組培過(guò)程中兜唇石斛的耐鹽性研究

摘要：以兜唇石斛試管苗為材料，研究組織培養(yǎng)過(guò)程中試管苗的生長(zhǎng)狀況，通過(guò)測(cè)定組織培養(yǎng)過(guò)程中分化苗合成的脯氨酸含量來(lái)確定兜唇石斛的耐鹽性。最終得到最適合兜唇石斛試管苗生長(zhǎng)的培養(yǎng)基是MS+20 g/L蔗糖+6.5 g/L瓊脂+2 mol/L 6-BA+0.6 mol/L NAA；進(jìn)行耐鹽培養(yǎng)時(shí)得到脯氨酸含量最高的培養(yǎng)基是MS+20 g/L蔗糖+6.5 g/L瓊脂+2 mol/L 6-BA+0.6 mol/L NAA+0.6%NaCl。

關(guān)鍵詞：兜唇石斛；耐鹽性；脯氨酸

中圖分類號(hào)：S682.31 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：0439-8114（2016）19-5095-03

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2016.19.051

Abstract： The seedlings of Dendrobium aphyllum were used as materials to study the propagation and salt tolerance in the tissue culture. The content of the proline from seedlings could determine salt tolerance of Dendrobium aphyllum. Finally，the most suitable medium for Dendrobium aphyllum seedlings to grow was： MS+20 g/L D（+）-Sucrose+6.5 g/L Agar+2 mol/L 6-BA+0.6 mol/L NAA. Salt tolerance culture medium：MS+20 g/L D（+）-Sucrose+6.5 g/L Agar+2 mol/L 6-BA+0.6 mol/L NAA+0.6%NaCl.

Key words： Dendrobium aphyllum； salt tolerance； proline

兜唇石斛（Dendrobium aphyllum）屬于蘭科（Orchidaceae）植物，分布于中國(guó)長(zhǎng)江以南（廣西、云南、貴州）、尼泊爾、錫金、不丹、印度東北部至中南半島和馬來(lái)西亞[1]；別名無(wú)葉石斛大光節(jié)、水草石斛，生長(zhǎng)在400～1 500 m的疏林樹(shù)干上或山谷巖石上[2]。

兜唇石斛有重要的觀賞價(jià)值和較高的藥用價(jià)值。近年來(lái)，由于蘭花愛(ài)好者收藏?cái)?shù)量增加、森林砍伐嚴(yán)重、藥用開(kāi)發(fā)過(guò)多等因素，自然界中石斛蘊(yùn)藏量逐年減少[3]。且石斛生長(zhǎng)速度緩慢，繁殖率低，許多優(yōu)良品種無(wú)法大量繁殖以滿足日益增長(zhǎng)的市場(chǎng)需求。針對(duì)這一問(wèn)題，利用組織培養(yǎng)技術(shù)可以擴(kuò)大石斛蘭生產(chǎn)規(guī)模。目前生產(chǎn)上多利用設(shè)施農(nóng)業(yè)通過(guò)溫室栽培培養(yǎng)大量石斛，而溫室的環(huán)境相對(duì)封閉，室內(nèi)的溫度較高，導(dǎo)致基質(zhì)水分大量蒸發(fā)，鹽分含量增高，不利于兜唇石斛生長(zhǎng)發(fā)育。雖然兜唇石斛已經(jīng)成為市場(chǎng)流通品種，但是目前大多數(shù)學(xué)者研究了其的化學(xué)成分[4]和多糖含量[5]等，其耐鹽性方面相關(guān)的研究尚未見(jiàn)報(bào)道。因此，本試驗(yàn)通過(guò)測(cè)定不同NaCl濃度下兜唇石斛組培苗葉片中脯氨酸的含量，研究組培過(guò)程中兜唇石斛的耐鹽性，為石斛抗逆栽培和抗性育種研究提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)材料為兜唇石斛試管苗，取自天津農(nóng)學(xué)院農(nóng)學(xué)與資源環(huán)境學(xué)院植物細(xì)胞工程研究中心。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 兜唇石斛的培養(yǎng) ①篩選最適培養(yǎng)基。取兜唇石斛種苗接種于新的培養(yǎng)基中，培養(yǎng)基配方為MS+20 g/L蔗糖+6.5 g/L瓊脂+6-BA+NAA。如表1所示，將6-BA和NAA濃度分別設(shè)定4個(gè)梯度，6-BA的梯度為0、1、2、3 mol/L，NAA的梯度為0、0.2、0.4、0.6 mol/L。一共16組配比，每組重復(fù)5次，找出兜唇石斛試管苗生長(zhǎng)所需的最適培養(yǎng)基。②種苗的擴(kuò)繁。兜唇石斛的培養(yǎng)過(guò)程中，依據(jù)兜唇石斛的生長(zhǎng)長(zhǎng)勢(shì)得到兜唇石斛最適培養(yǎng)基配方，作為種苗擴(kuò)繁培養(yǎng)基。為保證種苗耐鹽培養(yǎng)所需要的種苗數(shù)，共培養(yǎng)65瓶，每瓶接種3個(gè)種苗。

1.2.2 兜唇石斛的耐鹽培養(yǎng) ①兜唇石斛種苗的耐鹽培養(yǎng)。在兜唇石斛最適培養(yǎng)基MS+20 g/L蔗糖+6.5 g/L瓊脂+2 mol/L 6-BA+0.6 mol/L NAA的基礎(chǔ)上加入12個(gè)濃度梯度的NaCl，分別為0.0%、0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%、0.6%、0.7%、0.8%、0.9%、1.0%、1.1%，配制成耐鹽培養(yǎng)基。將擴(kuò)繁的無(wú)菌兜唇石斛種苗接種到耐鹽培養(yǎng)基中，每個(gè)濃度重復(fù)5次。②兜唇石斛種苗的耐鹽性測(cè)定。首先，制作脯氨酸標(biāo)準(zhǔn)曲線。按照脯氨酸含量的測(cè)定方法[6，7]，以脯氨酸濃度為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。其線性回歸方程為：y=0.023 6x+0.001 3（R2=0.988 2）。其次，樣品測(cè)定。稱取葉片0.5 g放到具塞試管中（3次重復(fù)），加入5 mL 3%的5-磺基水楊酸溶液，沸水浴10 min，冷卻后吸取上清液。具塞試管中加入2 mL上清液，加入2 mL冰醋酸和2 mL酸性茚三酮，進(jìn)行沸水浴30 min。冷卻后向具塞試管中加入4 mL的甲苯充分振蕩，以萃取紅色物質(zhì)。靜置分層后吸取甲苯層，以甲苯溶液為對(duì)照，在分光光度計(jì)520 nm波長(zhǎng)下比色，測(cè)得各個(gè)鹽濃度下試管苗中脯氨酸的吸光度。

2 結(jié)果與分析

2.1 兜唇石斛的培養(yǎng)

經(jīng)過(guò)2個(gè)月的觀察，不同生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑配比兜唇石斛的生長(zhǎng)狀況如表2，不同配比的生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑培養(yǎng)的兜唇石斛真菌污染率為6.25%。從表2中可以看出，H到M號(hào)生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑配比條件下種苗的長(zhǎng)勢(shì)較好，其中最好的為L(zhǎng)號(hào)，故兜唇石斛的最適培養(yǎng)基為MS+20 g/L蔗糖+6.5 g/L瓊脂+2 mol/L 6-BA+0.6 mol/L NAA。

2.2 兜唇石斛的耐鹽培養(yǎng)

1）耐鹽性分析。兜唇石斛的耐鹽性是通過(guò)測(cè)定種苗葉片中的脯氨酸含量來(lái)確定的，在逆境條件下，植物體內(nèi)脯氨酸的含量顯著增加。脯氨酸是植物體內(nèi)的一種重要調(diào)節(jié)物質(zhì)[8]，植物通過(guò)不斷積累脯氨酸來(lái)適應(yīng)不同的鹽堿環(huán)境。因此不同濃度的NaCl脅迫下，兜唇石斛苗體內(nèi)的脯氨酸含量也會(huì)有變化。

2）不同NaCl含量對(duì)兜唇石斛脯氨酸含量的影響。用分光光度計(jì)測(cè)量值也會(huì)存在誤差，所以在測(cè)量種苗中脯氨酸含量之前，先做脯氨酸的標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到脯氨酸濃度（x）與吸光度（y）的回歸方程：y=0.023 6x+0.001 3（R2=0.988 2）。之后用分光光度計(jì)測(cè)定種苗脯氨酸提取液的吸光度，代入回歸方程就可以得出不同NaCl濃度下兜唇石斛種苗體內(nèi)所含的脯氨酸濃度（圖2）。

是實(shí)際測(cè)出的不同鹽濃度處理下兜唇石斛試管苗葉片脯氨酸含量的變化圖。由圖3看出，脯氨酸含量在第7個(gè)處理出現(xiàn)峰值并依次向兩邊降低，第7個(gè)處理的脯氨酸含量最高，說(shuō)明第7個(gè)處理的兜唇石斛種苗耐鹽性最高，即脯氨酸含量最高的培養(yǎng)基為MS+20 g/L蔗糖+6.5 g/L瓊脂+ 2 mol/L 6-BA+0.6 mol/L NAA+0.6%NaCl。

3 小結(jié)與討論

MS培養(yǎng)基設(shè)計(jì)于1962年，具有高含量的氮、鉀，高濃度的無(wú)機(jī)鹽，尤其是硝酸鹽的用量很大，同時(shí)含有一定數(shù)量的銨鹽。營(yíng)養(yǎng)豐富，是目前應(yīng)用最廣泛的培養(yǎng)基[9]。外源生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑對(duì)于兜唇石斛組織培養(yǎng)有著顯著的影響，6-BA是細(xì)胞分裂類生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑，對(duì)于細(xì)胞的分化及出芽有著必要的作用[10]。NAA是生長(zhǎng)素類生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑，對(duì)于植物體的生根有重要作用[11]。在MS培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上加入適宜濃度的6-BA和NAA，可使組培苗生長(zhǎng)得更快更好。由表3可看出，H到M號(hào)培養(yǎng)基的生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑配比條件下組培苗的長(zhǎng)勢(shì)較好，其中最好的為L(zhǎng)號(hào)，因此最適合兜唇石斛組培苗生長(zhǎng)的培養(yǎng)基為MS+20 g/L蔗糖+6.5 g/L瓊脂+2 mol/L 6-BA+0.6 mol/L NAA。在這個(gè)生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑配比的培養(yǎng)條件下組培苗的長(zhǎng)勢(shì)最好，葉色由剛開(kāi)始培養(yǎng)的淡綠變?yōu)樯罹G，植株健壯且無(wú)病害。

脯氨酸是一種小分子滲透物質(zhì)，是水溶性最大的氨基酸，許多植物在受到逆境脅迫時(shí)都能積累高水平的脯氨酸。有學(xué)者把植物在逆境脅迫條件下脯氨酸含量的變化作為抗脅迫性的重要指標(biāo)，如李國(guó)樹(shù)等[12]的研究表明，脯氨酸含量可以作為鐵皮石斛組織培養(yǎng)中的一個(gè)生理指標(biāo)。土壤鹽漬化是農(nóng)作物生產(chǎn)中最嚴(yán)重的非生物逆境之一，選育耐鹽作物，提高作物對(duì)鹽漬環(huán)境的適應(yīng)能力，是減輕土壤鹽漬化危害的重要途徑之一。因此，研究植物耐鹽性是植物耐鹽育種的基礎(chǔ)。植物的耐鹽性與植物體內(nèi)生成的脯氨酸有一定的關(guān)系，且迄今為止仍有爭(zhēng)議。有的學(xué)者認(rèn)為脯氨酸的積累與抗脅迫性之間缺少相關(guān)性，似乎只是脅迫的結(jié)果[13-14]；更多學(xué)者研究表明，脯氨酸積累與鹽脅迫呈顯著的正相關(guān)[15-18]。本試驗(yàn)在兜唇石斛的培養(yǎng)基中分別添加了不同濃度的NaCl，在鹽脅迫60 d的情況下，其脯氨酸含量的測(cè)定數(shù)據(jù)表明，當(dāng)NaCl濃度在0.0%～0.6%，測(cè)定脯氨酸含量呈上升趨勢(shì)，說(shuō)明脯氨酸積累與鹽脅迫呈正相關(guān)；當(dāng)NaCl濃度在0.6%～1.1%，測(cè)定脯氨酸含量呈下降趨勢(shì)，說(shuō)明脯氨酸積累與鹽脅迫呈負(fù)相關(guān)。兜唇石斛經(jīng)過(guò)耐鹽培養(yǎng)得到脯氨酸含量最高的培養(yǎng)基MS+20 g/L蔗糖+6.5 g/L瓊脂+2 mol/L 6-BA+0.6 mol/L NAA+0.6%NaCl。在這個(gè)NaCl濃度下兜唇石斛的種苗體內(nèi)脯氨酸含量達(dá)到最高值，說(shuō)明NaCl含量達(dá)到0.6%是植物產(chǎn)生具有抗逆性的脯氨酸的極限，培養(yǎng)基中NaCl含量若超過(guò)0.6%時(shí)，植物自身所產(chǎn)生的脯氨酸已經(jīng)不足以抗鹽脅迫，所以兜唇石斛耐鹽性的臨界濃度為0.6%。

參考文獻(xiàn)：

[1] 趙永靈，王世林，李曉玉.兜唇石解多糖的研究[J].云南植物研究，1994，16（4）：392-396.

[2] 云南植物研究所.云南植物志[M].北京：科學(xué)出版社，1977.

[3] MOHAMMAD M H，MADHU S，PROMILA P.In vitro propagation of Dendrobium aphyllum（Orchidaceae）-seed germination to flowering[J].Journal of Plant Biochemistry and Biotechnology，2013，22（2）：157-167.

[4] 張朝鳳，邵 莉，王 磊，等.兜唇石斛酚類化學(xué)成分研究[J].中國(guó)中藥雜志，2008，33（24）：2922-2925.

[5] 趙俊凌，馬 潔，李 戈，等.兜唇石斛多糖提取及脫蛋白工藝研究[J].時(shí)珍國(guó)醫(yī)國(guó)藥，2010，21（8）：1-6.

[6] 王學(xué)奎.植物生理生化試驗(yàn)原理和技術(shù)[M].北京：高等教育出版社，2008.

[7] 李合生.植物生理生化試驗(yàn)原理與技術(shù)[M].北京：高等教育出版社，1999.

[8] 惲 銳，鄭慧瑩.松嫩平原簡(jiǎn)化草甸朝鮮堿茅，獐毛耐鹽堿特性的比較研究[J].植物生物學(xué)報(bào)，1996，20（4）：322-329.

[9] 王家福.花卉組織培養(yǎng)與快繁技術(shù)[M].北京：中國(guó)林業(yè)出版社，2006.

[10] 周瑞金，楊 靜，孔曉萍.植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑對(duì)香石竹離體培養(yǎng)的影響[J].現(xiàn)代園藝，2013（12）：5-6.

[11] 李 軍，徐 虹，王曉敏.不同因素對(duì)香石竹初代培養(yǎng)的影響[J].安徽農(nóng)學(xué)通報(bào)，2008，14（19）：41-42.

[12] 李國(guó)樹(shù)，徐成東，李天星，等.鐵皮石斛組培苗耐鹽性研究[J].北方園藝，2011（1）：153-156.

[13] MOFTAH A E，MICHEL B E.The effect of sodiumchloride on solute potential and proline accumulation in soybean leaves[J].Plant Physiol，1987（83）：238-240.

[14] HANSON A D，NELSON C E，PEDERSEN A R，et al.Capacity for proline accumulation during water stress in barley and its implications for breeding for drought resistance[J].Crop Sci，1979（19）：489-493.

[15] DELAUNEY A J，VERMA D P S.Proline biosynthesis and osmoregulation in plants[J].Plant J，1993（4）：215-223.

[16] STEWART G R，LEE J A.The role of proline accumulation in halophytes[J].Planta，1974（120）：279-289.

[17] MCCUE K F，HANSON A D.Drought and salt tolerance：Towards understanding and application[J].Trends Biotech，1990（8）：358-362.

[18] 陳托兄，張金林，陸 妮，等.不同類型抗鹽植物整株水平游離脯氨酸的分配[J].草業(yè)學(xué)報(bào)，2006，36（1）：36-41.