烏藥總生物堿抗炎鎮(zhèn)痛效果研究

摘要：用索氏法氨水-氯仿提取得到烏藥[Lindera aggregata （Sims） Kosterm]總生物堿，采用p-二甲苯致小鼠耳廓腫脹法和角叉菜膠致后足跖腫脹法、小鼠熱板法和乙酸致小鼠扭體法等方法來(lái)評(píng)估烏藥總生物堿的抗炎鎮(zhèn)痛效果。結(jié)果表明，烏藥總生物堿有緩解p-二甲苯致小鼠耳廓腫脹及角叉菜膠致后足跖腫脹的效果，能顯著減少小鼠在熱板上舔后足的次數(shù)和減少乙酸致小鼠扭體的次數(shù)，鎮(zhèn)痛效果顯著。

關(guān)鍵詞：烏藥[Lindera aggregata （Sims） Kosterm]；總生物堿；抗炎；鎮(zhèn)痛

中圖分類(lèi)號(hào)：R285.5 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：0439-8114（2016）19-5101-03

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2016.19.053

Abstract： The anti-inflammatory and analgesic effects of total alkaloids extracted by Soxhlet method with the ammonia and chloroform as the solvent，were observed by p-xylene-induced mice ear swelling method，carrageenan-induced paw swelling method，hot plate method and aceti cacid writhing method in mice. Results showed that，the total alkaloids from Lindera Radix could obviously relieve mice ear swelling and carrageenan-induced paw swelling，significantly reduce the number of the mice licking hind and decrease mice acid-induced writhing times. The analgesic effect of Linderae Radix was remarkable.

Key words： Linderae Radix； total alkaloids； anti-inflammatory； analgesia

烏藥[Lindera aggregata （Sims） Kosterm]系樟科（Lauraceae）山胡椒屬（Lindera）植物，主產(chǎn)于浙江、湖南、江西等地。藥用部位主要為直根及連珠狀塊根[1]，為傳統(tǒng)的常用理氣止痛藥，具有溫腎散寒的功效[2]?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，烏藥具有廣泛的藥理活性[3]。烏藥主要成分為多種異喹啉類(lèi)生物堿、揮發(fā)油、呋喃倍半萜、酚類(lèi)、有機(jī)酸、黃酮等化學(xué)成分[4]，異喹啉類(lèi)生物堿、呋喃倍半萜、烏藥醚內(nèi)酯與烏藥內(nèi)酯等為烏藥的特征性化學(xué)成分[5，6]。本試驗(yàn)主要以烏藥直根及連珠狀塊根為主要藥用部位，用索氏法氨水-氯仿提取，經(jīng)真空干燥得到烏藥總生物堿[7]，并用烏藥總生物堿（TALR）進(jìn)行抗炎鎮(zhèn)痛研究。

1 材料與方法

1.1 主要儀器

索氏提取器、98-1-C型數(shù)顯控溫電熱套（天津泰斯特）、DZF6050型電熱真空干燥箱（上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司）、N-1000v-w型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（EYELA日本東京理化器械株式會(huì)社）、HH-4型電熱恒溫水浴鍋（上海市百典儀器廠）、FA2004型電光分析天平（上海精密科學(xué)儀器廠）。

1.2 主要試劑

氨水、氯仿、碘化鉀、鹽酸、乙酸、對(duì)二甲苯等，均為國(guó)產(chǎn)分析純（AR）；生理鹽水（四川科倫藥業(yè)股份有限公司）；阿司匹林（南京白敬宇制藥有限公司）；角叉菜膠（Sigma公司），注射用水配制1%角叉菜膠混懸液，在冰箱4 ℃條件下保存；其他試驗(yàn)用水為重蒸餾水。

試驗(yàn)所用樣品采自江西信豐，經(jīng)贛南醫(yī)學(xué)院彭金年博士鑒定為烏藥。

1.3 試驗(yàn)動(dòng)物

昆明種小鼠，體質(zhì)量18～22 g，購(gòu)自湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，許可證號(hào)：SCXK（湘）2011-0003，合格證號(hào)：No.43004700015959。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)均采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，數(shù)據(jù)以x±s表示。多樣本均數(shù)的比較采用單因素方差分析。P<0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 索氏法氨水-氯仿提取烏藥總生物堿

稱(chēng)取經(jīng)干燥和粉碎過(guò)的烏藥直根與塊根500 g，分為若干份，均用適量氨水拌勻，濕潤(rùn)密閉放置30 min，分次裝入索氏提取器，加三氯甲烷用電熱套加熱回流提取3 h，對(duì)提取液TLC（薄層色譜），并進(jìn)行碘化鉀試驗(yàn)至不顯紅色為止，稍冷過(guò)濾，將各份濾液合并，得濾液Ⅰ，將濾液Ⅰ在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上濃縮三氯甲烷提取液，濃縮液用1%的鹽酸純化，過(guò)濾，得濾液Ⅱ，再向?yàn)V液Ⅱ加氨水至pH為9，密閉，靜置過(guò)夜，過(guò)濾，得烏藥總生物堿（TALR），真空干燥，干燥品研成細(xì)粉，將其用重蒸水在100 mL容量瓶中配制成混懸液，得烏藥總生物堿溶液TALR1；搖勻，用移液管移取50 mL TALR1溶液至100 mL容量瓶中，配制成TALR2溶液；搖勻，再用移液管向TALR2中移取50 mL溶液至100 mL容量瓶中，配制成TALR3溶液。

2.2 烏藥總生物堿（TALR）對(duì)p-二甲苯致小鼠耳廓腫脹的試驗(yàn)[8，9]

取健康、體質(zhì)量18～22 g的雄性昆明種小鼠50只，每組10只，隨機(jī)分為5組，小鼠空白組灌胃（ig）給生理鹽水0.2 mL/10 g體質(zhì)量，陽(yáng)性藥物組灌胃（ig）給阿司匹林2 mg/10 g體質(zhì)量，試驗(yàn)組分別灌胃（ig）給烏藥總生物堿TALR1、TALR2、TALR3各0.2 mL/10 g體質(zhì)量，相同時(shí)間段，每天1次，連續(xù)給藥 5 d，末次給藥60 min后，在乙醚麻醉狀態(tài)下，每只小鼠輕涂對(duì)二甲苯于左耳廓正反兩面致炎，右耳不涂為正常耳作對(duì)照，4 h后將小鼠麻醉頸椎脫臼致死，沿耳廓基線剪下左右兩耳，用直徑9 mm的鋒利打孔器在左右耳相同部位打下圓耳片，分別用電光分析天平稱(chēng)重，以每只小鼠的左右耳片質(zhì)量之差作為耳廓腫脹程度，計(jì)算平均腫脹度和標(biāo)準(zhǔn)差，并以平均腫脹度計(jì)算腫脹抑制率，見(jiàn)表1。

腫脹度=用藥左耳片質(zhì)量-未用藥右耳片質(zhì)量

腫脹抑制率=

由表1可知，索氏法氨水-氯仿提取所得烏藥總生物堿（TALR），與空白生理鹽水組相比，TALR1、TALR2對(duì)p-二甲苯致小鼠耳廓腫脹有明顯的抑制作用（P﹤0.01），腫脹抑制率達(dá)46.28%和40.76%，表明較高濃度的烏藥總生物堿抗炎作用明顯。

2.3 烏藥總生物堿（TALR）對(duì)角叉菜膠致小鼠后足跖腫脹的試驗(yàn)[8-10]

給藥處理同“2.2”，末次給藥60 min后，在乙醚麻醉狀態(tài)下，用26號(hào)針頭注射器向每只小鼠右后足跖部皮下進(jìn)針注入1%角叉菜膠混懸液0.05 mL致炎，左足不注射角叉菜膠為正常足作對(duì)照，5 h后，將小鼠在麻醉狀態(tài)下頸椎脫臼致死，于踝關(guān)節(jié)處剪下左右后足，分別用電光分析天平稱(chēng)重，以每只小鼠的左右后足質(zhì)量之差作為足腫脹程度，計(jì)算平均腫脹度和標(biāo)準(zhǔn)差，并用平均腫脹度計(jì)算腫脹抑制率，見(jiàn)表2。

腫脹度=用藥右后足質(zhì)量-未用藥左后足質(zhì)量

腫脹抑制率=

由表2可知，索氏法氨水-氯仿提取所得烏藥總生物堿（TALR），與空白生理鹽水組相比，TALR1、TALR2均能顯著抑制因角叉菜膠所致小鼠右后足跖的腫脹，腫脹抑制率為42.49%和36.12%。

2.4 物理刺激法對(duì)小鼠舔足反應(yīng)的試驗(yàn)[8，9]

先將熱板容器置于恒溫水浴中，加熱至（55±0.5） ℃，取健康、體質(zhì)量18～22 g的雌性昆明種小鼠，逐一將其放于熱板上，分別測(cè)每只小鼠的正常痛閾值：從小鼠放于熱板上至出現(xiàn)其舔后足反應(yīng)止的潛伏時(shí)間為正常痛閾值（s），間隔30 min，再測(cè)定第2次，以2次痛閾值的平均時(shí)間為每只小鼠給藥前的正常痛閾值。將潛伏時(shí)間小于5 s或大于30 s、或跳躍的小鼠剔除。取測(cè)定痛閾值合格的小鼠40只，每組8只，隨機(jī)分為5組，空白組灌胃（ig）給生理鹽水0.2 mL/10 g體質(zhì)量，陽(yáng)性藥物組灌胃（ig）給阿司匹林2 mg/10 g體質(zhì)量，試驗(yàn)組分別灌胃（ig）給烏藥總生物堿TALR1、TALR2、TALR3各0.2 mL/10 g體質(zhì)量，相同時(shí)間段，每天1次，連續(xù)給藥5 d，各組最后一次給藥后于30、60、90 min測(cè)定小鼠的痛閾值，若小鼠在熱板上60 s無(wú)舔后足反應(yīng)，立即取出，以60 s計(jì)，見(jiàn)表3。由表3可知，烏藥總生物堿（TALR）能明顯延遲小鼠舔后足的時(shí)間，小鼠的痛閾值增大，即鎮(zhèn)痛效果明顯。

2.5 化學(xué)試劑刺激法對(duì)小鼠扭體反應(yīng)的試驗(yàn)[8，9]

給藥處理同“2.2”，末次給藥60 min后，每鼠腹腔注射（ip）0.6%乙酸0.1 mL/10 g體質(zhì)量，從注射乙酸后開(kāi)始觀察小鼠出現(xiàn)腹部?jī)?nèi)凹、軀干與后肢伸張、臀部高起等扭體反應(yīng)，并記錄從注射乙酸后15 min內(nèi)各鼠扭體的次數(shù)，以此計(jì)算烏藥總生物堿（TALR）對(duì)小鼠扭體反應(yīng)的疼痛抑制率，作為評(píng)判烏藥總生物堿（TALR）鎮(zhèn)痛的效果標(biāo)準(zhǔn)，見(jiàn)表4。由表4可知，烏藥總生物堿（TALR），可明顯抑制乙酸所致小鼠的扭體次數(shù)，即與空白生理鹽水組相比有顯著差異，特別是TALR1和TALR2與空白生理鹽水組比較呈極顯著性（P﹤0.01）。

疼痛抑制率=

3 小結(jié)

烏藥用不同溶劑提取所得產(chǎn)物成分相差較大，本試驗(yàn)用索氏法氨水-氯仿提取后，經(jīng)濃縮干燥得烏藥總生物堿（TALR），由于烏藥總生物堿為含酚羥基類(lèi)的異喹啉類(lèi)生物堿，所以在提取、濃縮、干燥及試驗(yàn)過(guò)程中盡可能用氮?dú)獗Ｗo(hù)，并貯存于棕色容器。

試驗(yàn)采用的是生理鹽水作空白組、阿司匹林作陽(yáng)性對(duì)照組、以烏藥總生物堿不同濃度TALR1、TALR2、TALR3對(duì)p-二甲苯致小鼠耳廓腫脹和角叉菜膠致小鼠后足跖腫脹等進(jìn)行抗炎試驗(yàn)，數(shù)據(jù)分析結(jié)果表明，烏藥總生物堿抗炎效果明顯；物理熱板法致小鼠舔后足反應(yīng)和化學(xué)試劑乙酸致小鼠扭體反應(yīng)試驗(yàn)結(jié)果表明，烏藥總生物堿鎮(zhèn)痛作用顯著。在烏藥總生物堿低劑量組TALR3的試驗(yàn)過(guò)程中，抗炎作用效果略差。

參考文獻(xiàn)：

[1] 許海丹，顧霞敏，葉文國(guó).烏藥化學(xué)成分的分布特性研究[J].時(shí)珍國(guó)醫(yī)國(guó)藥，2010，21（1）：100-101.

[2] 國(guó)家藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)藥典（一部）[M].北京：化學(xué)工業(yè)出版社，2010.

[3] 中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥物研究所.中藥志（第二冊(cè)）[M].北京：人民衛(wèi)生出版社，1981.

[4] 侴桂新，李慶林，王崢濤，等.烏藥活性組分LEF的化學(xué)成分及抗風(fēng)濕作用[J].植物資源與環(huán)境，1999，8（4）：1-6.

[5] GAN L S，YAO W，MO J X，et al. Alkaloids from Lindera aggregata[J].Natural Product Communications，2009，4（1）：43-46.

[6] HAN Z，ZHENG Y，CHEN N，et al. Simultaneous determination of four alkaloids in Lindera aggregata by ultra-high-pressure liquid chromatography-tandem mass spectrometry[J].Journal of Chromatography A，2008，1212（1-2）：76-81.

[7] 張 劍，劉冰晶，李 超，等.紫外分光光度法測(cè)定烏藥中總生物堿含量[J].江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2014，42（3）：266-267.

[8] 徐淑云，卞如濂，陳 修.藥理實(shí)驗(yàn)方法學(xué)[M].第三版.北京：人民衛(wèi)生出版社，2002.

[9] 李儀奎.中藥藥理實(shí)驗(yàn)方法學(xué)[M].上海：上海科學(xué)技術(shù)出版社，2006.

[10] 王春梅，崔新穎，李 賀.白芷香豆素的抗炎作用研究[J].北華大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版），2006，7（4）：318-320.