培氟沙星毒性預(yù)測(cè)與實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)比較研究

■武英豪 程林麗沈建忠 胡 燁 劉瑩瑩

(中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，北京 100094)

培氟沙星（Pefloxacin，結(jié)構(gòu)式見(jiàn)圖1）為甲基-4-哌嗪喹諾酮類衍生物，屬于第三代喹諾酮類化合物[1]。它是一種高效、低毒、人獸通用的廣譜抗菌藥物，以吸收快、生物利用度好、組織藥物濃度高、體內(nèi)分布廣、維持時(shí)間長(zhǎng)為特點(diǎn)，臨床應(yīng)用主要是其甲磺酸鹽。培氟沙星在動(dòng)物體內(nèi)對(duì)革蘭氏陰性菌的抗菌活性與第三代頭孢菌素及新氨基糖苷類相似，對(duì)衣原體、支原體、某些革蘭氏陽(yáng)性菌也有一定的抗菌作用[2]。它通過(guò)干擾DNA的復(fù)制以及菌體蛋白的合成而發(fā)揮抑制或殺滅細(xì)菌的作用[3]。

毒性研究是對(duì)獸藥進(jìn)行安全性評(píng)價(jià)的重要內(nèi)容。傳統(tǒng)的毒理學(xué)評(píng)價(jià)方法一般包括三性（急性、亞慢性、慢性毒性）試驗(yàn)和三致（致突變、致畸、致癌）試驗(yàn)，以預(yù)測(cè)新獸藥的安全性。這些評(píng)價(jià)方法都采取傳統(tǒng)的毒理學(xué)試驗(yàn)進(jìn)行[4-5]。而近年來(lái)定量構(gòu)效關(guān)系(QSAR)逐漸成為一項(xiàng)分析化合物的藥理和毒理性質(zhì)非常有用的方法。它借助分子的理化性質(zhì)參數(shù)或結(jié)構(gòu)參數(shù)，以數(shù)學(xué)和統(tǒng)計(jì)學(xué)手段定量研究有機(jī)小分子與生物大分子相互作用，構(gòu)建相關(guān)預(yù)測(cè)模型，測(cè)定類似結(jié)構(gòu)化合物的藥理和毒理性質(zhì)，在藥物設(shè)計(jì)研究中發(fā)揮重要的作用。而在對(duì)已有藥物的研究中目前還少見(jiàn)應(yīng)用[6-8]。

圖1 培氟沙星結(jié)構(gòu)式

因此，本研究的目的是利用計(jì)算機(jī)輔助藥物設(shè)計(jì)技術(shù)，對(duì)培氟沙星進(jìn)行毒性預(yù)測(cè)，分析和討論各個(gè)毒性參數(shù)與文獻(xiàn)發(fā)表的傳統(tǒng)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的吻合度和差異，以期能為該藥的毒理學(xué)研究和食品安全性評(píng)價(jià)提供有力的參考和佐證。

1 材料與方法

試驗(yàn)以量子力學(xué)、分子力學(xué)、分子動(dòng)力學(xué)、定量構(gòu)效關(guān)系、分子與結(jié)構(gòu)生物學(xué)、化學(xué)生物信息學(xué)、計(jì)量化學(xué)等為理論基礎(chǔ)，在Windows XP操作系統(tǒng)(美國(guó)微軟公司）中安裝ADMET Predictor 6.5商業(yè)軟件進(jìn)行毒性預(yù)測(cè)。

2 測(cè)定方法

2.1 急性毒性測(cè)定

進(jìn)行LD50值預(yù)測(cè)和比較分析。大鼠的急性毒性模型建立在藥物對(duì)大鼠的LD50實(shí)驗(yàn)值的基礎(chǔ)上，以mg/kg級(jí)計(jì)量口服給藥的化合物對(duì)大量的大鼠進(jìn)行試驗(yàn)，獲得7 510種具有獨(dú)特的毒性識(shí)別位點(diǎn)的化合物的LD50值，進(jìn)行pLD50或以mol/kg單位的LD50的負(fù)對(duì)數(shù)值A(chǔ)NNE模型法二維和三維模式建模[9]。急性毒性參數(shù)TOX_Rat的預(yù)測(cè)值用半數(shù)致死濃度LD50表示，單位為mg/kg。對(duì)于大多數(shù)藥物分子，TOX_Rat的預(yù)測(cè)值應(yīng)大于或等于300才能判定為無(wú)急性毒性。

2.2 皮膚過(guò)敏性測(cè)定

建模數(shù)據(jù)來(lái)自298個(gè)化合物的小鼠局部淋巴結(jié)試驗(yàn)（LLNA）結(jié)果。在二維模型構(gòu)建過(guò)程中抽取20%的化合物用作訓(xùn)練集，而在三維模型構(gòu)建中則抽取30%的化合物，2D模式和3D模式下實(shí)驗(yàn)值與預(yù)測(cè)值的相關(guān)性依次為92.1%和87.6%。用致敏性或非致敏性來(lái)表示皮膚過(guò)敏性參數(shù)TOX_SKIN。EC3是LLNA的端點(diǎn)。通過(guò)與陰性對(duì)照組比較，將能使大鼠體內(nèi)產(chǎn)生淋巴結(jié)細(xì)胞增殖刺激作用的化合物最低濃度的3倍劑量用來(lái)區(qū)分致敏作用和非致敏作用?；衔锞哂衅つw致敏性的標(biāo)準(zhǔn)是其EC3值≤10%，EC3值大于10%則被認(rèn)為無(wú)皮膚致敏性。

2.3 致癌性測(cè)定

分別進(jìn)行大鼠致癌性和小鼠致癌性測(cè)定。大鼠和小鼠ADMET Predictor致癌性定量構(gòu)效關(guān)系模型建立在CPDB數(shù)據(jù)庫(kù)的基礎(chǔ)上，擁有較好的有效性。以半數(shù)致癌濃度TD50來(lái)表示致癌性大鼠模型參數(shù)TOX_BRM_Rat，單位為 mg/(kg·d)。在整個(gè)生命期間50%種群數(shù)量的大鼠產(chǎn)生腫瘤細(xì)胞時(shí)口服化合物的劑量稱之為TD50。大多數(shù)藥物分子的TOX_BRM_Rat預(yù)測(cè)值大于或等于4。以半數(shù)致癌濃度 TD50來(lái)表示致癌性小鼠模型參數(shù)TOX_BRM_Mouse，單位為 mg/(kg·d)。在整個(gè)生命期間50%種群數(shù)量的小鼠產(chǎn)生腫瘤細(xì)胞時(shí)口服化合物的劑量稱之為TD50。大多數(shù)藥物分子的TOX_BRM_Mouse預(yù)測(cè)值大于或等于25。

2.4 對(duì)染色體變異的影響測(cè)定

進(jìn)行是否誘導(dǎo)產(chǎn)生染色體變異的預(yù)測(cè)和比較分析。預(yù)測(cè)模型來(lái)自于1 407種化合物的染色體變異毒性分析值構(gòu)建的神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)集成模型。訓(xùn)練集數(shù)據(jù)毒性結(jié)果的得出采用的是傳統(tǒng)的染色體突變?cè)囼?yàn)。致染色體變異可能性參數(shù)為TOX_CABR，其預(yù)測(cè)結(jié)果為“是”和“否”兩種。

2.5 生殖毒性測(cè)定

進(jìn)行生殖毒性的預(yù)測(cè)和比較分析。軟件的建模數(shù)據(jù)來(lái)自116種被認(rèn)為具有生殖毒性的化合物數(shù)據(jù)。建立的分類模型先對(duì)254種訓(xùn)練集/毒性集化合物進(jìn)行分析，之后再對(duì)38種實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)集分析，其結(jié)果均獲得了87%以上的相似度。生殖毒性參數(shù)TOX_REPR的預(yù)測(cè)結(jié)果為“是”和“否”兩種。

2.6 致突變性測(cè)定

進(jìn)行致突變作用的預(yù)測(cè)和比較分析。共用10株不同沙門屬的Ames試驗(yàn)進(jìn)行致突變性參數(shù)TOX_MUT_***測(cè)定。10個(gè)TOX_MUT_***的模型均為定性測(cè)定，這種模型的測(cè)定結(jié)果有“陽(yáng)性”和“陰性”兩種。致突變性風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估參數(shù)TOX_MUT_Risk可以在通過(guò)對(duì)化合物的TOX_MUT_***預(yù)測(cè)結(jié)果進(jìn)行綜合打分之后進(jìn)一步獲得。該值對(duì)于大多數(shù)藥物分子而言，應(yīng)小于或等于2。10株沙門氏菌見(jiàn)表1。

表1 致突變性使用的10株沙門氏菌

3 結(jié)果分析與討論

作為藥物研究中一個(gè)廣泛的課題，藥物的化學(xué)結(jié)構(gòu)與生物活性(包括藥理和毒理)之間的關(guān)系一直備受關(guān)注。藥物小分子與生物大分子的物理化學(xué)性質(zhì)和化學(xué)結(jié)構(gòu)間相互適配，進(jìn)而藥物在機(jī)體內(nèi)與相應(yīng)的部位發(fā)生作用，產(chǎn)生生物活性。藥物分子結(jié)構(gòu)的改變，其活性發(fā)生強(qiáng)度和活性類型會(huì)相應(yīng)改變。通過(guò)對(duì)構(gòu)效關(guān)系的研究，建立二者之間變化的規(guī)律性，以此可以對(duì)類似化合物進(jìn)行預(yù)測(cè)。將由此得到的預(yù)測(cè)結(jié)果與實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行比較，則能從藥物的化學(xué)結(jié)構(gòu)的角度為該藥物的毒理學(xué)評(píng)價(jià)提供更多、更可靠的佐證。

3.1 培氟沙星的急性毒性比較分析

急性毒性是衡量化合物毒性的重要指標(biāo)?；衔锏募毙远拘詳?shù)據(jù)在動(dòng)物性試驗(yàn)中一般指大鼠的半數(shù)致死濃度LD50。聯(lián)合國(guó)世界衛(wèi)生組織為方便對(duì)急性毒性進(jìn)行評(píng)價(jià)，推薦了一個(gè)五級(jí)標(biāo)準(zhǔn)。在此分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)的基礎(chǔ)上，一種與此基本相同但更具體的6級(jí)標(biāo)準(zhǔn)由我國(guó)提出。該標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定LD50值（mg/kg）：＜1，6級(jí)，極毒；1～50，5級(jí)，劇毒；51～500，4級(jí)，中等毒；501～5 000，3級(jí)，低毒；5 001～15 000，2級(jí)，實(shí)際無(wú)毒；＞15 000，1級(jí)，無(wú)毒。判定化合物為無(wú)急性毒性在本研究使用的預(yù)測(cè)軟件的參數(shù)要求是TOX_Rat值應(yīng)大于或等于300。軟件測(cè)得培氟沙星的大鼠急性毒性為331.58 mg/kg，按預(yù)測(cè)軟件的標(biāo)準(zhǔn)，培氟沙星TOX_Rat預(yù)測(cè)值≥300 mg/kg，沒(méi)有急性毒性。按我國(guó)的分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)，其毒性值位于51～500的范圍，屬中等毒性。也就是說(shuō)，通過(guò)化合物的結(jié)構(gòu)、理化性質(zhì)等參數(shù)建立起的該數(shù)學(xué)模型預(yù)測(cè)結(jié)果用我國(guó)傳統(tǒng)的毒性分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)分類屬中等毒性。

Sridevi等（2002）[10]研究了培氟沙星對(duì)幼犬的毒性，結(jié)果表明，以10 mg/kg體重給藥時(shí)，給藥方式為一天兩次，連續(xù)30 d給藥，最后未發(fā)現(xiàn)明顯的毒性作用。Ashish等（2000）[11]研究了培氟沙星對(duì)肉用仔雞的毒性，測(cè)得的LD50為1 025 mg/kg。Af等（2015）[12]所做的實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，新型氟喹諾酮類對(duì)BALB/C小鼠模型的急性毒性的LD50≥5 000 mg/kg。史曉麗等（1998）[13]以昆明種小鼠進(jìn)行急性毒性試驗(yàn)，20只小鼠飼養(yǎng)數(shù)日，禁食一夜，于翌晨稱重，隨機(jī)分為4組(雌、雄各半)，最大劑量為2 000 mg/kg體重，按等比級(jí)數(shù)遞減，經(jīng)口一次給藥，在一周內(nèi)觀察中毒癥狀，記錄各組的死亡率，用移動(dòng)平均法計(jì)算LD50和95%的可信限。測(cè)得甲磺酸培氟沙星對(duì)小鼠的急性毒性經(jīng)口LD50為1 690 mg/kg(1 326～2 148 mg/kg)。采用FDA頒布的動(dòng)物與動(dòng)物之間劑量換算方法，將小鼠的實(shí)驗(yàn)結(jié)果換算成大鼠的LD50劑量為845 mg/kg,與預(yù)測(cè)值331.58 mg/kg有差距。造成差距的原因可能是，預(yù)測(cè)結(jié)果建立在化合物的化學(xué)結(jié)構(gòu)和理化參數(shù)的基礎(chǔ)上，而化合物的脂溶性(logP)、水溶性(Sw)和滲透性(Peff)也是影響化合物毒性的重要因素[9,14]。在培氟沙星的實(shí)際應(yīng)用過(guò)程中，后面這些因素極大地降低了藥物的毒性作用。

3.2 培氟沙星的皮膚過(guò)敏性比較分析

皮膚致敏性屬于急性毒性的一種。分析預(yù)測(cè)化合物是否會(huì)產(chǎn)生皮膚過(guò)敏反應(yīng)，TOX_SKIN采用LLNA，其預(yù)測(cè)值用致敏性或非致敏性表示。采用軟件預(yù)測(cè)結(jié)果認(rèn)為，培氟沙星無(wú)致敏性。毛永利等(2007)[15]進(jìn)行了復(fù)方奧硝唑甲磺酸培氟沙星緩釋制劑（每枚重10 mg，含原藥量1 mg）的豚鼠皮膚過(guò)敏性實(shí)驗(yàn)。結(jié)果表明，緩釋牙栓組動(dòng)物自給藥72 h內(nèi)未出現(xiàn)紅斑及水腫，與空白對(duì)照組無(wú)差異；基質(zhì)組無(wú)致敏現(xiàn)象；陽(yáng)性對(duì)照組動(dòng)物皮膚受試區(qū)自激發(fā)給藥6 h后，有明顯輕度紅斑出現(xiàn)，無(wú)水腫，致敏率100%。由此可見(jiàn)緩釋劑不產(chǎn)生致敏作用[16]。該報(bào)道的實(shí)驗(yàn)值與軟件預(yù)測(cè)值一致，進(jìn)一步佐證了培氟沙星不產(chǎn)生皮膚致敏性。

3.3 培氟沙星的致癌性比較分析

大鼠致癌性試驗(yàn)和小鼠致癌試驗(yàn)為目前致癌性的主要表征。大鼠和小鼠服用某些化學(xué)物質(zhì)后可以誘導(dǎo)癌癥。同種化學(xué)物質(zhì)對(duì)不同體型的鼠的致癌效果不同，部分化學(xué)物質(zhì)，尤其是一些在大鼠模型中呈陰性的獸用化學(xué)品，在小鼠模型中則有誘導(dǎo)肝臟腫瘤的毒性。不用考慮化學(xué)物質(zhì)的相關(guān)性和基礎(chǔ)機(jī)理，不管何種反應(yīng)現(xiàn)象出現(xiàn)，只要化學(xué)物在任一測(cè)試中測(cè)出具有誘導(dǎo)癌癥的毒性，則被認(rèn)為是致癌物，且即可橫向推得結(jié)論認(rèn)為該化學(xué)物質(zhì)對(duì)人類也存在致癌風(fēng)險(xiǎn)。

ADMET Predictor對(duì)兩種試驗(yàn)結(jié)果均進(jìn)行了相應(yīng)的數(shù)學(xué)預(yù)測(cè)。結(jié)果表明：培氟沙星大鼠模型的半數(shù)致癌濃度為2.39 mg/(kg·d)，小于大鼠模型無(wú)致癌性的最低值，預(yù)測(cè)培氟沙星對(duì)大鼠有致癌性。培氟沙星小鼠模型半數(shù)致癌濃度為139 mg/(kg·d)，符合小鼠模型無(wú)致癌性的參數(shù)要求，預(yù)測(cè)培氟沙星對(duì)小鼠無(wú)致癌性。

3.4 培氟沙星對(duì)染色體變異的比較分析

通過(guò)預(yù)測(cè)獲得培氟沙星沒(méi)有致染色體變異的可能性。劉寧（2011）[17]采用健康成年昆明小鼠進(jìn)行染色體突變實(shí)驗(yàn)。按小鼠對(duì)藥物的最大耐受量10 g/kg為最高給藥劑量進(jìn)行灌胃，依次為5、2.5 g/kg以及1.25 g/kg。單次給藥24 h后取胸骨骨髓擠壓制片，油鏡計(jì)數(shù)嗜多染紅細(xì)胞中的微核數(shù)，計(jì)算微核誘發(fā)率和幼紅細(xì)胞之比。結(jié)果認(rèn)為，復(fù)方奧硝唑甲磺酸培氟沙星緩釋制劑不引起小鼠骨髓微核增多，說(shuō)明此藥對(duì)哺乳類動(dòng)物細(xì)胞染色體無(wú)影響，不引起染色體損傷而導(dǎo)致遺傳毒性。該實(shí)驗(yàn)結(jié)果與軟件預(yù)測(cè)結(jié)果相符。

3.5 培氟沙星的生殖毒性比較分析

軟件預(yù)測(cè)得出培氟沙星沒(méi)有生殖毒性，并且不產(chǎn)生雌雄激素受體結(jié)合毒性。董正謀等（2011）[18]對(duì)雌性大鼠根據(jù)體質(zhì)量每天按1、4、8 g/kg的劑量灌服復(fù)方奧硝唑甲磺酸培氟沙星牙周緩釋制劑處理，發(fā)現(xiàn)雌性大鼠從交配前至胚胎著床期服用該藥對(duì)其一般情況、交配能力、受孕力、子宮和早期胚胎的黃體數(shù)、著床數(shù)、活胎數(shù)、死胎數(shù)、吸收胎數(shù)均無(wú)不良影響，而高劑量可引起卵巢質(zhì)量減輕、系數(shù)減小和形態(tài)學(xué)改變，因此認(rèn)為該藥對(duì)雌性大鼠無(wú)生殖毒性。對(duì)雄性大鼠的相關(guān)實(shí)驗(yàn)則表明，藥劑處理對(duì)其一般情況、交配能力和生育能力無(wú)不良影響，而高劑量可引起大鼠體質(zhì)量減輕，睪丸、附睪質(zhì)量減輕系數(shù)減小，精子活動(dòng)力降低、數(shù)目減少和畸形率升高，同時(shí)導(dǎo)致睪丸、附睪組織病理學(xué)改變[19-20]，即藥物對(duì)雄性大鼠亦無(wú)生殖毒性。

3.6 培氟沙星致突變性分析

Ames試驗(yàn)是一個(gè)短期的細(xì)菌回復(fù)突變?cè)囼?yàn)，也是目前微生物檢測(cè)藥物致突變最常見(jiàn)的方法，它能檢測(cè)多種因化學(xué)誘導(dǎo)致遺傳損傷的可能使人類致癌的化合物。判斷受試藥物有無(wú)誘變性是依據(jù)加入被測(cè)藥物平皿中回變生長(zhǎng)的菌落數(shù)并與自發(fā)對(duì)照平皿中的菌落數(shù)相比較得出的，即在本試驗(yàn)中所選用的TA系列菌株是組氨酸合成缺陷型菌株，在組氨酸含量微小的培養(yǎng)基上，這種細(xì)菌僅能分裂幾次，只能形成背景，不能形成菌落。當(dāng)這些菌株被誘變劑作用之后，在一定條件下，就可能發(fā)生回復(fù)突變而變成具有野生型生物學(xué)特征的原養(yǎng)型菌株，這些菌株就可在組氨酸缺乏的情況下，應(yīng)用培養(yǎng)基中所含有的其他成分自我合成組氨酸，使得可以繼續(xù)生長(zhǎng)分裂最終形成菌落[21]。

劉寧（2011）[17]做的致突變性的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：復(fù)方奧硝唑甲磺酸培氟沙星緩釋制劑不存在致突變性。在有無(wú)代謝活化劑S9的情況下，其各劑量組與陰性對(duì)照組均無(wú)顯著性差異，而經(jīng)陽(yáng)性誘導(dǎo)劑誘導(dǎo)的回復(fù)突變的菌落數(shù)目均遠(yuǎn)大于陰性對(duì)照組的2倍以上，呈明顯的陽(yáng)性結(jié)果，且活化平板摻入試驗(yàn)中菌落回變數(shù)并未比非活化平板摻入試驗(yàn)有明顯增加，因而該藥物無(wú)致突變性。軟件預(yù)測(cè)培氟沙星的致突變性為3，即有少量的致突變性，與實(shí)驗(yàn)的不致突變相矛盾?？赡苁怯捎趯?shí)驗(yàn)所用的沙門菌的菌株特點(diǎn)與軟件所設(shè)定的不同，并且試驗(yàn)中加入了活化系統(tǒng)。

4 結(jié)論

預(yù)測(cè)培氟沙星是否具有急性毒性，軟件的預(yù)測(cè)值為331.58 mg/kg,根據(jù)軟件的評(píng)估，只要預(yù)測(cè)值大于或等于300 mg/kg,即可說(shuō)明測(cè)定的化合物無(wú)急性毒性。但是根據(jù)我國(guó)對(duì)急性毒性評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)，331.58 mg/kg屬于51～500，四級(jí)，中等毒性。文獻(xiàn)查找的結(jié)果是培氟沙星的急性毒性的值為1 690 mg/kg，換算后的數(shù)據(jù)與真實(shí)值的差距造成的主要原因可能是大鼠和小鼠的差別。培氟沙星是否會(huì)導(dǎo)致皮膚過(guò)敏，軟件預(yù)測(cè)為nontoxic，即該化合物不會(huì)導(dǎo)致皮膚過(guò)敏，和文獻(xiàn)查找的數(shù)據(jù)一樣，因此可以說(shuō)軟件對(duì)結(jié)果進(jìn)行了正確的預(yù)測(cè)。

預(yù)測(cè)培氟沙星是否具有致癌性，根據(jù)實(shí)驗(yàn)對(duì)象的不同，軟件預(yù)測(cè)大鼠的TD50為2.39 mg/(kg·d)，小于無(wú)致癌性的最低值4 mg/(kg·d)，所以預(yù)測(cè)培氟沙星對(duì)大鼠有致癌性。軟件預(yù)測(cè)小鼠的TD50為139 mg/(kg·d)，大于小鼠無(wú)致癌性的最低值25 mg/(kg·d)，所以預(yù)測(cè)培氟沙星對(duì)小鼠無(wú)致癌性。因?yàn)槟壳盀橹共⑽凑业较嚓P(guān)文獻(xiàn)的佐證，所以軟件對(duì)結(jié)果是否進(jìn)行了正確的預(yù)測(cè)不得而知。

預(yù)測(cè)培氟沙星是否具有生殖毒性，軟件預(yù)測(cè)無(wú)生殖毒性。文獻(xiàn)記載的實(shí)驗(yàn)結(jié)果為無(wú)生殖毒性，但是高劑量組會(huì)對(duì)一系列的生殖器官和相關(guān)系數(shù)造成不良影響。從很大程度上說(shuō)可以認(rèn)為軟件對(duì)結(jié)果進(jìn)行了正確的預(yù)測(cè)。

預(yù)測(cè)培氟沙星是否具有致突變性，軟件預(yù)測(cè)該化合物具有小可能的致突變性，與文獻(xiàn)報(bào)道的無(wú)致突變性相矛盾。造成這種不一致的原因可能是由于實(shí)驗(yàn)所用的沙門菌的菌株特點(diǎn)與軟件所設(shè)定的不同，并且試驗(yàn)中加入了活化系統(tǒng)。所以針對(duì)致癌性軟件的預(yù)測(cè)不是很準(zhǔn)確的。