乳源性小肽DELQ的抗衰老功效研究

沈鵬，程志才，陳靜，李婉如，占東升，張少輝，3

（1.上海交通大學(xué)農(nóng)業(yè)與生物學(xué)院，上海200240；2.浙江熊貓乳業(yè)集團股份有限公司，浙江溫州325800；3.上海交通大學(xué)陸伯勛食品安全研究中心，上海200240）

乳源性小肽DELQ的抗衰老功效研究

沈鵬1，程志才1，陳靜1，李婉如1，占東升2，張少輝1，3

（1.上海交通大學(xué)農(nóng)業(yè)與生物學(xué)院，上海200240；2.浙江熊貓乳業(yè)集團股份有限公司，浙江溫州325800；3.上海交通大學(xué)陸伯勛食品安全研究中心，上海200240）

在體外研究結(jié)果表明，乳源性小肽DELQ具有良好的生物活性基礎(chǔ)上，采用秀麗線蟲為實驗?zāi)Ｐ?，研究DELQ的抗衰老功效。首先以生殖能力為指標(biāo)，在線蟲培養(yǎng)基中添加不同濃度的DELQ，選出最佳作用濃度；同時設(shè)立對照組和實驗組，評價DELQ對線蟲壽命以及生殖能力的影響。然后采用熱應(yīng)激和氧化應(yīng)激實驗，探討DELQ的抗衰老機理。結(jié)果表明：400 mg/L的DELQ為最佳作用質(zhì)量濃度；DELQ在一定質(zhì)量濃度下能延緩線蟲衰老，顯著增加SOD質(zhì)量濃度；提升線蟲生殖能力；耐熱力增加不明顯；但能顯著提高線蟲的抗氧化力，MDA及ROS值均下降，SOD明顯增高。因此，乳源性小肽DELQ能通過清除自由基，提升機體抗氧化力來延緩線蟲衰老，故推測DELQ具有一定的抗衰老功效。

乳源性小肽；最佳作用濃度；抗衰老；秀麗線蟲

0 引言

乳源性小肽來源于天然發(fā)酵乳制品，是一種安全的食物成分。同時，又因其可能具有多種生物活性，如抗衰老、抗氧化以及免疫調(diào)節(jié)等功能，具有很好的應(yīng)用前景，正在成為熱門的研究課題[1-2]。目前，已有大量活性肽被發(fā)現(xiàn)，如抗氧化肽、免疫調(diào)節(jié)肽等[3-5]。在本課題研究前期階段，盧珊珊等[6]經(jīng)過長期研究，發(fā)現(xiàn)來自瑞士乳桿菌發(fā)酵乳中的生物活性肽Asp-Glu-Leu-Gln（DELQ）具有較好的清除自由基及體外抗氧化活力，并和濃度呈正相關(guān)性。

根據(jù)導(dǎo)致衰老的自由基理論[7]，在正常生物體內(nèi)代謝產(chǎn)生的超氧陰離子自由基（O2-）是引起衰老以及與衰老相關(guān)疾病的主要原因之一。金贏凱等[8]發(fā)現(xiàn)乳源性小肽LPLP具有改善動物的抗氧化功能，并能夠減輕小鼠因衰老而產(chǎn)生的炎癥。

本文以秀麗線蟲作為動物模型，從多個指標(biāo)出發(fā)研究了DELQ抗衰老功效及其發(fā)揮抗衰老作用機理。

1 實驗

1.1材料與設(shè)備

實驗動物：秀麗線蟲（Caenorhabditis elegans），大腸菌株E.coli OP50。

實驗試劑：胰蛋白胨、瓊脂粉、酵母粉、質(zhì)量分數(shù)30%過氧化氫溶液；5-氟脲嘧啶、膽固醇；活性氧（ROS）測定試劑盒、超氧化物歧化酶（SOD）試劑盒、丙二醛（MDA）測定試劑盒；DELQ，純度＞95%。

實驗設(shè)備：THZ-32型臺式恒溫振蕩器，酶標(biāo)儀，GL-22M高速冷凍離心機，JY92-ⅡD超聲波細胞粉碎機，HWS26電熱恒溫水浴鍋，TDL-40B離心機。

1.2方法

1.2.1 大腸桿菌培養(yǎng)與涂布

取大腸桿菌菌種于LB平板劃線，挑取單菌落于10 mL LB液體培養(yǎng)基中，37℃，200 r/min，振蕩培養(yǎng)24 h，至OD600=0.4用于接種NGM平板喂養(yǎng)線蟲。取100 μL菌液涂于60 mm NGM平板，注意菌液邊緣應(yīng)距離平板邊緣0.5 cm左右。已涂布的NGM平板在室溫（21～25℃）過夜后即可使用。

1.2.2 線蟲培養(yǎng)

參照S.Brenner[9]所用方法進行線蟲培養(yǎng)。本實驗中所用的線蟲均為雌雄同體，在標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)條件（溫度20℃，濕度40%～60%）下培養(yǎng)生長。

1.2.3 線蟲的同期化與保存

（1）準(zhǔn)備孕蟲生長板（即板中80%以上蟲子處于生殖期）2-3板，取5 mL M9緩沖液沖洗2次，將緩沖液吸入15 mL離心管中，1 000 g（3 min）離心，棄去上清。加入5 mL新配同期化漂白液，室溫下劇烈振蕩2.5 min，以將成蟲蟲體腐蝕。離心，棄去上清。保證總處理時間不能超過5 min，防止損傷蟲卵。再加入M9緩沖液將沉淀重懸，混勻后離心，棄去上清，重復(fù)此過程3次。

（2）培養(yǎng)3～5板線蟲，確保平板中60%以上的線蟲進入休眠期，用M9緩沖液沖洗完全后放入30%甘油，于-80℃保存，一個月后取出同批凍存中的1～2個樣本復(fù)蘇，以檢驗復(fù)蘇成功率。

1.2.4 肽質(zhì)量濃度-效果檢測實驗

結(jié)合文獻以及預(yù)實驗結(jié)果將DELQ質(zhì)量濃度定為100，200，300，400，500 mg/L。實驗分組：0 mg/L（空白組），100，200，300，400和500 mg/L 6組；進行生殖實驗以選出DELQ作用的最佳劑量。

1.2.5 生殖實驗

本研究以秀麗線蟲作為動物模型，參照J.Gruber等[10]的方法，挑取同期化處理后的L4期線蟲到相應(yīng)質(zhì)量濃度的NGM板中。每個濃度至少8條線蟲，每個NGM板轉(zhuǎn)入一條，記為0天，以后每天移至新板中直至線蟲生殖基本不再產(chǎn)卵，在其進入產(chǎn)卵期之前對線蟲總產(chǎn)卵數(shù)進行計數(shù)。

1.2.6 壽命實驗

實驗分組：對照組和DELQ組。參照B.Lakowski等[11]的方法，選取L4期線蟲若干條，同期化處理后，分別置于相應(yīng)NGM板中；每組線蟲數(shù)量不少于60條，此時記為0 d，每天將它們轉(zhuǎn)移到新板中，到生殖后期不再轉(zhuǎn)移。每天記錄線蟲死亡及剔除出實驗的條數(shù)。其中壽命實驗每個NGM板中含有質(zhì)量濃度為12.5 mg/L 5-氟脲嘧啶以抑制線蟲生殖。

線蟲死亡判斷標(biāo)準(zhǔn)：無移動及吞咽動作，輕觸后仍無任何反應(yīng)。剔除標(biāo)準(zhǔn)：①逃離至平板壁或蓋上而干死；②蟲卵在體內(nèi)孵化而成袋樣蟲：③鉆入瓊脂中。

1.2.7 壓力應(yīng)激實驗

1.2.7.1 急性熱應(yīng)激實驗

實驗分組：對照組和DELQ組。參照Mark等[12]的方法，將同期化處理后的L4期線蟲置于相應(yīng)NGM板中，每板不少于40條，實驗置于35℃進行，每隔1 h計數(shù)線蟲死亡、存活數(shù)目，線蟲死亡標(biāo)準(zhǔn)同壽命實驗。

1.2.7.2 急性氧化應(yīng)激實驗

實驗分組：正常組和DELQ組。參照A.Duhon等[13]的方法，將同期化處理后的L4期線蟲置于相應(yīng)NGM板中，實驗在濃度為20 mmol/L的H2O2的NGM平板中進行，每板數(shù)量不少于10條，每半小時計數(shù)線蟲死亡、存活數(shù)目。線蟲死亡標(biāo)準(zhǔn)同壽命實驗。

1.2.8 超氧化物歧化酶、丙二醛及活性氧測定

實驗分為無處理實驗組、加熱處理實驗組及氧化處理實驗組。其中，無處理實驗組又分為空白無處理組和DELQ無處理組，培養(yǎng)方法同壽命實驗，待線蟲長至L4期，用M9緩沖液將其沖洗并離心，去除上清液，加入PBS緩沖液，超聲破碎2 min，離心得到其組織勻漿上清液，并立即進行超氧化物歧化酶（SOD）、丙二醛（MDA）以及活性氧（ROS）指標(biāo)測定。加熱處理實驗組又分為空白熱處理組和DELQ熱處理組，培養(yǎng)方法同急性熱應(yīng)激實驗，培養(yǎng)2 h后，測定其各項指標(biāo)，檢測方法與無處理實驗組相同。氧化處理實驗組又分為空白氧化處理組和DELQ氧化處理組，培養(yǎng)方法同急性氧化應(yīng)激實驗，培養(yǎng)1 h后，測定其各項指標(biāo)，測定方法與無處理實驗組相同。

1.2.9 統(tǒng)計學(xué)分析

實驗結(jié)果所有數(shù)據(jù)均用SPSS軟件進行處理，成對數(shù)據(jù)t檢驗進行顯著性分析，當(dāng)P<0.05時認為具有顯著性差異，P<0.01時認為具有極顯著差異。當(dāng)P>0.05雖然認為在統(tǒng)計學(xué)上不具有顯著性差異，但不排除生理學(xué)上有顯著性差異的可能。

2 結(jié)果與分析

2.1生殖實驗結(jié)果

實驗結(jié)果如表1所示，與不喂食DELQ的空白組相比較，喂食不同質(zhì)量濃度的實驗組中，其平均產(chǎn)卵數(shù)均有不同程度的增加。但當(dāng)喂食質(zhì)量濃度為400 mg/L時，線蟲平均產(chǎn)卵數(shù)與空白組相比具有顯著差異（P＜0.05），其繁殖力得到明顯提升。此實驗結(jié)果表明，400 mg/L為最適質(zhì)量濃度。但隨著質(zhì)量濃度的增加，線蟲的生殖能力卻不再出現(xiàn)明顯提高。

類似現(xiàn)象在其他實驗中也有發(fā)現(xiàn)，陸沛等[14]利用不同濃度梯度的白藜蘆醇喂食線蟲，發(fā)現(xiàn)并非喂食藥物濃度越高效果越好。王艷菊等[15]用葡萄籽原花青素以100，200，300 g/mL質(zhì)量濃度梯度喂養(yǎng)線蟲時發(fā)現(xiàn)，當(dāng)質(zhì)量濃度為200 g/mL時，線蟲平均壽命延長最為明顯。因此，有可能是400 mg/L的DELQ質(zhì)量濃度已達到其在線蟲體內(nèi)發(fā)揮作用的閾值，而隨著濃度的增加，其作用效果不再明顯提高。與此同時，熱量限制學(xué)說[16]也逐漸被接受。通過限制食物的攝取可以延長線蟲、果繩等的壽命，其機制可能與降低代謝率、減少氧化應(yīng)激等的發(fā)生有關(guān)[17]。所以，猜測還有可能是DELQ達到一定質(zhì)量濃度后，出于熱量限制的因素，線蟲不再攝食。

本研究以線蟲生殖能力為指標(biāo)，篩選得到DELQ最佳作用質(zhì)量濃度為400 mg/L。以此作為壽命實驗、急性應(yīng)激實驗的濃度。生殖能力實驗可以用來評價藥物在延壽作用的同時對生殖能力有無損害，是否為通過生殖與壽命之間的“利弊權(quán)衡”機制而起作用。而這種“利弊權(quán)衡”機制最為合理的解釋就是“有限資源的矛盾需求”學(xué)說[18]。

表1 不同質(zhì)量濃度DELQ對秀麗線蟲生殖能力的影響

但隨著研究的進一步深入，發(fā)現(xiàn)很多自然界中具有延長壽命功效的天然物并不均遵循此機制。本實驗室高揚等[19]發(fā)現(xiàn)果蠅壽命的延長是QEPV直接作用的結(jié)果而非通過降低繁殖力實現(xiàn)的。同時，本研究預(yù)實驗也發(fā)現(xiàn)DELQ延長線蟲壽命的機制也并非通過抑制生殖實現(xiàn)。因此，采用線蟲生殖能力為指標(biāo)優(yōu)化DELQ濃度是最為有效、快速的方式，得到的結(jié)果適合后續(xù)實驗。

2.2壽命實驗結(jié)果

由表2可以看出，當(dāng)喂食質(zhì)量濃度為400 mg/L時，實驗組中線蟲的平均壽命延長了約7.20%，同時，其半數(shù)死亡時間得到了顯著性提高（P＜0.05），而最長壽命時間相比于空白組也延長3 d。圖1中更是可以直觀地看出，相同時間點，實驗組中線蟲存活率均明顯高于空白組，線蟲壽命得到延長。

這證明DELQ能夠有效延緩線蟲衰老，提高存活率，而同時也進一步證明DELQ延長壽命的作用并非通過抑制線蟲繁殖力來實現(xiàn)，推測可能是因其具有良好的抗氧化功能和較強的清除自由基能力。

表2 DELQ對線蟲壽命的影響

圖1 DELQ對線蟲壽命的影響

衰老是一個高等級、也是最基本生物體中普遍存在的生物學(xué)過程，主要表現(xiàn)在機體功能減退、環(huán)境適應(yīng)能力及抵抗能力下降。根據(jù)導(dǎo)致衰老的自由基理論，生物體在新陳代謝過程中產(chǎn)生的超氧陰離子自由基（O2-）是引起機體衰老主要原因之一[20]。目前已有大量文獻報道具有延緩衰老、減少機體發(fā)病的活性化合物，而小分子活性肽正是其中一種有效物質(zhì)。Aru?mugam等[21]發(fā)現(xiàn)干酪乳桿菌代謝產(chǎn)物喂食線蟲能夠顯著提高其存活率，推測可能是乳酸菌分解底物所產(chǎn)生的活性多肽發(fā)揮著作用。關(guān)樹文等[22]利用單體亞血紅素六肽（DhHP-6），發(fā)現(xiàn)其能有效提高秀麗線蟲的平均壽命20%左右，延緩線蟲衰老。這說明小分子多肽具有較強的抗氧化、清除自由基的功能，本實驗的結(jié)果也證明了這一點。

2.3壓力應(yīng)激實驗結(jié)果

2.3.1 熱應(yīng)激實驗

由表3可以看出，在熱應(yīng)激條件下，實驗組和空白組中半數(shù)死亡時間和平均壽命并無顯著性差異，而實驗組中最長壽命僅延長了1 d。由圖2可以看出，線蟲在0～10 d之內(nèi)，空白組與實驗組并無明顯區(qū)別；在10 d之后，實驗組存活率略高于空白組。

這說明在熱應(yīng)激條件下，飼喂DELQ對于延長線蟲壽命的效果并不顯著。

表3 DELQ對線蟲在熱應(yīng)激下的影響

圖2 DELQ對線蟲在熱應(yīng)激下的影響

2.3.2 氧化應(yīng)激實驗結(jié)果

由表4可以看出，實驗組線蟲在氧化應(yīng)激下平均壽命具有顯著性提高（P＜0.05），其半數(shù)死亡時間也相應(yīng)在一定程度上有所延長。如圖3所示，在氧化應(yīng)激條件下，實驗組存活率均明顯高于空白組存活率。

這說明在氧化應(yīng)激條件下，線蟲的存活率得到了顯著提高，可能是由于其能有效幫助線蟲抵抗氧化損傷，清除體內(nèi)產(chǎn)生的自由基以及降低過氧化物的積累，而非通過增強其耐熱力實現(xiàn)的。

表4 DELQ對線蟲在氧化應(yīng)激下的影響

圖3 DELQ對線蟲在氧化應(yīng)激下的影響

機體壽命的延長在一定程度上是由于改善了細胞對脅迫條件的抵抗力，因而延緩衰老與壓力應(yīng)激條件下的存活率存在很大關(guān)系[23-24]。有研究表明，在脅迫條件下線蟲的存活率越高，則其壽命延長效果越好[25]。Pietsch等[26]發(fā)現(xiàn)，槲皮素不僅可以延長線蟲壽命，而且增加了線蟲在熱脅迫和氧化脅迫下的存活率。本研究結(jié)果證明DELQ能顯著地增加線蟲的壓力應(yīng)激和氧化應(yīng)激能力，提高線蟲的存活率，說明一定質(zhì)量濃度的DLEQ對于線蟲具有抗衰老的功效。

2.4超氧化物歧化酶、丙二醛及活性氧測定結(jié)果

在熱應(yīng)激和氧化應(yīng)激存活率實驗的基礎(chǔ)上，又進一步對線蟲體內(nèi)的各項指標(biāo)進行了測定。由表5可以看出，與空白無處理實驗組比，空白熱處理實驗組和空白氧化處理實驗組中丙二醛（MDA）和活性氧（ROS）值均顯著性增加，超氧化物歧化酶（SOD）顯著減?。≒＜0.05），這說明無論是熱應(yīng)激，還是氧化應(yīng)激均能對線蟲機體造成損傷。與此同時，還可以發(fā)現(xiàn)DELQ無處理組中SOD明顯提升（P＜0.05），高揚等[19]在實驗中也發(fā)現(xiàn)，在QEPV飼喂質(zhì)量濃度為0.5 g/L和1 g/L時，果蠅的SOD值出現(xiàn)顯著性增加。這很好的反映了DELQ等乳源性小肽對于線蟲，并不僅僅是一種營養(yǎng)物質(zhì)，還能有效提高機體的抗氧化能力，保護機體免受外界不良因子的刺激。

在35℃處理條件下，DELQ組與不加DELQ組相比僅MDA減小（P＜0.05），而ROS與SOD卻無變化，這進一步佐證了DELQ并不能提高其在應(yīng)激條件下的耐熱能力。

在濃度為20 mmol/L的H2O2處理條件下，DELQ組中MDA和ROS值均明顯低于不加DELQ組（P＜0.05），SOD也顯著提高（P＜0.05），分析認為可能是DELQ在線蟲體內(nèi)能有效提高SOD含量，減少脂質(zhì)過氧化物以及活性氧的產(chǎn)生，表現(xiàn)出良好的抗氧化、清除自由基功能。

SOD等誘導(dǎo)酶能及時清除自身過多的自由基，保持體內(nèi)自由基的代謝平衡，是衡量機體健康狀況的指標(biāo)；MDA可以反映機體內(nèi)脂質(zhì)過氧化物反應(yīng)程度，間接反映機體受損傷程度；活性氧簇ROS是需氧細胞在代謝過程中產(chǎn)生的，能通過氧化應(yīng)激反應(yīng)導(dǎo)致細胞凋亡，因此，三個指標(biāo)結(jié)合使用能很好地反映出機體的抗氧化能力以及受損傷程度。根據(jù)本實驗的結(jié)果，DELQ能在一定程度上提高線蟲體內(nèi)的抗氧化酶系活性，并在氧化應(yīng)激條件下，有效保護機體抵抗氧化損害，清除自由基，但并不能明顯提高其耐熱力。

表5 DELQ對線蟲SOD、MDA及ROS的影響

3 結(jié)束語

本研究通過對線蟲壽命、生殖能力、壓力應(yīng)激下的存活率以及各項抗氧化指標(biāo)測定，研究了乳源性小肽DELQ所具有的抗氧化、清除自由基以及延緩衰老的功效及機理。研究結(jié)果表明，一定濃度的DELQ能明顯提高線蟲體內(nèi)抗氧化物酶活力，減少過氧化物等有害物質(zhì)的產(chǎn)生，有效延緩線蟲衰老，同時并不會損害線蟲的生殖能力。這進一步說明，DELQ是安全、無毒、具有良好的抗氧化活性。結(jié)果也證明了DELQ并不是通過增強線蟲耐熱力來延緩衰老。隨著濃度的增加，線蟲生殖能力卻沒有明顯的提升，這可能原因是DELQ發(fā)揮作用的能力達到了其閾值，再增加效果不再明顯，或是由于熱量限制，導(dǎo)致線蟲不再利用DELQ。然而，機體的衰老一個緩慢而復(fù)雜的生理學(xué)過程，而自由基清除學(xué)說只能解釋其中一部分。因此，本研究為開展DELQ的抗衰老功效研究奠定了基礎(chǔ)，其實際效果有待進一步深入采用高級動物實驗來驗證。

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Anti-aging efficacy of milk-derived peptide DELQ in caenorhabditis elegans

SHEN Peng1，CHENG Zhi-cai1，CHEN Jing1，LI Wan-ru1，ZHAN Dong-shen2，ZHANG Shao-hui1，3
（1.School of Agriculture and Biology，Shanghai Jiao Tong University，Shanghai 200240，China；2.Zhejiang Panda Dairy Pty.Ltd.，Wenzhou 325800，China；3.SJTU Bor S.Luh Food Safety Research Center，Shanghai 200240，China）

This research was based on the vitro study that milk-derived peptide DELQ showed good biological activities，c.elegans were used as experimental model to study the anti-aging efficacy of DELQ，which were treated with different concentrations of DELQ，tested by reproductive capacity assay to determine the effective dosage.The synchronized L4s were treated as control group and experimental group，in which the indexes of lifespan，fecundity，acute heat and oxidative stress were included，to explore the initial mechanism of anti-aging func?tion.As results showed，400 mg/L of DELQ was the best dosage for c.elegans to extend lifespan and enforce fecundity；DELQ had a signifi?cant effect on c.elegans’bodies in the level of SOD，MDA and ROS to protect against oxidant stress，but not did so in heat resistance.In conclusion，DELQ performed well in scavenging free radicals and enhancing oxidation resistance to help extend lifespan in some extent.

milk-derived peptide；the effective dosage；anti-aging；c.elegans

Q936

A

1001-2230（2016）09-0007-05

2016-04-09

沈鵬（1991-），男，碩士研究生，主要研究方向為乳制品生物活性。

張少輝