蒙古黃芪愈傷組織誘導(dǎo)及植株再生

摘要：以蒙古黃芪[Astragalus membranaceus（Fisch.）Bge.var.mongholicus（Bge.）Hsiao]種子萌發(fā)后的上胚軸、下胚軸和子葉為材料，采用MS培養(yǎng)基附加不同濃度植物生長調(diào)節(jié)劑進(jìn)行愈傷組織的誘導(dǎo)，并誘導(dǎo)不定芽的發(fā)生，生根后得到完整的再生植株。在該過程中，采用正交試驗分析6-BA、NAA、2，4-D、固化劑等條件對蒙古黃芪愈傷組織誘導(dǎo)和不定芽分化的影響。結(jié)果表明，下胚軸為誘導(dǎo)愈傷組織的最佳外植體取材部位，最佳愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基為MS+1.0 mg/L 6-BA+0.2 mg/L 2，4-D，最佳的不定芽分化培養(yǎng)基為MS+1.0 mg/L 6-BA+0.1 mg/L NAA，而固化劑采用0.1% Gelrite為最佳。

關(guān)鍵詞：蒙古黃芪[Astragalus membranaceus（Fisch.）Bge.var.mongholicus（Bge.）Hsiao]；愈傷組織；植株再生；正交試驗

中圖分類號：S567.23 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A 文章編號：0439-8114（2016）19-5091-04

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2016.19.050

Abstract： With the epicotyls， hypocotyls and cotyledons from seed germination of Astragalus membranaceus（Fisch.）Bge. var. mongholicus （Bge.） Hsiao as explants， MS medium plus different concentrations of plant growth regulators was used to callus inducement and adventitious buds generation for plant regeneration. In this process， orthogonal experiment were used to analysis the impact of 6-BA，NAA，2，4-D and curing agent to callus inducement and adventitious buds differenciation of Astragalus membranaceus. The results showed that hypocotyl was the best site for explant callus inducement. The optimal medium for callus inducement was MS+1.0 mg/L 6-BA+0.2 mg/L 2，4-D and for adventitious buds differenciation was MS+1.0 mg/L 6-BA+0.1 mg/L NAA. The optimal curing agent was 0.1% Gelrite.

Key words： Astragalus membranaceus（Fisch.）Bge.var.mongholicus （Bge.）Hsiao；callus；plant regeneration；orthogonal experiment

蒙古黃芪[Astragalus membranaceus （Fisch.） Bge.var. mongholicus（Bge.）Hsiao]是豆科（Fabaceae）黃芪屬（Astragalus）植物，是中國重要的傳統(tǒng)中藥材，其藥用歷史悠久，被譽(yù)為“補(bǔ)藥之長”，產(chǎn)于黑龍江、內(nèi)蒙古、河北及山西等地區(qū)，生于向陽草坡或山坡上。近年來，國內(nèi)外學(xué)者對黃芪的藥用成分、藥理作用等進(jìn)行了廣泛的研究?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究表明，黃芪中的有效藥用成分主要為多糖、皂苷、黃酮、蛋白質(zhì)、生物堿等物質(zhì)[1，2]，具有抗炎、鎮(zhèn)痛、抗血栓形成、抗衰老、抗病毒、抗風(fēng)濕、免疫調(diào)節(jié)等多種藥理作用[3，4]。隨著對黃芪藥理作用研究的不斷深入及其藥用范圍的不斷拓寬，對其需求量也越來越大。傳統(tǒng)上，商品黃芪以野生為主，但由于長期過度采挖，致使野生黃芪資源幾近枯竭。同時，在黃芪的人工栽培中，存在種質(zhì)退化、混雜等現(xiàn)象，以及黃芪根腐病、白粉病等病害、蟲害、鼠害等[5]，使黃芪產(chǎn)量和質(zhì)量均有所下降，嚴(yán)重影響該中藥材的持續(xù)發(fā)展。因此，如何擴(kuò)大黃芪的產(chǎn)量和質(zhì)量滿足國內(nèi)外對其的需求是目前亟待解決的問題。本試驗利用組織培養(yǎng)方法，誘導(dǎo)蒙古黃芪的愈傷組織，并進(jìn)行不定芽的增殖，以達(dá)到快速繁殖的目的，為蒙古黃芪的種質(zhì)利用和品種改良提供基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

供試材料為蒙古黃芪種子，購自甘肅隴西。選取顆粒飽滿的種子，在無菌條件下用75%乙醇消毒30 s，消毒過程中用手輕輕搓洗，隨即放入2%次氯酸鈉溶液處理20 min，無菌水漂洗4次，接種于MS基本培養(yǎng)基上萌發(fā)。萌發(fā)后，取子葉、下胚軸和莖段作為外植體進(jìn)行接種。

1.2 儀器

高壓蒸汽滅菌鍋、超凈工作臺、光照恒溫培養(yǎng)箱等。

1.3 培養(yǎng)基配方

愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基采用MS基本培養(yǎng)基，附加不同濃度的6-BA和2，4-D，另加3%蔗糖、0.7%瓊脂粉或0.1% Gelrite，pH 5.8。

不定芽分化培養(yǎng)基采用MS基本培養(yǎng)基，附加不同濃度的6-BA和NAA，其他同上。

生根培養(yǎng)基采用1/2MS培養(yǎng)基，附加0.1 mg/L NAA、3%蔗糖、0.7%瓊脂粉，pH 5.8。

1.4 培養(yǎng)條件

培養(yǎng)過程在光照培養(yǎng)箱中進(jìn)行，培養(yǎng)溫度為25 ℃。愈傷組織誘導(dǎo)時，為24 h黑暗培養(yǎng)；不定芽分化和生根過程，光照周期為16 h光照，8 h黑暗培養(yǎng)。

1.5 煉苗移栽

將根系發(fā)達(dá)、生長良好的組培苗瓶轉(zhuǎn)移至自然溫度與光照下，2 d后將瓶蓋半開，3 d后，將組培苗取出，用清水洗凈根系上的殘余培養(yǎng)基，移栽入砂子∶腐殖土（1∶1）（體積比）的混合基質(zhì)中，噴水保濕，遮光。注意煉苗期間防止陽光直射和基質(zhì)過濕。

1.6 正交試驗

確定影響蒙古黃芪愈傷組織誘導(dǎo)和不定芽分化的因素各有4個，各因素設(shè)定3個水平（表2、表3），進(jìn)行L9（34）正交試驗。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同培養(yǎng)基配比對蒙古黃芪愈傷組織誘導(dǎo)的影響

蒙古黃芪種子萌發(fā)后得到無菌苗，取其子葉、下胚軸和莖段作為外植體按照表1進(jìn)行正交試驗，接種在不同濃度配比的愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，每個試驗號接種30塊外植體，培養(yǎng)4～5 d即可見外植體組織膨大，20 d開始有愈傷組織形成，50 d左右有大量愈傷組織形成，此時應(yīng)及時更換新鮮培養(yǎng)基進(jìn)行繼代，否則組織極易褐化死亡。將50 d時愈傷組織的誘導(dǎo)情況進(jìn)行統(tǒng)計分析，結(jié)果如表3所示。

2.1.1 外植體取材部位對蒙古黃芪愈傷組織誘導(dǎo)的影響 經(jīng)過正交試驗分析可知，外植體取材部位對蒙古黃芪愈傷組織誘導(dǎo)率影響的極差為73.333，為4個影響因素中最大的，因此，外植體取材部位對蒙古黃芪愈傷組織的誘導(dǎo)起主導(dǎo)作用。比較k值，誘導(dǎo)率的作用效果從大到小為k2>k3>k1，且數(shù)值上相差較大，其中，當(dāng)采用下胚軸為外植體時，效果最好，可誘導(dǎo)出大量乳白色、細(xì)碎的愈傷組織（圖1b），當(dāng)采用莖段為外植體時，誘導(dǎo)量也較大，愈傷組織的狀態(tài)較好（圖1c），而當(dāng)采用子葉為外植體時，則誘導(dǎo)量減少（圖1a）。

2.1.2 植物生長調(diào)節(jié)劑對蒙古黃芪愈傷組織誘導(dǎo)的影響 在添加的兩種植物生長調(diào)節(jié)劑中，發(fā)現(xiàn)2，4-D對蒙古黃芪愈傷組織誘導(dǎo)的影響比6-BA更大，其極差為10.034，而6-BA為6.667。比較k值，2，4-D的作用效果從大到小為k2>k1>k3，而k2和k1相差不大，說明愈傷組織誘導(dǎo)需要2，4-D，但濃度不能過高，過高反而會抑制愈傷組織的形成，而且在愈傷形態(tài)的觀察中發(fā)現(xiàn)，2，4-D的濃度過高，會導(dǎo)致形成硬塊，愈傷組織易褐化。而6-BA的k值相差不大，添加濃度過高，同樣會導(dǎo)致愈傷組織易褐化。因此，2種植物生長調(diào)節(jié)劑添加量應(yīng)適當(dāng)，根據(jù)試驗結(jié)果，推薦使用1.0 mg/L 6-BA和0.2 mg/L 2，4-D。

2.1.3 培養(yǎng)基固化劑對蒙古黃芪愈傷組織誘導(dǎo)的影響 不同的培養(yǎng)基固化劑對蒙古黃芪愈傷組織的誘導(dǎo)有一定的影響，其影響極差為7.767，誘導(dǎo)率的作用效果從大到小為k2>k3>k1，發(fā)現(xiàn)添加Gelrite比添加瓊脂粉對愈傷組織誘導(dǎo)更有益，不僅誘導(dǎo)率平均值在60%以上，而且誘導(dǎo)出的愈傷組織狀態(tài)更好，不易褐化。同時發(fā)現(xiàn)，添加Gelrite作為培養(yǎng)基的固化劑，配制的培養(yǎng)基清澈透亮，且其用量只需0.1%即可使得培養(yǎng)基凝固。

2.2 不同培養(yǎng)基配比對蒙古黃芪不定芽分化的影響

在愈傷組織誘導(dǎo)50 d左右，取細(xì)碎的、色澤乳白或黃綠色的愈傷組織，接種在不定芽分化培養(yǎng)基上，每塊大小在5 mm×5 mm×5 mm左右，30 d后統(tǒng)計試驗結(jié)果，如表4所示。

2.2.1 植物生長調(diào)節(jié)劑對蒙古黃芪不定芽分化的影響 在對蒙古黃芪愈傷組織不定芽分化的誘導(dǎo)中，添加了6-BA和NAA 2種生長調(diào)節(jié)劑，發(fā)現(xiàn)這兩種生長調(diào)節(jié)劑均有一定的影響，其極差分別為19.443和22.223，在k值的比較分析中，發(fā)現(xiàn)低濃度的6-BA更適合，當(dāng)濃度增加，則導(dǎo)致不定芽的分化受到抑制，即使有也很矮小，而且易產(chǎn)生結(jié)節(jié)狀硬塊，而NAA的添加能促進(jìn)不定芽的分化，添加0.1%NAA時，效果最好，當(dāng)配比為1.0 mg/L 6-BA和0.1 mg/L NAA時，不定芽的分化效果最佳，長勢良好，芽粗壯，色澤嫩綠（圖2）。

2.2.2 外植體取材部位對蒙古黃芪不定芽分化的影響 從表4中可以看出，外植體取材部位對蒙古黃芪不定芽分化的影響最大，其極差為27.777，其中下胚軸不定芽分化率最高，而子葉沒有不定芽的分化。在誘導(dǎo)出的不定芽中，下胚軸誘導(dǎo)的芽長勢最好，莖稈粗壯、色澤嫩綠，莖段愈傷組織也有少量的不定芽分化形成，但長勢較弱，芽苗矮小，色澤黃綠色。

2.2.3 培養(yǎng)基固化劑對蒙古黃芪不定芽分化的影響 培養(yǎng)基的固化劑對不定芽的分化影響不大，其極差為16.663，隨著濃度的增加，不定芽的誘導(dǎo)率和不定芽平均數(shù)都有少許降低，可能是由于濃度增加后，培養(yǎng)基硬度增加，影響營養(yǎng)物質(zhì)的吸收。在分化出的不定芽的形態(tài)上看，添加Gelrite的培養(yǎng)中，芽的長勢比添加瓊脂粉的培養(yǎng)基更好，芽色嫩綠，不易褐化。

2.3 蒙古黃芪不定芽的煉苗移栽

在培養(yǎng)30 d后，選取嫩綠、粗壯的不定芽，轉(zhuǎn)接入生根培養(yǎng)基中誘導(dǎo)生根，7 d左右發(fā)現(xiàn)有根生成，20 d左右，根生長良好，并有毛狀根生成。此時，可將根系發(fā)達(dá)、生長良好的組培苗進(jìn)行煉苗移栽，成活率可達(dá)70%左右。

3 小結(jié)與討論

正交試驗結(jié)果顯示，外植體的部位對蒙古黃芪的愈傷組織誘導(dǎo)及不定芽分化的影響最為顯著，下胚軸為最佳誘導(dǎo)部位，在合適條件下可100%誘導(dǎo)出愈傷組織，這一結(jié)果與趙慶芳等[6]的研究結(jié)果一致，而不定芽的分化也顯示這一部位最佳，分化率可達(dá)50%以上，有的愈傷組織塊可誘導(dǎo)出4個以上不定芽，因此，利用蒙古黃芪的下胚軸作為外植體是蒙古黃芪愈傷組織誘導(dǎo)及不定芽再生的最佳選擇。

此外，在愈傷組織誘導(dǎo)中，2，4-D起到很大作用，可誘導(dǎo)出細(xì)碎的、狀態(tài)良好的愈傷組織，然而其濃度不能過高，在高濃度下，易產(chǎn)生結(jié)節(jié)狀硬塊，在后續(xù)的不定芽分化時無法正常分化成芽，而且在高濃度時，外植體容易褐化死亡。因此，選擇合適的較低濃度的2，4-D來誘導(dǎo)蒙古黃芪愈傷組織是試驗成功的關(guān)鍵。而6-BA濃度也不易過高，過高則外植體同樣極易褐化。2種生長調(diào)節(jié)劑配比的研究結(jié)果，選取0.2 mg/L 2，4-D和1.0 mg/L 6-BA的濃度配比為最佳。

固化劑對愈傷組織的誘導(dǎo)率影響不大，但是對愈傷組織的狀態(tài)影響較大，在添加瓊脂粉時，愈傷組織的狀態(tài)一般，極易褐化，可能是由于瓊脂粉中有一定的雜質(zhì)，影響營養(yǎng)物質(zhì)的吸收和有毒產(chǎn)物的擴(kuò)散。換成Gelrite后，培養(yǎng)基清亮、純凈，營養(yǎng)物質(zhì)和有毒產(chǎn)物都擴(kuò)散迅速，外植體不易褐化，對愈傷組織的狀態(tài)調(diào)整更佳，且只需要低濃度的Gelrite，培養(yǎng)基即可較好地凝固。對不定芽的分化也同樣適用，得到的不定芽長勢良好、色澤嫩綠、粗壯，煉苗后成活率高。

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