(cè)MYB26通過(guò)NST1和NST2來(lái)調(diào)控IRX1，IRX3，IRX8，IRX12的表達(dá)[11]。

本研究以amiR-RUS4和ms35突變體為材料，進(jìn)行人工雜交，以創(chuàng)制amiR-RUS4 ms35雙突變體，對(duì)雜交子2代（F2）進(jìn)行了基因型、表型分析，并對(duì)雙突變體進(jìn)行了表達(dá)分析，目的是得到純合的amiR-RUS4 ms35雙突變體，旨在為進(jìn)一步分析RUS4和MYB26基因在調(diào)控藥室內(nèi)壁次生加厚過(guò)程中的關(guān)系奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 材料與生長(zhǎng)條件

植物材料為野生型擬南芥 Col（Arabidopsis thaliana，Columbia ecotype），amiR-RUS4和ms35。其生長(zhǎng)條件為：光周期16 h光照/8 h黑暗；相對(duì)濕度50%～70%；溫度（22±2）℃。

1.2 方法

1.2.1 人工授粉雜交 選擇ms35植株花瓣剛剛露白的花蕾，小心剝?nèi)セㄝ?、花瓣和雄蕊，只留雌蕊，做好?biāo)記，作為母本。選擇完全盛開(kāi)的amiR-RUS4的花作為父本。由于amiR-RUS4突變體花藥不開(kāi)裂，需要人工釋放花粉粒，并將其授到ms35植株的雌蕊柱頭上，為保證成功，一般授粉2～3個(gè)花藥。授粉3 d后觀察，若雜交成功，可看到雌蕊伸長(zhǎng)；若不成功，則萎蔫。15 d左右后收取單個(gè)角果，F(xiàn)1自交產(chǎn)生F2。

1.2.2 amiR-RUS4 ms35雙突變體的鑒定 待F2植株生長(zhǎng)15 d左右，取葉片于已配制的蔗糖緩沖液[12]（50 mmol/L Tris-HCl，pH值 7.5，300 mmol/L NaCl，300 mmol/L蔗糖溶液）中充分研磨，99℃加熱10 min，6 000 r/min短暫離心，單株提取基因組DNA，利用引物MIR319a-F/R（表1）進(jìn)行基因組水平的PCR檢測(cè)，以確定amiRNA前體的存在。純合的ms35株系則通過(guò)表皮毛來(lái)鑒定，由于ms35突變體中MS35和GL基因均發(fā)生突變，而GL基因的缺失導(dǎo)致葉片缺少表皮毛，所以，可以通過(guò)葉片表皮毛的有無(wú)來(lái)鑒定純合的ms35突變體。

1.2.3 表達(dá)分析 取經(jīng)基因型和表型篩選出F2株系3，36，38號(hào)的花蕾，用TaKaRa MiniBEST Plant RNA Extraction Kit提取RNA，對(duì)RUS4和MYB26的表達(dá)進(jìn)行RT-PCR檢測(cè)（引物如表1所示），從而進(jìn)一步鑒定純合的amiR-RUS4 ms35雙突變體。

表1 amiR-RUS4 ms35植株鑒定的引物序列

1.2.4 表型分析 待F2植株生長(zhǎng)50 d左右，觀察植株生長(zhǎng)狀況、育性、葉片表皮毛、角果生長(zhǎng)狀況。

2 結(jié)果與分析

2.1 amiR-RUS4 ms35植株的基因型分析

amiR-RUS4突變體由人工microRNA敲減獲得，其含有MIR319a前體核苷酸序列。種植amiRRUS4與ms35雜交F2共66株，用引物MIR319a-F和MIR319a-R在基因組水平進(jìn)行PCR鑒定（以野生型Col作為對(duì)照），結(jié)果顯示，除6，9，17，23，35，47，48，54，66號(hào)外，其余57株植株均有目的條帶，且片段大小正確（圖1），表明此57株植株中含有人工microRNA背景。

2.2 amiR-RUS4 ms35植株的表型分析

ms35來(lái)自Ler生態(tài)型，且該突變體中MS35和GL基因突變。GL基因編碼一種類(lèi)似MYB的蛋白質(zhì)，該蛋白對(duì)于誘導(dǎo)表皮毛的發(fā)育是必需的，故ms35為表皮毛缺陷突變體，可作為表型觀察的一個(gè)特征。觀察66株中含有人工microRNA前體背景的F2植株表型發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)2中3號(hào)植株無(wú)表皮毛，不結(jié)角果，其可能為純合的雙突變體，而36，38號(hào)植株育性降低且有表皮毛，其可能為雜合體（圖2）。

2.3 amiR-RUS4 ms35植株的表達(dá)分析

本研究對(duì)3，36，38號(hào)植株進(jìn)行了RNA水平的半定量RT-PCR鑒定，結(jié)果顯示，3號(hào)植株花蕾中RUS4，MYB26基因的表達(dá)明顯下調(diào)，36，38號(hào)花蕾中RUS4表達(dá)降低不太明顯，MYB26表達(dá)量減少（圖3）。因此，雜交F2中3號(hào)植株為純合雙突變體。

3 討論

擬南芥作為模式植物，對(duì)其雄性育性相關(guān)基因的功能分析有助于促進(jìn)作物雜種優(yōu)勢(shì)的應(yīng)用。由基因控制的可遺傳的雄性不育突變體中花藥和花粉發(fā)育出現(xiàn)異常的過(guò)程是研究的重點(diǎn)，它將雄性不育個(gè)體調(diào)控育性變化的研究和分子水平研究聯(lián)系起來(lái)，為了解不育基因調(diào)控雄性不育的過(guò)程奠定了基礎(chǔ)，對(duì)全面認(rèn)識(shí)植物雄性育性的分子調(diào)控具有重要意義。

DUF647蛋白家族是廣泛存在于真核生物體內(nèi)高度保守的蛋白質(zhì)家族，其在植物的生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中有著重要作用。擬南芥DUF647蛋白家族有6個(gè)成員：RUS1，RUS2，RUS3，RUS4，RUS5，RUS6。其中，RUS1和RUS2通過(guò)彼此相互作用，在根UVB感受途徑中發(fā)揮作用[6，13]。且有研究表明，WRX3/ RUS1在生長(zhǎng)素極性運(yùn)輸中有重要的調(diào)控作用[14]。RUS4作為DUF647蛋白家族成員之一，其是否與RUS1基因相類(lèi)似在生長(zhǎng)素運(yùn)輸途徑中發(fā)揮功能，還有待于進(jìn)一步分析。

本研究在實(shí)驗(yàn)室運(yùn)用人工microRNA技術(shù)對(duì)RUS4進(jìn)行了特異沉默，獲得了amiR-RUS4基因敲減株，發(fā)現(xiàn)其花粉活力降低，藥室內(nèi)壁次生加厚異常，花藥不開(kāi)裂，為雄性不育株。ms35突變體中的MS35突變，使得花藥無(wú)藥室內(nèi)壁木質(zhì)化、花藥開(kāi)裂缺陷，但花粉具有活力；同時(shí)該突變體中GL基因突變，GL基因可調(diào)控表皮毛的發(fā)育，其突變會(huì)導(dǎo)致植株葉片缺乏表皮毛。本試驗(yàn)對(duì)amiR-RUS4和ms35雜交產(chǎn)生的F2植株進(jìn)行了基因型、表型、表達(dá)分析，鑒定出了純合的amiR-RUS4 ms35雙突變體。突變體葉片缺乏表皮毛，含有microRNA前體序列，花蕾中RUS4和MYB26的表達(dá)明顯下調(diào)，觀察發(fā)現(xiàn)，藥室內(nèi)壁次生加厚異常，這為進(jìn)一步分析RUS4和MYB26在調(diào)控花藥藥室內(nèi)壁次生加厚中的作用提供了有價(jià)值的試驗(yàn)材料。

本研究通過(guò)吖啶橙/溴化乙錠染色發(fā)現(xiàn)，amiR-RUS4突變體藥室內(nèi)壁木質(zhì)化減少，而ms35/ myb26突變體花藥中藥室內(nèi)壁完全沒(méi)有次生加厚，說(shuō)明RUS4與MYB26均在藥室內(nèi)壁次生加厚和花藥開(kāi)裂過(guò)程中起作用。對(duì)amiR-RUS4 ms35純合雙突變體的鑒定發(fā)現(xiàn)，其植株表型和myb26相似，藥室內(nèi)壁次生加厚均有缺陷。通過(guò)表達(dá)分析發(fā)現(xiàn)，在amiR-RUS4突變體中，MYB26的表達(dá)與野生型相比無(wú)明顯變化，說(shuō)明RUS4功能缺失不會(huì)影響到MYB26的表達(dá)，推測(cè)MYB26可能位于RUS4基因的上游起作用或二者通過(guò)不同的途徑發(fā)揮作用。MYB26在藥室內(nèi)壁木質(zhì)化過(guò)程中，通過(guò)調(diào)控NST1和NST2來(lái)調(diào)節(jié)木質(zhì)素合成相關(guān)基因IRX的表達(dá)，因此，通過(guò)對(duì)amiR-RUS4突變體中NST1/2的表達(dá)進(jìn)行分析，也可推測(cè)RUS4與MYB26是否作用于同一途徑。

花藥藥室內(nèi)壁次生加厚在花藥開(kāi)裂過(guò)程中起關(guān)鍵性作用[8，15]，此過(guò)程需植物激素（如生長(zhǎng)素[16-17]）和多種基因（如MYB26，SAF1[18]，CBSX2[19]，RPK2[20]，RUS4）參與調(diào)控。盡管目前已經(jīng)確定了藥室內(nèi)壁次生加厚過(guò)程的一些重要的調(diào)控因子，但是對(duì)于其具體調(diào)控機(jī)制仍不清楚，純合amiR-RUS4 myb26雙突變體的鑒定可為進(jìn)一步研究RUS4基因調(diào)控花藥藥室內(nèi)壁次生加厚的分子機(jī)制奠定一定的基礎(chǔ)。

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Construction，Identification and Phenotypic Analysis of amiR-RUS4 ms35 Male Sterile Double Mutant in Arabidopsis thaliana

DONG Jing-jing，ZHAO Shu-qing
（Key Laboratory of Chemical Biology and Molecular Engineering of Ministry Education，Institute of Biotechnology，Shanxi University，Taiyuan 030006，China）

Controlling male fertility is an important goal for the research of plant reproduction and selective breeding.A better understanding of the male sterile molecular mechanisms will provide effective ways for the control of male fertility and for hybrid generation. Specific silencing of a DUF647-containing gene RUS4 by artificial microRNA led to a severe reduction of male fertility.The amiR-RUS4 anther displayed altered endothecium secondary thickening,which impacted on anther dehiscence.Transcription factor MYB26/MS35 played a regulatory role in endothecium lignification as wall thickening was not observed in the endothecial cells of the MYB26 mutant and displayed indehiscent anthers.This study generated an amiR-RUS4 ms35 double mutant where homozygous ms35 lines were used for crosses with amiR-RUS4 plants.The genotypic,phenotypic and gene expression analysis were performed in the F2generation.One homozygous amiR-RUS4 ms35 double mutant were obtained,which will provide a valuable material for further analysis of the relationship between RUS4 and MS35 in the regulation of secondary thickening in the endothecium.

Arabidopsis thaliana;male sterile;RUS4;MYB26

Q943

A

1002-2481（2016）05-0583-04

10.3969/j.issn.1002-2481.2016.05.04

2016-01-26

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（31170273）；太原市科技明星專(zhuān)項(xiàng)（11014902）

董晶晶（1990-），女，山西交城人，在讀碩士，研究方向：植物分子生物學(xué)。趙淑清為通信作者。