軟棗獼猴桃離體快速繁殖技術(shù)

摘要：以軟棗獼猴桃（Actinidia arguta）枝條萌發(fā)的幼芽為外植體，以MS為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，添加不同質(zhì)量濃度的細(xì)胞分裂素6-BA、生長(zhǎng)素NAA和IBA，探索了軟棗獼猴桃的離體快速繁殖技術(shù)。結(jié)果表明，軟棗獼猴桃叢生芽增殖的最佳培養(yǎng)基為MS+2.0 mg/L 6-BA+0.2 mg/L IBA+30 g/L蔗糖，pH為5.8～6.0，在此條件下，其平均增殖系數(shù)為4.69，且誘導(dǎo)的無(wú)菌苗健壯；最適生根培養(yǎng)基為1/2MS+0.4 mg/L IBA+30 g/L蔗糖+2.0 g/L活性炭，生根率達(dá)100%，且根系健壯、數(shù)量繁多。

關(guān)鍵詞：軟棗獼猴桃（Actinidia arguta）； 離體快速繁殖；叢生芽增殖

中圖分類號(hào)：S663.4 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：0439-8114（2016）19-5007-04

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2016.19.027

Micropropagation in vitro of Actinidia arguta

ZHAO Rui1，ZHAO Chun-li1，AN Bai-yi1，DONG Ran1，WANG Ke-feng2，GU De-feng1

（1.College of Horticulture， Jilin Agricultural University， Changchun 130118， China；

2.Changchun University of Science and Technology， Changchun 130600， China）

Abstract： Using bud of Actinidia arguta branches germination as explants，with MS as basic culture medium by adding different mass concentration cytokinin 6-BA， auxin NAA and IBA，the micropropagation in vitro technology of A. arguta was explored. The results showed that the optimum proliferation medium of shoot cluster was MS+2.0 mg/L 6-BA+0.2 mg/L IBA+30 g/L sucrose，and pH was 5.8 to 6.0. Under this condition，the average multiplication coefficient was 4.96 with vigorous aseptic seedling. The best rooting medium was 1/2MS+0.4 mg/L IBA+30 g/L sucrose+2.0 g/L activated carbon，at these condition，the rooting rate was 100%，and the roots were well developed and had great quantity.

Key words： Actinidia arguta； micropropagation； shoot cluster multiplication

軟棗獼猴桃（Actinidia arguta Planeh.）屬于獼猴桃科（Actinidiaceae）獼猴桃屬（Actinidia），為多年生落葉藤本植物。具有非常高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，富含蛋白質(zhì)和多種礦物質(zhì)，尤其維生素C的含量很高。能有效提高人體的免疫力、有降血壓、降血脂、美容健美的功效[1，2]。并且在園林應(yīng)用中，由于其樹(shù)形優(yōu)美、果實(shí)奇特，可以作為觀賞樹(shù)種設(shè)計(jì)成花架或花棚，是極具商業(yè)化發(fā)展前景的觀賞型果樹(shù)之一[3]。

隨著野生資源引種馴化工作的逐步進(jìn)行，對(duì)于軟棗獼猴桃優(yōu)質(zhì)品種的苗木需求量急劇增加[4，5]，并且軟棗獼猴桃生產(chǎn)栽培應(yīng)用較少，多數(shù)為野生狀態(tài)，由于長(zhǎng)期處于野生狀態(tài)，資源面臨枯竭[6]。軟棗獼猴桃種子繁殖遺傳變異大，采用綠枝扦插的常規(guī)無(wú)性繁殖法，存在繁殖系數(shù)低、速度慢、植株取材受季節(jié)限制嚴(yán)格等問(wèn)題，影響優(yōu)良品種的開(kāi)發(fā)和利用[5，7]。因此，本試驗(yàn)以軟棗獼猴桃的腋芽為原材料，采用離體快速繁殖技術(shù)，快速高效地生產(chǎn)優(yōu)質(zhì)的軟棗獼猴桃植株，為其大規(guī)模生產(chǎn)奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料來(lái)源

試驗(yàn)材料采自吉林省吉林市山區(qū)，從果實(shí)飽滿、味道鮮美、長(zhǎng)勢(shì)健壯、形態(tài)優(yōu)美、產(chǎn)量高、雌雄異株的野生雌株軟棗獼猴桃上選取優(yōu)良枝條，試驗(yàn)室水培催芽20 d左右，腋芽陸續(xù)萌發(fā)，取萌發(fā)的腋芽為培養(yǎng)外植體。

1.2 外植體滅菌

將長(zhǎng)至大約1.3 cm的腋芽放入滅過(guò)菌的燒杯中，在超凈工作臺(tái)上，用0.05%的氯化汞分別滅菌2、3、4、5 min后用無(wú)菌水沖洗6～8次，將獲得的無(wú)菌外植體接入MS基礎(chǔ)培養(yǎng)基中。

1.3 叢生芽增殖培養(yǎng)基

分別添加不同質(zhì)量濃度的6-BA（1.0、2.0、3.0、4.0 mg/L）及IBA（0.1、0.2、0.3、0.4 mg/L）至含20 g/L蔗糖的MS培養(yǎng)基中，同時(shí)以不添加生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑的MS培養(yǎng)基作為對(duì)照。每種處理45個(gè)，重復(fù)3次，接種30 d時(shí)觀察組培苗的生長(zhǎng)狀態(tài)，并統(tǒng)計(jì)叢生芽的增殖系數(shù)。

1.4 壯苗培養(yǎng)基

以MS為基本培養(yǎng)基，添加不同濃度有機(jī)添加物進(jìn)行壯苗培養(yǎng)試驗(yàn)。分別添加蔗糖（30、40 g/L）；蔗糖15 g/L +蜂蜜15 g/L；蜂蜜（20、30 g/L）；白砂糖30 g/L；葡萄糖30 g/L；蛋白胨100 g/L。以MS+20 g/L蔗糖為對(duì)照（CK），每種處理45個(gè)，重復(fù)3次，篩選出最適合軟棗獼猴桃叢生芽壯苗的培養(yǎng)基。

1.5 生根培養(yǎng)基

當(dāng)無(wú)菌苗長(zhǎng)至2～3 cm，將其分別接種于不同質(zhì)量濃度IBA（0.2、0.4、0.6、0.8 mg/L）、NAA（0.2、0.4、0.6、0.8 mg/L）和活性炭（0、1.0、2.0、3.0 g/L）的1/2 MS 生根培養(yǎng)基中，進(jìn)行生根培養(yǎng)，以不添加生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑的1/2 MS培養(yǎng)基為對(duì)照，每種處理45個(gè)，重復(fù)3次，30 d時(shí)調(diào)查無(wú)菌苗的生根及生長(zhǎng)情況。

1.6 培養(yǎng)條件

pH 5.8～6.0，溫度（23±2） ℃，光照3 000 lx，光周期14 h/10 h（光培養(yǎng)/暗培養(yǎng)）。

1.7 統(tǒng)計(jì)方法

試驗(yàn)中所有數(shù)據(jù)采用Excel和DPS 14.5軟件進(jìn)行方差分析和多重比較。成活率=（成活芽數(shù)/接種芽數(shù)）×100%；污染率=（污染芽數(shù)/接種芽數(shù)）×100%；增殖系數(shù)=（再生芽總數(shù)/接種芽數(shù)）；平均根數(shù)=生根總數(shù)/生根苗數(shù)；平均根長(zhǎng)=根的總長(zhǎng)度/根的總條數(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 滅菌時(shí)間對(duì)外植體污染率的影響

軟棗獼猴桃腋芽經(jīng)過(guò)不同時(shí)間的滅菌后培養(yǎng)，試驗(yàn)10 d時(shí)觀察外植體的污染情況，30 d時(shí)觀察外植體的成活情況（圖1），從而選出軟棗獼猴桃的最佳滅菌時(shí)間。結(jié)果表明，隨著滅菌時(shí)間的延長(zhǎng)，外植體的污染率有所下降，但在滅菌時(shí)間為5 min時(shí)成活率出現(xiàn)下降（表1）。這是由于隨著處理時(shí)間增加，有利于降低污染，但當(dāng)處理時(shí)間超過(guò)一定限度時(shí)，會(huì)損害植株，滅菌時(shí)間為4 min時(shí)污染率和成活率最宜。故軟棗獼猴桃腋芽在0.05%的氯化汞中的最佳滅菌時(shí)間是4 min。

2.2 不同質(zhì)量濃度的6-BA和IBA對(duì)叢生芽增殖的影響

將初代培養(yǎng)的無(wú)菌幼苗切取頂芽1.5 cm左右，接種于不同質(zhì)量濃度配比的培養(yǎng)基中進(jìn)行叢生芽的增殖培養(yǎng)，接種16 d后，幼苗底部開(kāi)始長(zhǎng)出新的小幼芽，30 d時(shí)新生的叢生芽長(zhǎng)至2～4 cm（圖2）。結(jié)果表明，不同質(zhì)量濃度配比的6-BA和IBA對(duì)叢生芽增殖存在極顯著差異（P<0.01）。由表2可知，6-BA和IBA質(zhì)量濃度分別為2.0、0.2 mg/L時(shí)，增殖系數(shù)達(dá)到最大值，為4.69，并且幼芽生長(zhǎng)健壯，葉色濃綠。

2.3 不同質(zhì)量濃度的蔗糖、蜂蜜、白砂糖、葡萄糖和蛋白胨對(duì)叢生芽壯苗的影響

將繼代增殖培養(yǎng)的叢生芽接種于上述最佳生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑，再分別加入不同質(zhì)量濃度的蔗糖、蜂蜜、白砂糖、葡萄糖和蛋白胨的培養(yǎng)基中，培養(yǎng)30 d時(shí)觀察叢生芽壯苗情況。由表3可以看出，蔗糖和蜂蜜的濃度對(duì)叢生芽增殖和健壯程度都有一定的影響。結(jié)果表明，添加30 g/L蔗糖和添加30 g/L蜂蜜均與其他濃度的處理（除20 g/L蜂蜜外）呈極顯著或顯著差異，但二者之間對(duì)叢生芽增殖的影響差異不顯著。添加30 g/L蔗糖的叢生芽增殖系數(shù)為4.70且葉片濃綠有光澤，叢生芽莖粗壯，長(zhǎng)勢(shì)健壯；添加30 g/L蜂蜜的叢生芽增殖系數(shù)為4.76，但其莖纖細(xì)，長(zhǎng)勢(shì)較弱，葉片小而且少量卷曲，呈淡綠色。白砂糖和葡萄糖對(duì)叢生芽增殖的影響較小，加入蛋白胨的培養(yǎng)基無(wú)明顯現(xiàn)象，故軟棗獼猴桃最佳的壯苗培養(yǎng)基為MS+2.0 mg/L 6-BA+0.2 mg/L IBA+30 g/L蔗糖的培養(yǎng)基。

2.4 生根培養(yǎng)

2.4.1 植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑對(duì)生根的影響 在繼代培養(yǎng)中選取長(zhǎng)至2～3 cm生長(zhǎng)健壯、長(zhǎng)勢(shì)一致的無(wú)菌苗進(jìn)行生根試驗(yàn)。試驗(yàn)以1/2MS為基本培養(yǎng)基，分別添加不同質(zhì)量濃度的NAA（0.2、0.4、0.6、0.8 mg/L）、IBA（0.2、0.4、0.6、0.8 mg/L），培養(yǎng)30 d時(shí)統(tǒng)計(jì)生根情況，具體結(jié)果見(jiàn)表4。由表4可知，添加NAA的培養(yǎng)基中，根部出現(xiàn)了大量褐色的愈傷組織，并且根都較脆弱易折斷，須根多且細(xì)，隨著NAA濃度的增加，平均生根數(shù)下降；添加IBA的培養(yǎng)基中，0.4 mg/L IBA的生根率最高可達(dá)到100%，平均生根數(shù)也最高，與其他IBA質(zhì)量濃度處理存在極顯著差異，并且根呈綠色，堅(jiān)韌粗壯，較少有愈傷組織（圖3），隨著IBA濃度的增加，平均生根數(shù)降低且根逐漸變細(xì)，顏色變淡，出現(xiàn)愈傷組織的機(jī)率不斷增加，并且愈傷組織也隨之增大。故生根最好的生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑配比為1/2MS+0.4 mg/L IBA。

2.4.2 活性炭對(duì)生根的影響 將繼代培養(yǎng)的無(wú)菌苗接種于上述生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑最適宜的生根培養(yǎng)基中并且加入不同質(zhì)量濃度的活性炭，培養(yǎng)30 d時(shí)統(tǒng)計(jì)生根情況。由表5可知，添加1.0、2.0 g/L活性炭與不添加活性炭的平均生根數(shù)差異不顯著，但添加2.0 g/L活性炭的植株無(wú)愈傷組織且植株健壯，根堅(jiān)韌粗壯（圖4）。繼續(xù)增加活性炭含量，發(fā)現(xiàn)雖然平均根長(zhǎng)增加但根系質(zhì)量下降，細(xì)且易斷，有較多的褐色愈傷組織并且生根數(shù)明顯減少。故1/2MS+0.4 mg/L IBA+30 g/L蔗糖+2.0 g/L活性炭為生根的最佳培養(yǎng)基。

3 討論

在利用組織培養(yǎng)進(jìn)行軟棗獼猴桃離體快速繁殖過(guò)程中，使用植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑是提高幼芽增殖系數(shù)的重要因素之一[8，9]。劉長(zhǎng)江等[10]對(duì)野生軟棗獼猴桃莖尖培養(yǎng)研究發(fā)現(xiàn)，生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑濃度為2.0 mg/L 6-BA+0.2 mg/L IBA對(duì)叢生芽增殖的效果顯著，叢生芽形成的最多，增殖系數(shù)最大，與本試驗(yàn)的結(jié)果基本一致。為使繼代培養(yǎng)的無(wú)菌苗長(zhǎng)勢(shì)健壯并且增殖系數(shù)大，在繼代培養(yǎng)基中添加蔗糖、蜂蜜、白砂糖、葡萄糖和蛋白胨等有機(jī)添加物。培養(yǎng)基中添加蜂蜜在軟棗獼猴桃的組織培養(yǎng)中尚未見(jiàn)報(bào)道，雖然其增殖系數(shù)最大，但長(zhǎng)勢(shì)較弱，不適宜添加在壯苗階段。生根質(zhì)量可直接影響移栽成活率[11]，本試驗(yàn)在篩選出有利于生根的生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑基礎(chǔ)上添加2.0 g/L活性炭有效地提高了生根質(zhì)量，使根系健壯，根部堅(jiān)韌粗壯不產(chǎn)生愈傷組織。這與王大平等[12]對(duì)獼猴桃組培苗生根培養(yǎng)的研究結(jié)果相似。

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