月季抗根癌病和根腐病復(fù)合砧木的預(yù)選

摘要：為獲得抗月季根癌病、根腐病復(fù)合砧木品種，以R及4倍體薔薇雜交獲得的3株雜交后代為試材，進(jìn)行了根癌病、根腐病抗性鑒定、扦插成活率及嫁接親和性試驗(yàn)。結(jié)果表明，3株雜交后代的腫瘤形成率約為20%，具有較強(qiáng)的根癌病抗性；插穗褐變度為20%左右，顯著低于感病品種R，具有較強(qiáng)的根腐病抗性；扦插成活率為70%左右，達(dá)到了生產(chǎn)上的要求；雜種后代R

5嫁接成活率為80%，其他兩個(gè)后代達(dá)到了100%。結(jié)合枝條綜合性狀考慮，雜交后代R. hybrida×multiflora F1 No.1生長勢強(qiáng)，枝條伸長性好，少刺，有望成為抗月季根癌病、根腐病的復(fù)合砧木品種。

關(guān)鍵詞：月季根癌??；根腐病；砧木

中圖分類號：S685.12+4 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號：0439-

近年來，月季（Rosa hybrida Hort.）的根癌病和根腐病對花卉生產(chǎn)造成了極大的危害。月季根癌病是由根癌土壤桿菌[Rhizobium radiobacter（Bei. et Van Deldan） Prilzam][1]引起的一種土傳根系病害，一旦感染，會(huì)擴(kuò)散至植物全株，導(dǎo)致植株生長遲緩，生長勢減弱，而且目前還沒有辦法防除。月季根腐病于2001年在日本被發(fā)現(xiàn)，是由Pythium helicoides Drechsler引起的一種高溫型土傳根系病害[2]，一旦感染，根部褐變，葉片黃化，最終導(dǎo)致植株死亡。在花卉育種領(lǐng)域，抗病育種與高觀賞價(jià)值育種同樣被越來越多的科學(xué)家所重視；抗性品種的育成，不僅可以減少農(nóng)藥的使用，在栽培方面還可以節(jié)省人力物力，這對于發(fā)展可持續(xù)性環(huán)保型農(nóng)業(yè)具有極大地推動(dòng)作用。在月季生產(chǎn)中，國外已廣泛應(yīng)用了嫁接苗，嫁接植株在生物產(chǎn)量、冠幅及抗病害等方面都高于自根繁殖植株；繁殖月季嫁接苗在中國的推廣也必將成為一種趨勢，并且抗病砧木的應(yīng)用，無論月季接穗品種有無抗病性，都能使其在病害防治方面具有可能。因此，選育抗病砧木品種成為當(dāng)前月季應(yīng)用研究的重要課題。篩選對月季根癌病表現(xiàn)出一定抗性的砧木品種雖然有報(bào)道[3-5]，但在實(shí)際生產(chǎn)應(yīng)用中，卻未見普及。周林等[6]利用組織培養(yǎng)幼苗接種法對24個(gè)切花月季品種進(jìn)行根癌病鑒定，發(fā)現(xiàn)R. hybrida cv. PEKcougel對根癌病表現(xiàn)出極高的抗性，并且抗性能夠遺傳給后代；而R. hybrida cv. Dukat和R. hybrida cv. Golden Emblem為易感品種[7]。在月季根腐病方面，雖然薔薇（R. multiflora Thunb.）品種R. multiflora cv. Matsushima No.3對根腐病具有很強(qiáng)的抗性[8]，但由于枝條細(xì)弱，不適合嫁接，而未能推廣。因此，試驗(yàn)利用R. hybrida cv. PEKcougel對根癌病的抗性與R. multiflora cv. Matsushima No.3對根腐病的抗性，將這2個(gè)品種進(jìn)行正、反雜交，并利用胚挽救技術(shù)，得到雜交后代；然后對獲得的雜交后代進(jìn)行根癌病、根腐病抗性評價(jià)，通過無性繁殖及嫁接親和性試驗(yàn)，篩選抗根癌病、根腐病的后代，現(xiàn)將結(jié)果報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 供試材料

2009年5月， 以R. hybrida cv. PEKcougel為母本，4倍體R. multiflora cv. Matsushima No.3為父本[9]，進(jìn)行了人工雜交授粉，再利用胚挽救技術(shù)成功獲得雜種后代，并利用R. multiflora特異引物SCAK16[10]進(jìn)行雜種鑒定，最終確認(rèn)獲得了3株雜交后代，即R. hybrida×multiflora F1 No.1、R. hybrida×multiflora F1 No.5、R. hybrida×multiflora F1 No.6。

1.2 根癌病抗性鑒定

1.2.1 供試菌株 供試菌株為日本國岐阜縣從月季腫瘤分離得到的根癌土壤桿菌R. radiobacter菌株GOU1[6]，原菌活化采用YEB培養(yǎng)基（Bacto牛肉膏5 g/L+Bacto酵母提取物1 g/L+蛋白胨5 g/L+蔗糖5 g/L+MgSO4·7H2O 0.493 g/L，pH 7.2），活化后菌液濃度為1.0×1010個(gè)/mL。

1.2.2 接種 接種鑒定法為岐阜大學(xué)開發(fā)的瓶外浸蘸法。根癌病鑒定的抗病對照品種為R. hybrida cv. PEKcougel，感病對照品種為R. hybrida cv. Dukat。選擇雜交后代從植株根部發(fā)出的15～25 cm長新梢，從上部完全展開的幼葉開始，把向下的頭2個(gè)節(jié)間作為鑒定材料。樣品用洗潔精溶液清洗，再用流水沖洗20 min，然后用70%乙醇滅菌1 min，于超凈工作臺(tái)內(nèi)，先用1% NaClO滅菌20 min（加2～3滴Tween-20），然后用無菌水浸泡沖洗5次。再在超凈工作臺(tái)上將節(jié)間橫切成厚度為（5 mm±1 mm）的小段，放入濃度為1.0×1010個(gè)/mL的菌液內(nèi)浸染5 min后，置于沒有添加任何激素的MS培養(yǎng)基內(nèi)，25 ℃、3 000 lx、16 h日常條件下共存培養(yǎng)72 h。然后將節(jié)間小段依次浸入濃度為100、200、500 mg/L的Claforan溶液內(nèi)約1 min，振蕩洗凈，再置于添加了100 mg/L Claforan的MS培養(yǎng)基內(nèi)繼代培養(yǎng)6周，每周更換相同的培養(yǎng)基。試驗(yàn)重復(fù)3次，每次每個(gè)雜種后代月季節(jié)間小段接種培養(yǎng)30個(gè)以上。

1.2.3 抗病性評價(jià) 培養(yǎng)6周后，觀察是否形成愈傷組織，利用Otten紙電泳法[11]分析成活的愈傷組織是否為腫瘤。將需要鑒定的愈傷組織研磨、離心，取上清液點(diǎn)樣于層析濾紙上，以胭脂堿（Nopaline）標(biāo)準(zhǔn)品為對照，10 mg/mL的亞甲基藍(lán)作為電泳標(biāo)記。電泳液為甲酸∶乙酸∶滅菌水=1∶3∶10混合液。電泳結(jié)束后，將層析濾紙干燥，噴染色液（Phenanthrenequinone 10 mg+99%乙醇50 mL∶NaOH 5 g+60%乙醇50 mL=1∶1），再次干燥，然后用紫外燈檢測儀觀察是否出現(xiàn)熒光斑點(diǎn)，判斷是否為腫瘤。

愈傷組織形成率=形成愈傷組織的成活節(jié)間莖段/成活節(jié)間莖段總數(shù)×100%。

腫瘤形成率=形成腫瘤的成活節(jié)間莖段/成活節(jié)間莖段總數(shù)×100%。

1.3 根腐病抗性鑒定

1.3.1 供試菌株 供試菌株為岐阜縣從微型月季根部分離得到的高溫型土傳P. helicoides菌株B5[2]。接種源為利用Glassblade法[12]形成的游走子，再利用血球計(jì)數(shù)板將游走子密度調(diào)整為1.0×103個(gè)/L。

1.3.2 接種 接種鑒定法參照文獻(xiàn)[8]的方法，根腐病鑒定的抗病對照品種為4倍體R. multiflora cv. Matsushima No.3，感病對照品種為R. hybrida cv. Nakashima 91。分別取雜交后代從植株根部發(fā)出的70～100 cm長的新枝條，剪成含一個(gè)芽點(diǎn)的3～5 cm長的插穗，基部輕蘸0.5%吲哚丁酸（IBA）粉劑，扦插于含草炭的混合培養(yǎng)土與蛭石為2∶1的基質(zhì)中。將生根的插穗進(jìn)行接種，1周后調(diào)查根部褐變度，褐變指數(shù)按以下7個(gè)級別實(shí)施調(diào)查，①0.0，健全的白根；②0.5，輕微褐變；③1.0，少部分褐變；④ 1.5，全體50%褐變；⑤2.0，全體75%褐變；⑥2.5，地上部存活，根部褐變；⑦3.0，地上部枯死，根部褐變。再按下列計(jì)算公式算出褐變度。試驗(yàn)重復(fù)3次，每次每個(gè)品種鑒定30個(gè)插穗以上。

褐變度=Σ（褐變指數(shù)×褐變株數(shù)）/（最大褐變指數(shù)×調(diào)查株數(shù)）×100%。

1.4 扦插成活試驗(yàn)

對照砧木品種為香水月季[R. odorata（Andr.）Sweet.]及4倍體薔薇品種R. multiflora cv. Matsushima No.3。剪取新發(fā)的成熟枝條，去掉下部較粗部分和上部未成熟部分，每個(gè)插穗留一個(gè)芽眼，輕蘸0.5% IBA，利用穴盤進(jìn)行扦插，扦插基質(zhì)為2∶1含草炭的混合培養(yǎng)土與蛭石。扦插環(huán)境為溫度（23 ℃±2 ℃）、濕度90%以上、光照度4 000 lx的全光照自動(dòng)噴霧育苗室。扦插生根培養(yǎng)一個(gè)月后，調(diào)查生根率。5個(gè)品種（單株）都重復(fù)3次，每次50株以上。

扦插成活率=生根插穗數(shù)/插穗總數(shù)×100%。

1.5 嫁接親和性試驗(yàn)

對照砧木為香水月季，處理砧木是3個(gè)雜種后代，接穗品種是R. hybrida cv. Samurai 08，嫁接法為貼接，用夾子夾住。嫁接2個(gè)月后調(diào)查了嫁接成活率。每個(gè)嫁接組合一次性嫁接100株。

嫁接成活率=成活植株數(shù)/嫁接株數(shù)×100%。

2 結(jié)果與分析

2.1 月季根癌病鑒定

繼代培養(yǎng)6周后，統(tǒng)計(jì)了存活莖段的愈傷組織形成率，結(jié)果見圖1。從圖1可見，R. hybrida×multiflora F1 No.1、R. hybrida×multiflora F1 No.5、R. hybrida×multiflora F1 No.6的愈傷組織形成率分別為28.8%、27.3%、20.5%，顯著低于R. hybrida cv. Dukat的91.2%（P<0.05），與12.5%的R. hybrida cv. PEKcougel無顯著差異（P>0.05）。在內(nèi)源激素的作用下，即使根癌病菌侵染未成功，莖段也會(huì)形成愈傷組織，腫瘤與愈傷組織用肉眼無法判別；因此又對存活莖段形成的愈傷組織是否為腫瘤進(jìn)行了鑒定，其腫瘤形成率見圖2。從圖2可見，R. hybrida cv. PEKcougel的腫瘤形成率為0，R. hybrida×multiflora F1 No.1、R. hybrida×multiflora F1 No.5、R. hybrida×multiflora F1 No.6的腫瘤形成率分別為22.4%、26.4%、20.5%，顯著低于77.2%的R. hybrida cv. Dukat（P<0.05）。

2.2 月季根腐病鑒定

供試植株接種一周后，插穗褐變度情況見圖3。圖3所示，感病品種R. hybrida cv. Nakashima 91的褐變度為55.5%，抗性品種R. multiflora cv. Matsushima No.3的褐變度為8.8%。R. hybrida×multiflora F1 No.1、R. hybrida×multiflora F1 No.5的褐變度分別為24.1%，25.8%，都顯著低于感病品種R. hybrida cv. Nakashima 91（P<0.05），R. hybrida×multiflora F1 No.6的褐變度為12.9%，顯著低于R. hybrida cv. Nakashima 91及R. hybrida×multiflora F1 No.1、R. hybrida× multiflora F1 No.5（P<0.05），與抗病品種R. multiflora cv. Matsushima No.3無顯著差異（P>0.05）。

2.3 月季扦插成活率

扦插易成活是作為砧木的重要指標(biāo)之一，試驗(yàn)的扦插成活率情況見圖4。從圖4可見，對照砧木香水月季和薔薇R. multiflora cv. Matsushima No.3都達(dá)到了100%，而R. hybrida×multiflora F1 No.1、R. hybrida×multiflora F1 No.5、R. hybrida×multiflora F1 No.6的扦插成活率分別為73.6%，68.5%，71.8%，3株雜交后代間無顯著差異（P>0.05），但與2個(gè)砧木品種的成活率達(dá)到了顯著差異水平（P<0.05）。

2.4 月季嫁接親和性

作為砧木品種，嫁接親和性是一個(gè)很重要的指標(biāo)，試驗(yàn)達(dá)到的嫁接成活情況見圖5。從圖5可見，砧木品種香水月季與接穗品種R. hybrida cv. Samurai 08嫁接后的成活率為100%，雜交后代R. hybrida×multiflora F1 No.1、R. hybrida×multiflora F1 No.6作為砧木與接穗的嫁接成活率也達(dá)到了100%，但R. hybrida×multiflora F1 No.5的嫁接成活率卻為80%，低于香水月季及R. hybrida×multiflora F1 No.1、R. hybrida×multiflora F1 No.6的水平。

3 小結(jié)與討論

采用日本岐阜大學(xué)開發(fā)的月季根癌病鑒定的瓶外浸蘸法，測試得到的根癌病抗性品種R. hybrida cv. PEKcougel、感病品種R. hybrida cv. Dukat的腫瘤形成率分別為0、77%，與In vitro法鑒定得到的發(fā)病率情況基本一致[4，6]，表明瓶外浸蘸法鑒定根癌病具有實(shí)用性。Zhou等[13]報(bào)道，鑒定月季根癌病的In vitro法，首先需要將試驗(yàn)材料進(jìn)行組織培養(yǎng)，達(dá)到能夠進(jìn)行根癌病鑒定的要求后才能實(shí)施，其操作費(fèi)時(shí)、費(fèi)工。而新開發(fā)的瓶外浸蘸法，可以直接使用植株新梢，操作簡便、可行，如果要進(jìn)行大批量實(shí)驗(yàn)材料的鑒定時(shí)，可以在很大程度上節(jié)省時(shí)間與人力。但此方法使用的新梢容易受栽培環(huán)境、施肥時(shí)期、修剪方式等因素的影響，所以要求將鑒定植株在相同條件下栽植管理。本試驗(yàn)所采枝條的月季均定植在相同的栽培條件下，保證了試驗(yàn)材料栽培管理的一致性。

試驗(yàn)在侵染莖段培養(yǎng)過程中，出現(xiàn)了褐變枯死的莖段，而且還發(fā)現(xiàn)了有已形成愈傷組織而枯死的莖段，未形成愈傷組織褐變枯死莖段的枯死時(shí)期與病菌感染成功時(shí)間的前后無法判定；此外，植物外植體離體培養(yǎng)時(shí)，條件適宜可形成愈傷組織[14]，分析試驗(yàn)里形成愈傷組織的枯死莖段可能是受根癌病菌感染后形成的腫瘤，也可能是未感染、單純形成的愈傷組織，所以，以上2種情況的褐變枯死莖段的腫瘤形成率無法判斷。由于試驗(yàn)只使用了生存的莖段統(tǒng)計(jì)腫瘤形成率，根癌病抗性品種R. hybrida cv. PEKcougel、感病品種R. hybrida cv. Dukat的腫瘤形成率與前人結(jié)果[4，6]對比基本一致，表明了數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)的可行性。5個(gè)試驗(yàn)材料間雖然愈傷組織形成率與腫瘤形成率的趨勢基本一致，但經(jīng)鑒定，形成的愈傷組織并不一定就是腫瘤，所以建議對形成的愈傷組織進(jìn)行腫瘤鑒定，以腫瘤形成率為判定結(jié)果。

3株雜種后代根腐病褐變度都為20%左右，對根腐病都具有較強(qiáng)的抗性，進(jìn)一步表明抗根腐病品種R. multiflora cv. Matsushima No.3的抗性是可遺傳的，這與文獻(xiàn)的研究結(jié)果[15]是一致的。目前，雖然日本以外的國家沒有月季根腐病發(fā)病的報(bào)道，但由于月季在國際市場上日益頻繁的流通，增加了各種病害隨之傳播到世界各地的可能性。同時(shí)，月季嫁接苗的使用也必將是月季產(chǎn)業(yè)的發(fā)展趨勢，所以，抗月季根腐病砧木品種的育成具有重要的意義。

試驗(yàn)里雜交后代的扦插生根率為70%左右，雖然未達(dá)到常用砧木品種100%的成活率，但據(jù)日本月季生產(chǎn)者說也是充分達(dá)到了砧木品種的要求。并且扦插生根率受環(huán)境條件及枝條狀態(tài)影響較大，其扦插成活率有進(jìn)一步提高的可能。

嫁接親和性試驗(yàn)的嫁接法是在日本普遍應(yīng)用的將砧木與接穗的接合部分用夾子夾住的方法，接穗R. hybrida cv. Samurai 08是日本紅色月季的主栽品種。雖然R. hybrida×multiflora F1 No.5的嫁接成活率為80%，但整體來看，雜種后代具有較高的嫁接親和性。另外，試驗(yàn)還對不同嫁接組合的愈合情況做了石蠟切片觀察（數(shù)據(jù)未使用），其接口均愈合良好，沒有發(fā)現(xiàn)不良現(xiàn)象。

試驗(yàn)結(jié)果表明，3株雜交后代均具有較強(qiáng)發(fā)枝力及枝條伸長性，其中R. hybrida×multiflora F1 No.1、R. hybrida×multiflora F1 No.6的刺密度較R. hybrida×multiflora F1 No.5少，與香水月季同等程度。綜合考慮后認(rèn)為，R. hybrida×multiflora F1 No.1更有望成為抗根癌病、根腐病的復(fù)合砧木品種。

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