產(chǎn)多糖菌的篩選及其發(fā)酵條件研究

摘 要：微生物多糖可由微生物進行大規(guī)模發(fā)酵生產(chǎn)，因此可以降低多糖的生產(chǎn)成本，并有可能獲得具備特殊性能的多糖。本研究從海水和海藻取樣，獲得6株可能具備產(chǎn)多糖能力的菌種，然后進行搖瓶復篩，B1號菌的多糖產(chǎn)量最大，因此選擇B1號菌進行進一步的發(fā)酵條件優(yōu)化研究。當發(fā)酵溫度為25℃時，多糖產(chǎn)量達到最高。發(fā)酵接種量對發(fā)酵的影響較小，接種量為5%時，多糖產(chǎn)率最高，接種量繼續(xù)增加，多糖的產(chǎn)量有所下降，且最終確定發(fā)酵36小時為最佳的發(fā)酵時間。

關鍵詞：微生物多糖；產(chǎn)多糖菌株；發(fā)酵條件優(yōu)化

1 概述

多糖是一類天然大分子物質(zhì)，由于具備優(yōu)良的生物活性，大量的活性基團，因此在眾多研究領域有廣泛的應用[1][2][3]。微生物多糖是由微生物在發(fā)酵過程中產(chǎn)生，具備各種不同的生物活性，已經(jīng)在抗腫瘤，抗感染以及石油化工等領域有了諸多的應用，并可以作為各種化學品，如絮凝劑，保鮮劑等在食品、醫(yī)藥、化工領域等發(fā)揮作用[4][5]。從海洋中篩選獲得產(chǎn)多糖微生物，目前也是產(chǎn)多糖微生物研究領域的研究熱點，在本課題中，以海水和秦皇島海域野生海藻進行取樣，篩選出產(chǎn)多糖的海洋微生物，并對該產(chǎn)多糖微生物的多糖發(fā)酵條件進行研究，獲得最佳的發(fā)酵條件，為多糖微生物的篩選及發(fā)酵研究提供了新的研究思路。

2 材料與方法

2.1 培養(yǎng)基

篩選固體培養(yǎng)基：酵母粉5g/L，蛋白胨10g/L，NaCl 10g/L，瓊脂20g/L。

搖瓶液體培養(yǎng)基：蛋白胨5g/L，葡萄糖5g/L，K2HPO3 2g/L。

2.2 試驗方法

2.2.1 產(chǎn)多糖菌的篩選

從海水及海藻取樣。各自稱量約10g海水和海藻塊，溶解于無菌水中，磁力攪拌作用得到菌懸液。分別標記為A和B。吸取稀釋液均勻涂布到已經(jīng)滅菌的篩選固體培養(yǎng)基上，進行培養(yǎng)。觀察菌落形態(tài)，選擇粘稠菌落進行劃線分離純化保藏。將活化后的菌種接種到液體搖瓶培養(yǎng)基中，轉(zhuǎn)速為150r/min，震蕩培養(yǎng)48小時，選擇胞外多糖含量最大的菌種為后續(xù)研究菌種。

2.2.2 產(chǎn)多糖菌的發(fā)酵實驗

設定不同的發(fā)酵溫度，接種量，培養(yǎng)時間，確定最佳發(fā)酵條件。

2.2.3 胞外多糖含量的測定：

苯酚硫酸法[6]

2.2.4 菌株生理特征分析：

方法對照手冊。

3 結果與討論

3.1 產(chǎn)多糖菌的篩選

經(jīng)過前期的培養(yǎng)實驗，挑選不同菌落并進行劃線分離培養(yǎng)后，本次試驗分離純化出6株菌落粘稠且不同形態(tài)的菌種。他們的培養(yǎng)基編號分別是A1號、B1號、B2號、A3號、B3號、B4號。并通過搖瓶發(fā)酵，取出發(fā)酵液進行觀察。經(jīng)苯酚硫酸法測定后，B1的多糖產(chǎn)率最高，為后續(xù)研究菌種。

3.2 菌種生理特征

分析顯示B1為革蘭氏陽性菌，淀粉水解試驗陽性，V-P試驗陰性，檸檬酸鹽實驗陰性，油脂水解實驗陰性。

3.3 發(fā)酵條件優(yōu)化

對產(chǎn)多糖菌B1的發(fā)酵條件進行優(yōu)化，以期達到最佳的發(fā)酵效果和最大的多糖產(chǎn)量。

本課題中采用的是恒溫發(fā)酵過程，選擇不同的發(fā)酵溫度，并判斷其對產(chǎn)多糖效果的影響，20℃多糖產(chǎn)量為0.77g/L，25℃多糖產(chǎn)量為0.94g/L，30℃多糖產(chǎn)量為0.82g/L，35℃多糖產(chǎn)量為0.71g/L，40℃多糖產(chǎn)量為0.52g/L，多糖產(chǎn)量隨著發(fā)酵溫度的升高，先增加后減少，且當發(fā)酵溫度為25℃時，多糖產(chǎn)量達到最高，溫度高于30℃后，多糖產(chǎn)量明顯下降。在最佳的發(fā)酵溫度條件下，選擇不同的接種量，判斷海洋產(chǎn)多糖微生物發(fā)酵產(chǎn)量隨接種量的變化規(guī)律，2%接種量時，多糖產(chǎn)量為0.88g/L；5%接種量時，多糖產(chǎn)量為0.94g/L；8%接種量多糖產(chǎn)量為0.76g/L；10%接種量時，多糖產(chǎn)量為0.75g/L；15%接種量時，多糖產(chǎn)量為0.7g/L。接種量為5%時，多糖產(chǎn)率最高，接種量繼續(xù)增加，多糖的產(chǎn)量有所下降。在確定發(fā)酵溫度和發(fā)酵接種量的基礎之上，對發(fā)酵時間進行研究。24小時，產(chǎn)物濃度為0.47g/L，發(fā)酵產(chǎn)物的濃度隨在48小時達到最高為1.04g/L，而發(fā)酵36小時的產(chǎn)物濃度為0.94g/L，基本接近最高值，考慮到發(fā)酵時間的優(yōu)化，最終確定發(fā)酵36小時為最佳的發(fā)酵時間。

4 結束語

本課題篩選一株能產(chǎn)生多糖的海洋微生物B1，對B1菌進行了生理生化特征分析，且對其發(fā)酵條件進行了研究，為進一步的應用研究提供了一定的理論基礎。

參考文獻

[1]梅秀明，潘道東.乳酸乳球菌胞外多糖的分離及其體外抗氧化活性研究[J].食品科學，2009，30（1）：232-235.

[2]袁建鋒，蔡恒，單咸 ，等.一株芽孢桿菌胞外多糖的分離純化及其抗氧化性測定[J].微生物學通報，2009，36（10）：1466-1470.

[3]吳東儒.糖類的生物化學[M].北京：高等教育出版社，1987.

[4]郭守東.微生物胞外多糖的結構及其抗氧化活性研究[D].中國海洋大學，2010

[5]李靜.一株多糖高產(chǎn)菌株的研究與應用[D].貴州大學，2006.

[6]馬波.產(chǎn)多糖海洋菌的篩選與發(fā)酵動力學研究[D].廣西大學，2006.