藥用植物扁桃斑鳩菊的離體快速繁殖技術(shù)研究

摘要：以扁桃斑鳩菊（Vernonia amygdalina Del.）莖段為外植體對(duì)其進(jìn)行離體培養(yǎng)與快速繁殖技術(shù)研究。結(jié)果表明，外植體表面消毒以75%乙醇預(yù)處理10 s，再用0.1%氯化汞浸泡8 min效果最好；繼代培養(yǎng)的最適宜培養(yǎng)基為MS+0.2 mg/L 6-BA+0.05 mg/L IBA，增殖系數(shù)可達(dá)4.0；最適宜的生根培養(yǎng)基為1/2MS+0.10 mg/L IBA，生根率可達(dá)100%；光照度為1 500～2 500 lx時(shí)，組培苗生長(zhǎng)健壯；將生根后的植株進(jìn)行移栽，在輕基質(zhì)中或黃心土中成活率均可達(dá)90%以上。

關(guān)鍵詞：扁桃斑鳩菊（Vernonia amygdalina Del.）；組織培養(yǎng)；快速繁殖；光照度

中圖分類號(hào)：Q949.783.5；R282.2 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：0439-8114（2016）19-5087-04

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2016.19.049

Abstract：The techniques of tissue culture and rapid propagation of Vernonia amygdalina Del. were studied by using the stem as explants. The results showed that the most suitable procedure for sterilization was to disinfect with 75% alcohol for 10 seconds，and then soaked explants into 0.1% HgCl2 solution for 8 minutes. The best media for propagation was MS+0.2 mg/L 6-BA+0.05 mg/L IBA and the coefficient of propagation achieved 4.0. The best rooting media was 1/2MS+0.1 mg/L IBA，and the rooting rate achieved 100%.The tissue culture seedlings grew well when the illuminance was set between 1 500 to 2 500 lx. The rooted plantlets were transplanted into the substrate or yellow soil and the survival rate were both over 90%.

Key words： Vernonia amygdalina Del.； tissue culture； rapid propagation； illuminance

扁桃斑鳩菊（Vernonia amygdalina Del.）又名桃葉斑鳩菊、神奇葉、苦樹(shù)、南非樹(shù)等，為菊科斑鳩菊屬植物，原產(chǎn)于非洲。扁桃斑鳩菊多為喬木或小灌木，喜光，宜在潮濕環(huán)境中生長(zhǎng)，也耐干旱，適應(yīng)所有土壤類型。扁桃斑鳩菊葉子可以安全食用，在尼日利亞等地被當(dāng)作一種蔬菜。其葉片具有獨(dú)特的氣味和苦澀感，因而常被稱為苦葉[1]，可作為殺菌劑或啤酒花的替代品[2]。目前已從中分離5類共32種化合物，其主要活性成分有皂苷、生物堿、萜類、類固醇、香豆素類、黃酮類、酚酸類、木酚素、蒽醌類和倍半萜等，在治療腫瘤尤其是防治乳腺癌、降血壓方面極具潛力[1]。扁桃斑鳩菊在東南亞及中國(guó)臺(tái)灣等地民間應(yīng)用較多，而中國(guó)大陸則相對(duì)比較少，近年來(lái)兩廣地區(qū)陸續(xù)有引進(jìn)，在藥用成分提取、保健品開(kāi)發(fā)和食療方面具有極大的開(kāi)發(fā)潛力。采用組織培養(yǎng)技術(shù)建立其無(wú)性快繁技術(shù)體系，相對(duì)常規(guī)扦插技術(shù)，可以實(shí)現(xiàn)周年生產(chǎn)、有利于種質(zhì)資源保存和推進(jìn)其產(chǎn)業(yè)化發(fā)展，也為更深層次的研究提供了技術(shù)平臺(tái)。因此，本試驗(yàn)對(duì)扁桃斑鳩菊的組織培養(yǎng)快速繁殖技術(shù)進(jìn)行研究，以期為扁桃斑鳩菊的產(chǎn)業(yè)化發(fā)展提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

材料來(lái)源為廣西壯族自治區(qū)欽州市林業(yè)科學(xué)研究所實(shí)驗(yàn)苗圃栽培的扁桃斑鳩菊。選取生長(zhǎng)健壯、無(wú)病蟲(chóng)害的優(yōu)良植株，剪取木質(zhì)化程度較輕的當(dāng)年生嫩枝為外植體。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 外植體消毒 將采回的莖段截成長(zhǎng)1.2～1.5 cm的帶節(jié)小段，剪去葉片，只保留葉柄基部（長(zhǎng)約0.5 cm），流水沖洗20 min備用。在超凈工作臺(tái)上，用75%乙醇浸泡10 s，0.1%氯化汞振蕩消毒5～12 min，再用無(wú)菌水沖洗5次洗去殘留藥液，用無(wú)菌濾紙吸干水分后，切去莖段兩端和葉柄上部少許（長(zhǎng)約0.2 cm），接種于誘導(dǎo)培養(yǎng)基上。氯化汞消毒時(shí)間設(shè)定為5、8、10和12 min，每種處理20個(gè)外植體，篩選出最佳滅菌時(shí)間。

1.2.2 培養(yǎng)基配方設(shè)計(jì) 誘導(dǎo)培養(yǎng)基為MS+0.5 mg/L 6-BA+0.05 mg/L NAA。繼代培養(yǎng)時(shí)，以MS為基本培養(yǎng)基，添加6-BA（0.1～0.5 mg/L）、NAA（0.01～0.05 mg/L）或IBA（0～0.05 mg/L）等不同植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑濃度組合，進(jìn)行培養(yǎng)。生根培養(yǎng)時(shí)，以1/2MS為基本培養(yǎng)基，添加不同濃度的NAA（0.05～0.15 mg/L）或IBA（0.05～0.15 mg/L），進(jìn)行培養(yǎng)。

1.2.3 培養(yǎng)條件 除特別說(shuō)明外，上述培養(yǎng)基均添加3.0%蔗糖和0.6%瓊脂粉，pH 5.8～6.0。培養(yǎng)室培養(yǎng)溫度為（23±2） ℃，繼代培養(yǎng)光照時(shí)間12 h/d，光照度1 500～2 500 lx；生根培養(yǎng)光照時(shí)間16 h/d，光照度1 500～2 500 lx。

1.2.4 培養(yǎng)過(guò)程 將消毒完成后的外植體接種于誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，定期觀察記錄消毒結(jié)果，記錄內(nèi)容包括消毒外植體數(shù)、消毒時(shí)間過(guò)長(zhǎng)造成的外植體死亡數(shù)、外植體霉菌細(xì)菌污染數(shù)、外植體成活數(shù)和側(cè)芽的生長(zhǎng)情況。3周后將記錄結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，取各組的平均值作為試驗(yàn)結(jié)果。誘導(dǎo)率=（出芽外植體數(shù)/接種數(shù)）×100%。

繼代和生根均用手術(shù)刀和鑷子進(jìn)行操作。待無(wú)菌芽生長(zhǎng)至2～3 cm時(shí)，轉(zhuǎn)入繼代培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)周期為21 d。在同一培養(yǎng)基中連續(xù)培養(yǎng)2個(gè)周期，待增殖苗生長(zhǎng)穩(wěn)定后，觀察芽的生長(zhǎng)情況。每種處理為150個(gè)接種芽，隨機(jī)抽取30個(gè)接種芽，統(tǒng)計(jì)增殖系數(shù)，篩選最適宜的增殖培養(yǎng)基。增殖率=（增殖株數(shù)/接種數(shù)）×100%，芽增殖系數(shù)=增殖芽數(shù)/出芽株數(shù)。

取帶有2～3個(gè)節(jié)的試管苗頂端轉(zhuǎn)入生根培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，截取長(zhǎng)度約3 cm，每種處理為150株。生根培養(yǎng)2周后，隨機(jī)抽取30株組培苗，統(tǒng)計(jì)植株高度、葉色、生根率、平均生根數(shù)等生長(zhǎng)指標(biāo)，篩選最佳的生根培養(yǎng)基。生根率=（生根株數(shù)/接種數(shù)）×100%；平均生根數(shù)=生根數(shù)量/接種株數(shù)。

1.2.5 不同光照度對(duì)組培苗長(zhǎng)勢(shì)的影響試驗(yàn) 選60瓶增殖苗，分為3組，每組20瓶，分別置于不同光照度下連續(xù)培養(yǎng)2個(gè)生長(zhǎng)周期（每個(gè)生長(zhǎng)周期均為3周），觀察記錄不同光照度下扁桃斑鳩菊的生長(zhǎng)情況。光照度設(shè)置為500、500～15 00、1 500～2 500 lx。

1.2.6 不同栽培基質(zhì)對(duì)扁桃斑鳩菊移栽苗生長(zhǎng)的影響 將完成生根階段的試管苗，洗干凈基部的培養(yǎng)基，分別種植于輕基質(zhì)（泥炭∶珍珠巖=2∶1）和黃心土中。分別移栽500株，3周后統(tǒng)計(jì)移栽成活率。

2 結(jié)果與分析

2.1 無(wú)菌材料的獲得

從表1可以看出，隨著在0.1%氯化汞溶液中消毒時(shí)間的增加，外植體死亡數(shù)量也隨之增加，而污染數(shù)量隨之減少，外植體成活率呈現(xiàn)先升高再降低的態(tài)勢(shì)。消毒死亡的外植體外觀呈現(xiàn)出黑褐色，很難再抽出新芽；少量外植體呈現(xiàn)黑綠相間的顏色，一部分仍可抽出新芽；消毒時(shí)間為5 min時(shí)，雖然外植體仍為綠色，且多有側(cè)芽抽出，但污染率高達(dá)75%。綜合考慮外植體死亡率、污染率和成活率等各方面因素，氯化汞消毒處理8 min最為適宜。

在誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，會(huì)在外植體的莖桿表面或莖桿基部出現(xiàn)愈傷組織，但大多呈現(xiàn)水漬狀且質(zhì)地疏松，很難誘導(dǎo)出芽，而側(cè)芽則易于誘導(dǎo)且生長(zhǎng)迅速（圖1-A）。初代培養(yǎng)3周時(shí)，側(cè)芽可高達(dá)3～4 cm，具3張以上葉片（圖1-B），轉(zhuǎn)入增殖培養(yǎng)基進(jìn)行繼代培養(yǎng)。

2.2 扁桃斑鳩菊的繼代培養(yǎng)

扁桃斑鳩菊生長(zhǎng)迅速，培養(yǎng)3周即可進(jìn)行下一次繼代，超過(guò)4周易出現(xiàn)黃葉和小芽死亡的情況，影響增殖效率。扁桃斑鳩菊對(duì)植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑的種類和濃度比較敏感，如表2所示，當(dāng)6-BA濃度達(dá)到0.3 mg/L時(shí)容易出現(xiàn)玻璃化現(xiàn)象，當(dāng)濃度達(dá)到0.5 mg/L時(shí)，玻璃化現(xiàn)象尤為嚴(yán)重，且基部水浸狀愈傷組織較多；6-BA濃度為0.1 mg/L時(shí)，植株生長(zhǎng)細(xì)弱，節(jié)間長(zhǎng)，基部分枝少，影響切割效率和種苗質(zhì)量；當(dāng)6-BA濃度為0.2 mg/L時(shí)，植株生長(zhǎng)健壯（圖1-C），且6-BA和IBA配合使用時(shí)，試管苗的生長(zhǎng)狀況最佳。因此選用MS+0.2 mg/L 6-BA+0.05 mg/L IBA為扁桃斑鳩菊繼代的最適宜培養(yǎng)基。

2.3 扁桃斑鳩菊的生根誘導(dǎo)

扁桃斑鳩菊生根培養(yǎng)2周時(shí)，觀察統(tǒng)計(jì)各組培養(yǎng)基的試驗(yàn)效果。統(tǒng)計(jì)生根數(shù)量時(shí)，長(zhǎng)度達(dá)到0.5 cm及以上的肉質(zhì)根方可計(jì)入生根數(shù)。由表3可知，以1/2MS為基本培養(yǎng)基附加濃度0.05～0.15 mg/L的NAA或IBA均可取得較高的生根率，且平均生根數(shù)都在5條以上，說(shuō)明扁桃斑鳩菊的生根誘導(dǎo)較為容易。但采用NAA誘導(dǎo)時(shí)，雖然已經(jīng)降低了基本培養(yǎng)基中無(wú)機(jī)鹽的用量，但仍會(huì)出現(xiàn)不同程度的愈傷組織和玻璃化現(xiàn)象，不利于試管苗的移栽。采用IBA誘導(dǎo)生根時(shí)，以1/2MS+0.10 mg/L IBA誘導(dǎo)生根的效果最好，根系最為發(fā)達(dá)，小苗的長(zhǎng)勢(shì)最好，最適合后期移栽（圖1-D、1-E）。

2.4 不同光照度對(duì)扁桃斑鳩菊增殖苗生長(zhǎng)的影響

對(duì)組培苗增殖階段進(jìn)行報(bào)紙覆蓋、調(diào)整日光燈數(shù)量等措施設(shè)置不同光照度，每天光照時(shí)間12 h，培養(yǎng)3周后，進(jìn)行觀察統(tǒng)計(jì)。從表4可以看出，在散射光條件下（約500 lx），增殖苗較細(xì)弱，節(jié)間較長(zhǎng)，葉片嫩綠色，有玻璃化現(xiàn)象，基部有水漬狀愈傷組織，長(zhǎng)勢(shì)較差；光照度為500～1 500 lx時(shí)，增殖苗長(zhǎng)勢(shì)一般，少量葉片有玻璃化現(xiàn)象；光照度為1 500～2 500 lx時(shí)，增殖苗生長(zhǎng)正常，植株健壯，無(wú)玻璃化現(xiàn)象和愈傷組織產(chǎn)生。

2.5 不同栽培基質(zhì)對(duì)扁桃斑鳩菊移栽苗生長(zhǎng)的影響

生根培養(yǎng)2周，生根苗高度可達(dá)4～6 cm，平均根長(zhǎng)2～3 cm，即可進(jìn)行移栽（圖1-F）。移栽應(yīng)在遮陰度75%的溫室或者簡(jiǎn)易陰棚內(nèi)進(jìn)行，移栽初期保持較高的空氣濕度。3周后，分別統(tǒng)計(jì)種植在輕基質(zhì)（泥炭∶珍珠巖=2∶1）和黃心土中的小苗成活率，結(jié)果見(jiàn)表5。由表5可知，扁桃斑鳩菊的移栽苗在黃心土和輕基質(zhì)中成活率均可達(dá)到90%以上，輕基質(zhì)中成活率稍高，達(dá)96.6%。

3 小結(jié)與討論

目前已知的斑鳩菊屬植物約1 000種，主要生長(zhǎng)于熱帶地區(qū)，中國(guó)已發(fā)現(xiàn)約30種，主要分布于西南、東南和新疆等地。目前該屬植物的研究重點(diǎn)主要集中在抗腫瘤活性、對(duì)免疫系統(tǒng)影響、皮膚病治療和抗感染等藥理學(xué)方面，尤以新疆阿克蘇地區(qū)的中藥材——驅(qū)蟲(chóng)斑鳩菊的研究為多。關(guān)于該屬植物生物學(xué)特性、親緣關(guān)系、繁殖方法等方面的研究較少，如何加強(qiáng)相關(guān)基礎(chǔ)研究、構(gòu)建現(xiàn)代生物技術(shù)研究平臺(tái)，對(duì)加速推進(jìn)該屬植物的產(chǎn)業(yè)開(kāi)發(fā)尤為重要。

扁桃斑鳩菊生長(zhǎng)迅速，繼代苗的培養(yǎng)周期僅為3周，但容易出現(xiàn)玻璃化現(xiàn)象。繼代初期，參照胡石開(kāi)等[3]驅(qū)蟲(chóng)斑鳩菊的組培技術(shù)，試驗(yàn)了培養(yǎng)基MS+1.0 mg/L 6-BA+0.5 mg/L NAA，結(jié)果其試管苗玻璃化嚴(yán)重，且大多不可逆轉(zhuǎn)。后進(jìn)一步試驗(yàn)顯示，當(dāng)增殖培養(yǎng)基中6-BA的濃度超過(guò)0.3 mg/L時(shí)試管苗的玻璃化就較為普遍，表現(xiàn)為試管苗生長(zhǎng)異常，葉片和嫩梢呈透明或半透明的水浸狀，葉片皺縮、僵硬、易碎，且有水浸狀愈傷組織形成。本試驗(yàn)結(jié)果顯示在培養(yǎng)基MS+0.2 mg/L 6-BA+0.05 mg/L IBA 中，扁桃斑鳩菊增殖系數(shù)達(dá)到4.0，且小苗生長(zhǎng)健壯。

玻璃化現(xiàn)象是組織培養(yǎng)過(guò)程中常見(jiàn)的現(xiàn)象之一，與菌類污染、褐變并稱為三大難題[4]。一般認(rèn)為影響玻璃苗發(fā)生的因素主要有培養(yǎng)材料、培養(yǎng)環(huán)境、培養(yǎng)基成分、碳源和植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑等[5]。本試驗(yàn)中，除了調(diào)控外源植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑外，還采取了多方面措施來(lái)解決試管苗的玻璃化問(wèn)題。培養(yǎng)材料的來(lái)源，采用腋芽誘導(dǎo)而非愈傷組織再分化成苗的途徑，保證了組培苗的品質(zhì)；繼代培養(yǎng)環(huán)節(jié)中，通過(guò)不同光照度試驗(yàn)，設(shè)定光照度為1 500～2 000 lx；生根培養(yǎng)環(huán)節(jié)，采用降低基本培養(yǎng)基中大量元素、延長(zhǎng)光照時(shí)間至16 h等方法，有效解決了試管苗的玻璃化問(wèn)題。

NAA和IBA是誘導(dǎo)組培苗生根的最常用植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑，但誘導(dǎo)生根的效果并不完全相同。吳明鋼等[6]在霍山石斛的莖段培養(yǎng)中發(fā)現(xiàn)，NAA與IBA配合使用時(shí)，當(dāng)IBA含量較高時(shí)有利于誘導(dǎo)出芽，反之有利于誘導(dǎo)生根，IBA似有細(xì)胞分裂素的作用。王喆之等[7]在研究槐樹(shù)試管苗生根時(shí)，就不同生長(zhǎng)素種類對(duì)誘導(dǎo)的不定根來(lái)源、形態(tài)方面進(jìn)行了專門研究。研究結(jié)果顯示，IBA、NAA對(duì)不定根發(fā)生、生長(zhǎng)都有促進(jìn)作用，但I(xiàn)BA誘導(dǎo)的不定根細(xì)而長(zhǎng)，生長(zhǎng)快，且不定根直接來(lái)源于莖，而NAA誘導(dǎo)的根短而粗，且不定根表面常重新愈傷化，不利于試管苗成活。在金葉薹草等植物的組培育苗過(guò)程中也曾發(fā)現(xiàn)類似的現(xiàn)象，IBA誘導(dǎo)出的根較細(xì)長(zhǎng)，而NAA誘導(dǎo)的根較為粗壯且更易產(chǎn)生愈傷組織[8]。扁桃斑鳩菊的試管苗生根較易誘導(dǎo)，不同濃度（0.05～0.15 mg/L）的NAA和IBA生根誘導(dǎo)率均可達(dá)90%以上。綜合扁桃斑鳩菊組培苗的生長(zhǎng)情況、生根率和生根系數(shù)等情況，篩選出1/2MS+0.10 mg/L IBA為其生根的最佳培養(yǎng)基配方。

扁桃斑鳩菊的移栽苗在黃心土和輕基質(zhì)中成活率均可達(dá)到90%以上，輕基質(zhì)中成活率稍高（96.6%），且生長(zhǎng)快，根系發(fā)達(dá)；黃心土中植株生長(zhǎng)稍慢，但小規(guī)模經(jīng)營(yíng)時(shí)，投資小、取材方便，具有一定優(yōu)勢(shì)。選擇輕基質(zhì)還是黃心土進(jìn)行移栽，需要結(jié)合市場(chǎng)需求、生產(chǎn)規(guī)模、運(yùn)輸距離等因素進(jìn)行成本核算和風(fēng)險(xiǎn)分析。

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