Glut9在果糖誘導大鼠高尿酸血癥中的作用*

王 雨， 林志健， 聶安政， 張 冰

(北京中醫(yī)藥大學中藥學院，北京 100029)

Glut9在果糖誘導大鼠高尿酸血癥中的作用*

王 雨， 林志健， 聶安政， 張 冰△

(北京中醫(yī)藥大學中藥學院，北京 100029)

目的： 觀察腎臟轉運蛋白葡萄糖轉運體9(Glut9)與腎臟尿酸排泄的關系，探討果糖誘導的高尿酸血癥的病理機制。方法：將30只雄性SD大鼠按體質量隨機分為正常組、模型組與苯溴馬隆組，正常組給予清水，模型組與苯溴馬隆組給予10%果糖飲水建立高尿酸血癥模型。正常組與模型組給予清水灌胃，苯溴馬隆組給予20 mg/kg苯溴馬隆灌胃，實驗第42天處死。檢測大鼠血清尿酸和尿尿酸水平，計算腎臟尿酸清除率，并測定肝臟黃嘌呤氧化酶活性。利用免疫組化觀察Glut9在各組大鼠腎臟的表達位點及其蛋白表達含量，實時熒光定量PCR(RT-qPCR)檢測各組大鼠腎臟Glut9的mRNA表達水平。結果：實驗第20～40天，與正常組比較，模型組的血尿酸水平顯著升高，尿尿酸與尿酸清除率的差異無統(tǒng)計學顯著性；實驗第20天，與模型組比較，苯溴馬隆組的血尿酸水平顯著降低，但尿尿酸和尿酸清除率的差異無統(tǒng)計學顯著性。實驗第40天，模型組的肝臟黃嘌呤酶活性較正常組顯著升高，但與模型組比較差異無統(tǒng)計學顯著性。免疫組化實驗結果顯示，與正常組比較，模型組腎臟的Glut9蛋白表達顯著增加；苯溴馬隆組腎臟的Glut9蛋白表達少于模型組。RT-qPCR結果顯示，各組腎臟Glut9 mRNA表達水平之間的差異并無統(tǒng)計學顯著性。結論：10%果糖飲水可成功誘導大鼠高尿酸血癥模型；果糖誘導高尿酸血癥病理機制可能與上調腎臟Glut9蛋白水平、增加腎臟對尿酸的重吸收有關。

高尿酸血癥； 果糖； 腎臟轉運蛋白； 葡萄糖轉運體9

高尿酸血癥是機體血尿酸水平過飽和的一種病理現(xiàn)象，是導致痛風的主要危險因素。有研究顯示，果糖的大量消耗與血尿酸水平升高具有密切聯(lián)系。人體內的尿酸2/3由腎臟排泄，1/3由腸道排泄。腎臟轉運蛋白葡萄糖轉運體9(glucose transpoter 9, Glut9)由SLC2A9編碼。有學者通過對克羅地亞人基因組研究發(fā)現(xiàn)，尿酸濃度變化的1.7%～5.3%與SLC2A9基因序列有關[1]。本實驗觀察高尿酸血癥狀態(tài)下大鼠腎臟Glut9 mRNA及蛋白表達的變化，從腎臟尿酸排泄角度，切入轉運蛋白角度探討果糖誘導的高尿酸血癥大鼠的病理機制。

材 料 和 方 法

1 動物

雄性SD大鼠30只，體質量(240±10) g，購于斯貝福(北京)實驗動物科技有限公司，動物合格證號為SCXK(京)2011-0004。

2 主要試劑和儀器

D-果糖(AMRESCO)；苯溴馬隆片(Heumann Pharma)；尿酸試劑盒(中生北控生物科技股份有限公司)；肌酐(creatinine，Cre)、黃嘌呤氧化酶(xanthine oxidase，XOD)檢測試劑盒(南京建成生物工程研究所)；TRIzol(Ambion)；氯仿、異丙醇等分析純試劑(北京化工廠)；6×RNA loading buffer和GoldView核酸染料(博邁德生物科技有限公司)；瓊脂糖(北京拜爾迪有限公司)；RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit(Thermo)；Universal SYBR Green Super Mix(Bio-Rad)；Glut9抗體(Millipore)；兔超敏二步免疫組化試劑PV-9001、DAB顯色試劑盒和抗體稀釋液(北京中杉金橋生物技術有限公司)。

Sunrise酶標儀(Teacan)；低溫高速離心機(Sigma)；恒溫水浴箱(北京醫(yī)療設備廠)；B1-220H電子天平(SHIMADZU)；Quawell UV-Vis Spectrotometer Q5000(北京五洲東方科技發(fā)展有限公司)；CFX96 PCR儀(Bio-Rad)；FluorChem凝膠成像系統(tǒng)(香港安萊公司)；石蠟組織切片機(AO)；顯微鏡和Image-Pro Plus 6.0圖像分析軟件(Olympus)。

3 方法

3.1 動物分組及處理 SD大鼠適應性飼養(yǎng)5 d后，按體質量隨機分為正常組、模型組與苯溴馬隆組，每組10只。正常組給予清水，模型組與苯溴馬隆組給予10%果糖飲水造模。正常組與模型組給予清水灌胃，苯溴馬隆組給予20 mg/kg苯溴馬隆灌胃。

3.2 相關指標檢測 動物取血前禁食不禁水12 h，并稱量體重，分別于實驗的第10、20、30和40天時尾尖取血，3 000 r/min離心10 min，分離血清，檢測血清尿酸(serum uric acid，SUA)。于取血第2天，將動物放進代謝籠，禁食不禁水，收集24 h尿液，檢測尿尿酸(urinary uric acid，UUA)。尿酸清除率(clearance rate of uric acid，CUA)=UUA/SUA×每分鐘尿量(mL/min)。實驗結束后，處死動物取材。肝臟于-20 ℃保存，組織與生理鹽水1∶9制成10%組織勻漿，根據(jù)試劑盒說明書檢測肝臟XOD活性。部分腎臟以4%多聚甲醛固定，用于制作組織石蠟切片，部分腎臟立即于-80 ℃保存，用于提取腎臟總mRNA。

3.3 免疫組化染色 4 μm組織石蠟切片60 ℃烤片1 h，常規(guī)脫蠟復水，PBS孵育5 min×3次；0.01 mol/L檸檬酸鈉緩沖溶液水浴熱修復30 min后冷卻至室溫，PBS孵育5 min×3次；滴加3% H2O2，避光室溫孵育15 min，PBS孵育5 min、3次；滴加I抗(1∶1 000稀釋)，濕盒內4 ℃孵育過夜；37 ℃復溫孵育1 h，PBS孵育5 min×3次；滴加PV-9001聚合物輔助劑，37 ℃濕盒孵育1 h，PBS清洗5 min×3次；滴加PV-9001辣根酶標記抗兔IgG聚合物，37 ℃濕盒孵育1 h，PBS清洗5 min×3次；滴加新鮮配制DAB工作液，顯微鏡下觀察，棕色顆粒染色后PBS清洗5 min×3次；乙醇梯度脫水，二甲苯透明，中性光學樹脂封固，封片。

3.4 圖像采集與分析 Olympus顯微鏡下采集圖像，各組織切片選取5個互不重疊的視野，高速彩色CCD相機采集圖像。以Image-Pro Plus 6.0圖像分析系統(tǒng)進行免疫組化染色結果分析，測定陽性顆粒積分吸光度(integral absorbance,IA)和陽性表達面積(positive expression area，PEA)。

3.5 RT-qPCR檢測Glut9的mRNA表達 取新鮮凍存的大鼠腎臟組織50～100 mg，于液氮中充分研磨至粉末狀，置于無酶EP管中，加入1 mL TRIzol，室溫孵育5 min，加入200 μL氯仿，劇烈振蕩15 s，室溫孵育3 min，于4 ℃ 12 000×g離心15 min，取上清500 μL置于新管中，加入等體積異丙醇，混勻，室溫孵育10 min，于4 ℃ 12 000×g離心15 min，棄上清，加入1 mL 4 ℃預冷75%乙醇，4 ℃ 7 500×g離心10 min，棄上清，空氣干燥10 min，加入30 μL無酶水溶解，55 ℃水浴10 min。于波長260 nm和280 nm下測定吸光度(A)值，計算A260/A280和腎臟總RNA濃度。1%瓊脂糖凝膠電泳，180 V，15 min，觀察腎臟總RNA完整性。每個樣本取4 μg總RNA作為模板按RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit步驟合成cDNA第1鏈。

用Primer Premier 5.0軟件設計PCR引物，選用GAPDH為內參照，由北京博邁德基因技術有限公司合成。Glut9的上游引物序列為5′-TGCATTGGCGTGTTTTCTGG-3′，下游引物序列為5′-GTTTGGAAGGCTTTCGTGGC-3′；GAPDH的上游引物序列為5′-GGTGGACCTCATGGCCTACA-3′，下游引物序列為5′-ATTGTGAGGGAGATCCTCAGTGT-3′。RT-qPCR反應體系為20 μL，包含cDNA模板2 μL，上、下游引物各1 μL，Universal SYBR Green Super Mix 10 μL，無酶水7 μL。擴增條件為: 95 ℃ 30 s； 95 ℃ 5 s， 60 ℃ 30 s， 40個循環(huán)。65 ℃～95 ℃ 每5 s升高0.5 ℃進行熔解曲線分析。結果用2-ΔΔCt計算，以相對值表示。

4 統(tǒng)計學處理

使用SAS 9.0軟件進行統(tǒng)計分析，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差(mean±SD)表示，多組間數(shù)據(jù)比較根據(jù)各組正態(tài)及方差齊與否選擇單因素方差分析或是Kruskal-Wallis軼和檢驗，組間兩兩比較根據(jù)方差齊與否選擇采用Dunnett’st檢驗或Dunnett’s T3檢驗，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結 果

1 實驗動物的一般狀態(tài)

實驗期間各組動物生長狀態(tài)良好，體重逐漸增長且各組組間差異無統(tǒng)計學顯著性,見表1。

表1 實驗期間大鼠體重的變化情況

2 實驗期間大鼠血清尿酸水平的變化

實驗第20天至第40天，與正常組相比，模型組的SUA水平均顯著升高(P<0.05)；實驗第20天，與模型組相比，苯溴馬隆組的SUA水平顯著降低(P<0.05)，見表2。

表2 實驗期間大鼠血清尿酸水平變化情況

SUA: serum uric acid.*P<0.05,**P<0.01vsnormal;#P<0.05vsmodel.

3 實驗期間大鼠腎臟尿酸排泄指標

實驗第40天，各組間24 h尿量、UUA和CUA的差異均無統(tǒng)計學顯著性,見表3。

4 大鼠肝臟尿酸代謝相關酶XOD活性變化

實驗第42天，與正常組比較，模型組肝臟的XOD活性顯著升高(P<0.01)；苯溴馬隆組與模型組比較差異無統(tǒng)計學顯著性，見表3。

表3 實驗第40天大鼠UUA、CUA水平變化情況和實驗第42天大鼠肝臟黃嘌呤氧化酶活性的變化

UUA: urinary uric acid; CUA: clearance rate of uric acid; XOD: xanthine oxidase.**P<0.01vsnormal.

5 大鼠腎臟Glut9免疫組化染色及半定量分析

免疫組化染色結果如圖1所示，Glut9在各組大鼠腎臟均有表達，主要表達于腎臟近曲小管頂膜。相較于正常組，模型組IA顯著增加(P<0.01)；苯溴馬隆組的PEA顯著少于模型組(P<0.05)，IA的差異無統(tǒng)計學顯著性,見表4。

Figure 1.The expression of Glut9 in the renal tissues of different groups (immunohistochemical staining, scale bar=50 μm).

圖1 Glut9在大鼠腎臟組織中的表達

6 大鼠腎臟Glut9 mRNA表達的變化

RT-qPCR檢測大鼠腎臟Glut9的mRNA相對表達量，結果顯示各組Glut9的mRNA表達水平之間的差異并無統(tǒng)計學顯著性，見表4。

表4 各組大鼠腎臟Glut9的mRNA和蛋白相對表達量的比較

Table 4.The expression of Glut9 at mRNA and protein levels in the renal tissues of different groups (Mean±SD.n=6)

GroupmRNA(ΔCt)PEAIANormal8.30±0.408.82±3.530.81±0.25Model7.33±1.0213.22±3.98**1.14±0.39**Benzbromar-one8.15±0.279.58±4.20##0.95±0.56

PEA: positive expression area;IA: integral absorbance.**P<0.01vsnormal;##P<0.01vsmodel.

討 論

高尿酸血癥(hyperuricemia,HUA)與果糖攝入關系密切。墨西哥一項橫斷面研究[2]顯示，成年人甜味劑攝入量越高，患高尿酸血癥的風險越大。Choi等[3]對美國14 761名20歲以上人群體檢報告進行分析，發(fā)現(xiàn)含糖軟飲料的消費量與血尿酸水平及高尿酸血癥的發(fā)病率密切相關。Pillinger等[4]對49 116名健康男性隨訪12年，對其果糖攝入量和痛風患病率做風險評價，并進行多元線性回歸，發(fā)現(xiàn)其二者呈正相關。Wang等[5]對相關文獻進行Meta分析，發(fā)現(xiàn)果糖的過度攝入可升高血尿酸濃度，增加高尿酸血癥發(fā)病風險。流行病學及臨床研究[6-7]亦表明，果糖攝入過多可引起血尿酸水平升高，甚至引發(fā)痛風。本研究模擬臨床上果糖誘導的高尿酸血癥，連續(xù)給予SD雄性大鼠10%果糖飲水40 d，自實驗第20天，模型組大鼠SUA水平與正常組相比顯著升高。這與Hu等[8]和劉小青等[9]的研究結果一致。

尿酸生成過多與排泄減少均可形成HUA。肝臟是尿酸生成的主要場所，XOD是尿酸生成過程中重要的限速酶，XOD可將尿酸的前體物質催化代謝為尿酸，肝臟XOD活性的升高可增加體內尿酸的生成。本研究中觀察到實驗第40天，相較于正常組，模型組的肝臟XOD活性顯著性升高，提示果糖誘導的高尿酸血癥的形成與尿酸生成途徑相關，這與本實驗室前期研究結果一致[10]。Abdulla等[11]提出高果糖攝入可引起腎臟血液動力學及排泄功能的相關改變，本研究發(fā)現(xiàn)實驗第40 d，與正常組相比，模型組SUA顯著升高，24 h尿量與CUA無差異，表明尿酸排泄量相對減少。同時，本研究設立苯溴馬隆組作為對照，苯溴馬隆是典型的促尿酸排泄藥物，通過抑制近端腎小管對尿酸的重吸收發(fā)揮促尿酸作用。相較于模型組，實驗第20天，苯溴馬隆組SUA水平顯著降低。以上提示果糖誘導的高尿酸血癥的病理狀態(tài)可能并不完全依賴于尿酸生成增多。機體內尿酸的排泄，2/3經(jīng)由腎臟，1/3經(jīng)由腸道[12]，腎臟在尿酸排泄途徑中占有重要作用。

腎臟的尿酸排泄主要包括腎小球濾過、腎小管和集合管重吸收以及重吸收后的再分泌，其中，腎小球濾過的尿酸約98%被腎小管重吸收[13]。因此，腎小管的重吸收在腎臟的尿酸排泄過程中占重要地位。近年有研究顯示果糖轉運體Glut9與SUA水平密切相關[14],是高通量、低能量的尿酸鹽轉運體[15]。Glut9由基因SLC2A9編碼，分為Glut9a和Glut9b兩個亞型，Glut9a表達于多個代謝器官，而Glut9b只在肝臟和腎臟中發(fā)現(xiàn)，并且腎小管是Glut9的主要表達場所，故Glut9是高尿酸血癥的危險因子之一。本研究免疫組化染色顯示Glut9在大鼠腎臟近曲小管頂膜表達，模型組Glut9蛋白表達水平顯著高于正常組,苯溴馬隆組Glut9蛋白表達水平顯著低于模型組，這與近年來研究發(fā)現(xiàn)的苯溴馬隆可抑制Glut9的報道一致[16]。但各組大鼠腎臟Glut9的mRNA表達水平的差異并無統(tǒng)計學顯著性。以上結果表明果糖誘導的大鼠高尿酸血癥的病理機制，可能是通過調控Glut9蛋白表達，使其在蛋白水平的表達升高，從而增加腎小管對尿酸的重吸收，減少腎臟尿酸排泄量，使血尿酸水平升高。

綜上所述，本研究觀察腎臟轉運蛋白Glut9對腎臟排泄尿酸的影響，研究果糖誘導的高尿酸血癥大鼠的病理機制。結果表明，果糖誘導的高尿酸血癥大鼠腎臟尿酸排泄量相對下降，其病理機制可能與模型組大鼠Glut9蛋白表達水平上調有關。本研究結果為高尿酸血癥藥物的防治提供了一定的參考，并可供高尿酸血癥的腸道排泄途徑的研究以借鑒。

[1] Vitart V, Rudan I, Hayward C, et al. SLC2A9 is a newly identified urate transporter influencing serum urate concentration, urate excretion and gout[J]. Nat Genet, 2008, 40(4):437-442.

[2] Lawrence RC, Hochberg MC, Kelsey JL, et al. Estimates of the prevalence of selected arthritic and musculoskeletal diseases in the United States[J]. J Rheumatol, 1989, 16(4):427-441.

[3] Choi JW, Ford ES, Gao X, et al. Sugar-sweetened soft drinks, diet soft drinks, and serum uric acid level: the Third National Health and Nutrition Examination Survey[J]. Arthritis Rheum, 2008, 59(1):109-116.

[4] Pillinger MH, Abeles AM. Such sweet sorrow: fructose and the incidence of gout[J].Curr Rheumatol Rep, 2010, 12(2):77-79.

[5] Wang DD, Sievenpiper JL, de Souza RJ, et al. The effects of fructose intake on serum uric acid vary among controlled dietary trials[J]. J Nutr, 2012, 142(5):916-923.

[6] Bray GA. Energy and fructose from beverages sweetened with sugar or high-fructose corn syrup pose a health risk for some people[J]. Adv Nutr, 2013, 4(2):220-225.

[7] Batt C, Phipps-Green AJ, Black MA, et al. Sugar-sweetened beverage consumption: a risk factor for prevalent gout with SLC2A9 genotype-specific effects on serum urate and risk of gout[J]. Ann Rheum Dis, 2014, 73(12):2101-2106.

[8] Hu QH, Wang C, Li JM, et al. Allopurinol, rutin, and quercetin attenuate hyperuricemia and renal dysfunction in rats induced by fructose intake: renal organic ion transporter involvement[J]. Am J Physiol Renal Physiol, 2009, 297(4):F1080-F1091.

[9] 劉小青, 張 冰, 林志健, 等. 高果糖大鼠血清TG、UA、血糖的動態(tài)變化規(guī)律及機制研究[J].中國病理生理雜志, 2009, 25(4):651-655.

[10]李麗玉，林志健，張 冰，等. 連續(xù)高果糖飲水對大鼠尿酸水平的影響及其病理機制[J]. 中華臨床營養(yǎng)雜志, 2014, 22(6):368-374.

[11]Abdulla MH, Sattar MA, Johns EJ. The relation between fructose-induced metabolic syndrome and altered renal haemodynamic and excretory function in the rat[J]. Int J Nephrol, 2011, 2011:934659.

[12]Abramson RG, Levitt MF. Use of pyrazinamide to assess renal uric acid transport in the rat: a micropuncture study[J]. Am J Physiol, 1976, 230(5):1276-1283.

[13]Lipkowitz MS. Regulation of uric acid excretion by the kidney[J]. Curr Rheumatol Rep, 2012, 14(2):179-188.

[14]Dalbeth N, House ME, Gamble GD, et al. Population-specific influence of SLC2A9 genotype on the acute hyperuricaemic response to a fructose load[J]. Ann Rheum Dis, 2013, 72(11):1868-1873.

[15] Wright AF, Rudan I, Hastie ND, et al. A ‘complexity’ of urate transporters[J]. Kidney Int, 2010, 78(5):446-452.

[16]Bibert S, Hess SK, Firsov D, et al. Mouse GLUT9: evidences for a urate uniporter[J]. Am J Physiol Renal Physiol, 2009, 297(3):F612-F619.

(責任編輯： 林白霜， 羅 森)

Effect of renal transporter Glut9 on hyperuricemia in rats induced by fructose

WANG Yu, LIN Zhi-jian, Nie An-zheng, ZHANG Bing

(SchoolofChineseMateriaMedica,BeijingUniversityofChineseMedicine,Beijing100029,China.E-mail:zhangbing6@263.net)

AIM: To explore the effect of renal transporter glucose transporter 9 (Glu9) on hyperuricemia in the rats induced by fructose.METHODS: SD male rats (n=30) were randomly divided into normal group, model group and benzbromarone group, according to the weight. The rats in normal group was given water, while the rats in model group and benzbromarone group were given 10% fructose solution to establish hyperuricemia model. At the same time, the rats in normal group and model group were given a gavage of distilled water, while the rats in benzbromarone group were given benzbromarone at the dose of 20 mg/kg. The rats were sacrificed on the 40th day. The serum uric acid (SUA) and urinary uric acid (UUA) were detected to calculate the clearance rate of uric acid (CUA) in the kidney. The activity of hepatic xanthine oxidase (XOD) was also measured. The expression of renal Glut9 at mRNA and protein levels was determined by RT-qPCR and immunohistochemical staining. RESULTS: From the 20th day to the 40th day, the SUA in model group was significantly higher than that in normal group, but the UUA and CUA had no difference. On the 20th day, the SUA in benzbromarone group was markedly decreased as compared with model group, but UUA and CUA had no significant difference. On the 40th day, the hepatic XOD activity in model group was significantly elevated, and no difference of XOD between model group and the benzbromarone group was observed. Compared with normal group, the protein expression of Glut9 in the renal tissues of model group were markedly increased, and that in benzbromarone group was significantly lower than that in model group. However, no difference of the Glut9 mRNA expression was observed among groups. CONCLUSION: Fructose drinking induces hyperuricemia in rats, which is probably related to the up-regulation of renal Glut9 expression at protein level, and the increase in the reabsorption of uric acid in the kidneys.

Hyperuricemia; Fructose; Renal transporter; Glucose transporter 9

1000- 4718(2016)12- 2287- 05

2016- 03- 14

2016- 11- 02

北京市自然科學基金資助項目(No.7162117);教育部高等學校博士學科點專項科研基金資助項目(No.20130013120001); 北京中醫(yī)藥大學研究生專項自主課題(No.2016-JYB-XS100)

R363.2

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2016.12.028

雜志網(wǎng)址： http://www.cjpp.net

△通訊作者 Tel： 010-64286335; E-mail： zhangbing6@263.net