烤煙根際土壤產(chǎn)普魯蘭酶菌株的分離鑒定及產(chǎn)酶活性

摘要：通過以支鏈淀粉為碳源的初篩分離培養(yǎng)和以普魯蘭糖為惟一碳源的鑒別復(fù)篩，從濃香型烤煙根際土壤中分離到一株具有產(chǎn)普魯蘭酶活性的菌株，編號為CLM2。通過形態(tài)特征、生化特性和16S rDNA序列分析及系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹的構(gòu)建，確定CLM2隸屬于芽孢桿菌屬（Bacillus），暫命名為Bacillus sp. CLM2。在以玉米淀粉為碳源、35 ℃、180 r/min條件下的發(fā)酵歷程中，發(fā)酵54 h時普魯蘭酶活力達(dá)到最大值，為4.3 U/mL。

關(guān)鍵詞：植物內(nèi)生菌；分離；普魯蘭酶；16S rDNA；烤煙根際土壤

中圖分類號：Q939.9；Q949.9 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A 文章編號：0439-8114（2016）15-3856-04

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2016.15.012

Abstract：Strain CLM2 with function of pullulanase-producing was isolated from rhizosphere soil of tobacco by using amylopectin and pullulan respectively as the sole carbon source. Based on standard morphological， physiological properties， 16S rDNA sequence and the construction of phylogenetic tree， the CLM2 belongs to the genus Bacillus，and temporarily named Bacillus sp. CLM2. After fermentation for 54 h， its enzyme activity reached a maximum of 4.3 U/mL under the condition of 35 ℃，180 r/min by using corn starch as the sole carbon.

Key words：plant endophy； isolation； pullulanase； 16S rDNA； rhizosphere soil of tobacco

普魯蘭酶（Pullulanase，EC3.2.1.41）屬于淀粉酶類的脫支酶（Isoamylase，EC3.2.1.9）范疇，它是水解支鏈淀粉、普魯蘭糖、極限糊精的一種α-1，6糖苷鍵酶，能使支鏈淀粉脫支形成長短不一的直鏈淀粉或麥芽糖低聚物，催化產(chǎn)物以麥芽糖寡糖為主[1]。而自然界的淀粉大多含有80%的支鏈淀粉[1-3]，所以普魯蘭酶是高效利用淀粉不可缺少的關(guān)鍵酶之一，在食品與醫(yī)藥行業(yè)具有重要地位，一直是微生物功能酶研究的熱點(diǎn)[2-5]。但不同來源的普魯蘭酶往往對底物作用專一性會存在差異，因此，對具有普魯蘭酶活性菌株的篩選分離工作從未停止過。世界范圍內(nèi)除了丹麥NOVO公司通過開發(fā)酸性普魯蘭芽孢桿菌生產(chǎn)的普魯蘭酶外[2]，文獻(xiàn)報道的大多數(shù)野生菌株發(fā)酵產(chǎn)酶活性普遍較低，即使是通過克隆技術(shù)實(shí)現(xiàn)的普魯蘭酶基因外源表達(dá)所構(gòu)建的工程菌株[6-8]也往往達(dá)不到工業(yè)化生產(chǎn)的發(fā)酵產(chǎn)酶效果。所以，持續(xù)分離篩選活性較高的產(chǎn)普魯蘭酶菌株仍然具有很強(qiáng)的現(xiàn)實(shí)意義。

植物內(nèi)生菌是一個巨大的遺傳多樣性寶庫，豐富多樣的植物為內(nèi)生菌提供了多元復(fù)雜的生活環(huán)境，內(nèi)生菌的豐富程度以及所具備的精彩紛呈的生物學(xué)特性，為微生物功能酶菌株的分離和開發(fā)提供了更多可能[9]。煙草是一種重要的傳統(tǒng)經(jīng)濟(jì)植物，既有藥用價值，也是香煙制作原材料，中國的煙草種植面積和產(chǎn)量均居世界首位，已經(jīng)形成了完整的產(chǎn)業(yè)鏈[6，7]。迄今為止，尚未見烤煙根際土壤產(chǎn)普魯蘭酶菌株分離鑒定的報道?；谝陨媳尘?，本研究以濃香型烤煙豫煙6號根際土為試驗(yàn)材料，分離培養(yǎng)具有產(chǎn)普魯蘭酶活性菌株，旨在豐富產(chǎn)普魯蘭酶菌株野生資源。

1 材料與方法

1.1 材料

烤煙根際土樣：采自河南省漯河市煙草種植基地生產(chǎn)田。

支鏈淀粉固體分離培養(yǎng)基：蛋白胨10 g，酵母提取物5 g，支鏈淀粉3 g，NaCl 5 g，瓊脂粉20 g，去離子水1 000 mL，pH 7.0。

普魯蘭糖鑒別培養(yǎng)基：蛋白胨6 g，酵母提取物4 g，NaCl 5 g，普魯蘭糖3 g，瓊脂粉20 g，去離子水1 000 mL，pH 7.0。

LB種子培養(yǎng)基：蛋白胨10 g，酵母粉5 g，NaCl 5 g，去離子水1 000 mL，pH 7.0。

發(fā)酵產(chǎn)酶培養(yǎng)基：玉米淀粉20 g，酵母粉10 g，KH2PO4 0.5 g，K2HPO4 0.5 g，F(xiàn)eSO4 0.01 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，去離子水1 000 mL，pH 7.0。

所用支鏈淀粉和普魯蘭糖購自Sigma公司，其他均為國產(chǎn)。

1.2 方法

1.2.1 產(chǎn)普魯蘭酶菌株的分離 取5 g土樣，加入滅菌的45 mL去離子水中，振蕩20 min，制成10-1的土壤稀釋液，再按10倍梯度稀釋至10-6。分別取10-4、10-5、10-6稀釋梯度菌懸液50 μL涂布于支鏈淀粉固體分離培養(yǎng)基，恒溫培養(yǎng)箱中30 ℃培養(yǎng)48 h后，選取典型菌落連續(xù)進(jìn)行3次平板劃線純化，并將純化菌種斜面4 ℃保存。

通過支鏈淀粉固體分離培養(yǎng)基初篩后，將初篩菌株轉(zhuǎn)接于普魯蘭糖鑒別培養(yǎng)基。30 ℃恒溫培養(yǎng)48 h，滴加盧氏碘液，將具有水解圈者確定為具有普魯蘭酶活性菌株。

1.2.2 篩選菌株的產(chǎn)酶活性測定 制備粗酶液，將具有水解圈菌株接種到裝有50 mL種子培養(yǎng)基的三角瓶中，37 ℃、160 r/min搖床培養(yǎng)16 h，然后取6 mL轉(zhuǎn)接于裝有75 mL產(chǎn)酶培養(yǎng)基的1 000 mL三角瓶中，相同條件下?lián)u床培養(yǎng)70 h，每隔4 h取樣一次，發(fā)酵上清液即為粗酶液。采用DNS法對粗酶液進(jìn)行酶活性測定，參照文獻(xiàn)[9]并稍作改進(jìn)。

1.2.3 篩選菌株的鑒定 應(yīng)用普通光學(xué)顯微鏡和掃描電子顯微鏡對菌株進(jìn)行形態(tài)觀察[10]；生理生化指標(biāo)測定方法參照文獻(xiàn)[11，12]進(jìn)行。

菌株的16S rDNA分析：將目標(biāo)菌株接種于LB種子培養(yǎng)基，37 ℃、180 r/min搖床培養(yǎng)12 h，獲取菌液。采用TaKaRa MiniBEST Bacterial Genomic DNA Extraction kit Ver. 2.0試劑盒提取ZXYG5基因組DNA。

16S rDNA PCR擴(kuò)增引物：正向引物27F（5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′），反向引物1492R（5′-TAGGGTTACCTTGTTACGACTT-3′）。PCR擴(kuò)增體系（20 μL）：10×Ex Taq PCR buffer 2 μL，dNTP（10 mmol/mL）1.6 μL，正、反向引物（20 μmol/mL）各1 μL，DNA模板1 μL，Ex Taq DNA聚合酶0.2 μL，超純水13.2 μL。擴(kuò)增程序：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性45 s，50 ℃退火45 s，72 ℃延伸100 s，循環(huán)32次；72 ℃最終延伸7 min。目的片段長度為1.5 kb左右，PCR產(chǎn)物經(jīng)過1%瓊脂糖凝膠電泳，采用TaKaRa MiniBEST Agarose Gel DNA Extraction kit Ver. 3.0進(jìn)行膠回收，回收產(chǎn)物與TaKaRa pMDTM18-T Vector連接，并將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化于DH5α感受態(tài)細(xì)胞，37 ℃培養(yǎng)過夜，經(jīng)藍(lán)白斑篩選，挑選陽性克隆搖菌進(jìn)行序列測定（由北京奧克鼎盛生物科技有限公司完成）。

將測序獲得的16S rDNA序列提交NCBI數(shù)據(jù)庫進(jìn)行相似性比對，采用MEGA6.06軟件構(gòu)建Neighbor-Joining系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹。菌株鑒定參照文獻(xiàn)[13，14]進(jìn)行。

2 結(jié)果與分析

2.1 產(chǎn)普魯蘭酶菌株的分離結(jié)果

通過支鏈淀粉固體分離培養(yǎng)基的分離培養(yǎng)和普魯蘭糖鑒別培養(yǎng)基的鑒別復(fù)篩，并經(jīng)過劃線純化，獲得一株水解圈大而顯著的菌株（圖1），編號為CLM2，確定其具有產(chǎn)普魯蘭酶活性，為研究菌株。

2.2 菌株CLM2的產(chǎn)普魯蘭酶活性測定

對CLM2菌株采用DNS法進(jìn)行普魯蘭酶活性測定，結(jié)果顯示，在ZXYG5菌株產(chǎn)酶歷程中，發(fā)酵54 h時，普魯蘭酶活性達(dá)到最高4.3 U/mL，進(jìn)一步說明該菌株具有較強(qiáng)的產(chǎn)普魯蘭酶活性（圖2）?？勺鳛橄掠握T變育種、發(fā)酵條件優(yōu)化等研究的良好出發(fā)菌株。

2.3 菌株CLM2的多項(xiàng)分類鑒定

2.3.1 菌株CLM2的形態(tài)特征 菌株CLM2為桿型細(xì)菌，大?。?.7～1.2） μm×（1.2～3.2） μm，無莢膜，能運(yùn)動；好氧，在LB平板上35 ℃培養(yǎng)48 h，菌落近圓形，邊緣不整齊，直徑1～2 mm，表面粗糙，扁平。菌落淺灰色，生長5 d以上后，中心亞緣區(qū)域略有紅色（圖3a）；芽孢橢圓形，位于中間或次極端（圖3b）。掃描電鏡下可見典型桿型菌體，兩端鈍圓，具鞭毛（圖3c）。

2.3.2 菌株CLM2的生理生化鑒定 對菌株CLM2進(jìn)行的生理生化指標(biāo)測定結(jié)果（表1）表明，菌株CLM2被初步鑒定為芽孢桿菌屬（Bacillus）[9，10]。

2.3.3 菌株CLM2的16S rDNA鑒定 菌株CLM2的16S rDNA序列PCR擴(kuò)增條帶清晰，如圖4所示。

將目的條帶進(jìn)行膠回收，與質(zhì)粒連接后轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌，經(jīng)過藍(lán)白斑篩選，對陽性克隆進(jìn)行測序。測序獲得的CLM2菌株16S rDNA序列長度為1 515 bp。將序列提交NCBI（National Center for Biotechnology Information）的blast程序進(jìn)行在線相似性比對，并選取相似度高的菌株序列構(gòu)建CLM2菌株的系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹。結(jié)果（圖5）顯示，菌株CLM2與芽孢桿菌屬（Bacillus）的5個菌株聚在同一分支上，而且bootstrap值達(dá)到100%，說明菌株CLM2基于16S rDNA序列的系統(tǒng)歸屬具有較高的可信度。綜合菌株的形態(tài)特征、生理生化特性和分子鑒定結(jié)果，將菌株CLM2歸為芽孢桿菌屬，暫命名為Bacillus sp. CLM2。

3 小結(jié)與討論

文獻(xiàn)報道的產(chǎn)普魯蘭酶菌株資源類群主要有Bacillus flavocaldarius、 B. stearothermophilus、 B. thetaiotaomicron、 B. Licheniformis、 B. Naganoensis、Bacillus sp. KSM-1378、Caldicellulosiruptor saccharolyticus、 Fervidobacterium pennavorans、 Kiebsiella aerogenes、 K. pneumoniae、 Thermotoga maritima、Thermoanaerobacter ethanolus、 Thermoactinomyces ethanolicus等，但得到工業(yè)化開發(fā)利用的僅有B. Acidopullulyticus及重組B. Deramificans等極少數(shù)菌[1-4，15，16]。出現(xiàn)這種情況的主要原因一個是產(chǎn)普魯蘭酶活性較高的野生菌株資源有限，傳統(tǒng)誘變育種缺少良好的出發(fā)菌株；另一個原因是通過基因操作構(gòu)建的工程菌，多數(shù)發(fā)酵產(chǎn)酶效果達(dá)不到工業(yè)化生產(chǎn)要求。所以，從不同材料中分離培養(yǎng)更多發(fā)酵型產(chǎn)酶菌株，對普魯蘭酶來說顯得更為迫切?？緹煾H土壤是一個較為特殊的微生物生境，可能具有較為特殊生理活性的菌株。在發(fā)酵條件沒有優(yōu)化的情況下，本研究從烤煙根際土壤分離獲得的CLM2菌株的產(chǎn)酶活性達(dá)到4.3 U/mL，與有些文獻(xiàn)報道[17，18]的野生菌株相比，具有一定的優(yōu)勢，豐富了產(chǎn)普魯蘭酶菌株常規(guī)誘變育種和全基因組育種的遺傳資源。CLM2菌株經(jīng)過本研究的多項(xiàng)分類鑒定，在系統(tǒng)發(fā)育上歸屬于芽孢桿菌屬，而芽孢桿菌屬是產(chǎn)α-淀粉酶、普魯蘭酶、脂肪酶、蛋白酶等功能酶的重要屬之一，成功構(gòu)建工程菌株的案例也較多，這為菌株CLM2的下游研究提供了便利。同時，本研究也為更多產(chǎn)普魯蘭酶菌株的分離篩選提供了有益的啟示。

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