基于ITS2條形碼的人參屬物種鑒定研究

摘要：人參屬植物種類繁多，多數(shù)具有重要的生物學(xué)及藥用價(jià)值。采用植物DNA條形碼候選序列之一的ITS2片段鑒定人參屬藥用植物。結(jié)果表明，ITS2基因區(qū)通用性強(qiáng)，序列在人參屬物種間差異較大，屬內(nèi)變異位點(diǎn)為41個(gè)，保守位點(diǎn)189個(gè)，種內(nèi)遺傳距離為0～0.004，種間遺傳距離為0.006～0.098，平均遺傳距離為0.044?；贙2P模型構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹（NJ樹）顯示，同一物種均聚為一類。因此，ITS2作為DNA條形碼能夠有效地區(qū)別人參屬物種，為人參屬藥材及其偽混品的鑒定提供基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：人參屬；DNA條形碼；ITS2；鑒定

中圖分類號(hào)：Q789；R282.5 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：0439-8114（2016）19-5072-03

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2016.19.044

Abstract：Panax sp. species， most have the important value of biological and pharmaceutical. The identification ability of Panax sp. species used DNA barcode ITS2 was tested. The result showed that ITS2 had a good commonality， and some differences in panaxspecies，the sequence analysis results revealed that there were 41 mutation sites，189 conserved sites， theintraspecific genetic distance varied from 0 to 0.004，while the genetic distance among the species ranged from 0.006 to 0.098 with the average value of 0.044. The phylogenetic tree constructed by the neighbor-joining method shows that the same species gather together. Therefore， ITS2 can identify Panax sp. species effective，and it provides a possibility for Panax sp. medicinal materials and its adulterants.

Key words：Panax sp.； DNA barcode； ITS2； identification

人參屬（Panax sp.）植物種類多樣，全世界共有12個(gè)種，分布于亞洲東部、中部和北美洲，中國有7個(gè)種（包括1個(gè)外來種）、3個(gè)變種[1]。人參屬植物多數(shù)具有重要的藥用及生物學(xué)價(jià)值，一直受到人們的重視，中國2010版藥典記載入藥的人參屬植物有6個(gè)種，但其功效有一定差異，且價(jià)格相差較大。國家食品藥品監(jiān)督管理總局于2013年7月對(duì)中國5個(gè)大型中藥材市場(chǎng)的暗訪摸底調(diào)查顯示，商陸根、紫茉莉根、沙參等冒充人參，生曬參摻入西洋參等假冒偽劣、摻雜使假的現(xiàn)象屢見不鮮。對(duì)人參屬藥用植物進(jìn)行準(zhǔn)確鑒別是開展相關(guān)研究的基礎(chǔ)，對(duì)植物資源保護(hù)和藥用植物安全合理利用具有重要意義。

有關(guān)人參屬植物的檢驗(yàn)鑒定，傳統(tǒng)方法一般是基于形態(tài)性狀的基源鑒定、顯微鑒定和理化鑒定[2]，但由于這些性狀特征與環(huán)境緊密相關(guān)，時(shí)而發(fā)生變化，且制成中成藥后更難對(duì)其進(jìn)行鑒別。隨著分子生物學(xué)的發(fā)展及應(yīng)用，RAPD、AP-PCR、RFLP等技術(shù)已應(yīng)用于部分人參屬物種及其偽混品的研究[2]。雖然每一種分子鑒定技術(shù)都有其特定的優(yōu)勢(shì)及應(yīng)用范圍，同時(shí)多數(shù)研究都集中于人參、西洋參、三七等幾類藥材的鑒別，但在通量及通用性上尚有欠缺，沒有標(biāo)準(zhǔn)的國際化平臺(tái)，難于大范圍推廣。

DNA條形碼是一種通過短的標(biāo)準(zhǔn)的DNA序列作為標(biāo)記來實(shí)現(xiàn)物種快速準(zhǔn)確鑒定的方法，具有操作簡(jiǎn)便、可重復(fù)性強(qiáng)、結(jié)果穩(wěn)定可靠等優(yōu)點(diǎn)[3，4]，已成為近年來國際生物鑒定及多樣性研究的一個(gè)熱點(diǎn)。目前，對(duì)于植物來說，通用的DNA條形碼序列仍未最終確定，但作為DNA候選序列的ITS片段以其特有的優(yōu)勢(shì)被大家廣泛關(guān)注[5-7]，陳士林課題組在2010年比較了7條熱門條形碼序列，通過對(duì)6 000余個(gè)樣本的分析[8]，依據(jù)各條形碼評(píng)價(jià)指標(biāo)，篩選出ITS2 序列是藥用植物鑒定最優(yōu)的序列，且物種水平的鑒定成功率高達(dá)92.7%[9]。本試驗(yàn)利用ITS2序列對(duì)人參屬植物進(jìn)行DNA條形碼鑒別研究，以期為該藥材的準(zhǔn)確鑒定提供分子依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

材料來源信息見表1，包括試驗(yàn)樣品及來自GenBank登錄號(hào)，來源于GenBank的ITS2序列處理流程參照Yao等[10]的研究。

1.2 方法

1.2.1 DNA提取 對(duì)收集的人參、西洋參樣品，分別稱取100 mg，用磁珠法植物基因組DNA提取試劑盒（珠海寶瑞生物公司）提取總DNA。

1.2.2 PCR擴(kuò)增及測(cè)序 ITS2擴(kuò)增用正向引物為ITS2F（5′-ATGCGATACTTGGTGTGAAT-3′），反向引物為ITS3R（5′-GACGCTTCTCCAGACTACAAT-3′）。PCR反應(yīng)體系為25 μL，其中含MgCl2 2 μL（25 mmol/L）、dNTPs 2 μL（2.5 mmol/L）、PCR buffer 2.5 μL（10×）、引物各1 μL（10 μmol/L）、聚合酶1 U、總DNA 1 μL。PCR擴(kuò)增程序?yàn)?4 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，56 ℃ 30 s，72 ℃ 45 s，35個(gè)循環(huán)；72 ℃ 10 min[2]。將含有目的條帶的PCR產(chǎn)物送至華大基因公司進(jìn)行雙向測(cè)序。

1.3 數(shù)據(jù)分析

使用SeqMan軟件對(duì)序列進(jìn)行拼接及校正，利用NCBI中的BLAST軟件進(jìn)行相似性檢索，確定物種種類。對(duì)于從網(wǎng)上獲得的ITS序列，使用Hidden Markov model（HMM）序列注釋模型獲得ITS2序列間隔區(qū)[5，11]，將測(cè)序所得序列及GenBank下載序列用ClustalX1.83軟件進(jìn)行序列比對(duì)，用MEGA5.05計(jì)算K2P種間和種內(nèi)遺傳距離，構(gòu)建NJ系統(tǒng)進(jìn)化樹[12]。

2 結(jié)果與分析

2.1 序列測(cè)定和相似性比對(duì)結(jié)果

分析得到4條人參的ITS2基因序列，長(zhǎng)度為230 bp。與Genebank數(shù)據(jù)庫進(jìn)行Blast相似性比對(duì)，結(jié)果顯示，ZYP01至ZYP04號(hào)樣品的ITS2序列與登錄號(hào)為HQ112415.1和HF727973.1的人參基因序列最大相似度為100%。序列比對(duì)結(jié)果顯示，4批樣本均為人參，分子鑒定結(jié)果與形態(tài)鑒定結(jié)果一致。

2.2 ITS2序列長(zhǎng)度、GC含量及序列差異

分析結(jié)果顯示，人參屬植物的ITS2序列長(zhǎng)度均為230 bp，保守位點(diǎn)189個(gè)，變異位點(diǎn)41個(gè)，簡(jiǎn)約信息位點(diǎn)39個(gè)，自裔位點(diǎn)2個(gè)。GC含量較高，平均為64%，其中人參、西洋參的GC含量為63.5%。

2.3 遺傳距離分析

用MEGA5.05軟件計(jì)算人參屬物種的遺傳距離，結(jié)果顯示，種內(nèi)遺傳距離為0～0.004，種間遺傳距離為0.006～0.098，平均遺傳距離為0.044，其中人參和西洋參間的遺傳距離最小，為0.006?？梢?，ITS2序列在同物種之間高度保守，同屬不同種間遺傳距離差異較明顯，可以將ITS2序列作為分析及鑒別人參屬物種的依據(jù)。

2.4 ITS2序列聚類分析

基于ITS2序列，通過鄰接法（NJ）構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹（圖1）。從所構(gòu)建的進(jìn)化樹可以看出，人參屬物種與外群輪葉沙參聚為兩類，人參屬各個(gè)物種又分別聚為一類。表明ITS2基因可以有效區(qū)分人參屬物種，可以作為分子鑒定的條碼基因。

3 討論

傳統(tǒng)的中藥材鑒定方法如形態(tài)、顯微結(jié)構(gòu)、超微結(jié)構(gòu)和化學(xué)指紋圖譜等鑒定方法，在中藥材鑒定和評(píng)價(jià)其質(zhì)量研究中發(fā)揮了重要作用。但是，中藥飲片、粉末以及含有生藥原型的傳統(tǒng)中成藥的鑒定非常困難，采用形態(tài)鑒定方法已不可取?；瘜W(xué)分析方法研究的是植物的次生代謝產(chǎn)物，而次生代謝產(chǎn)物的含量又受生理?xiàng)l件、采收時(shí)間、貯藏等因素的影響，對(duì)于化學(xué)成分相似的物種就更難以區(qū)分，因此，傳統(tǒng)方法有一定局限性。而對(duì)基因組序列差異比較研究的分子生物學(xué)方法為植物分類和鑒定提供了可靠依據(jù)。

中藥材加工成飲片或粉末后，DNA降解比較嚴(yán)重，需要探索以短的DNA模板進(jìn)行有效擴(kuò)增的標(biāo)記基因[13]，本研究中人參屬ITS2基因擴(kuò)增長(zhǎng)度為230 bp，長(zhǎng)度適宜，且種間差異明顯，能夠有效擴(kuò)增并進(jìn)行種類區(qū)分，因此，ITS2基因更適合人參屬基原植物及加工藥材的鑒定，更適合作為人參屬物種鑒定的DNA條形碼。

基于K2P模型構(gòu)建的系統(tǒng)進(jìn)化樹能顯示物種間親緣關(guān)系的遠(yuǎn)近，幫助判斷物種的進(jìn)化關(guān)系，對(duì)物種的進(jìn)化分類研究及資源保護(hù)具有重要意義，DNA條形碼技術(shù)在物種資源保護(hù)及合理開發(fā)應(yīng)用方面將顯示出巨大的應(yīng)用前景。

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