桉樹人工林根際土壤DNA提取的優(yōu)化

摘要：通過優(yōu)化土壤微生物總DNA的提取方法，獲得高純度、高得率和完整性好的總DNA，為桉樹種植地土壤微生物群落多樣性的分析奠定基礎(chǔ)。綜合比較已報道的土壤微生物DNA提取方法的優(yōu)缺點(diǎn)，設(shè)計了7種從巨桉（Eucalyptus grandis Hill ex Maiden）人工林根際土壤中直接提取微生物DNA的方法，并通過PCR擴(kuò)增、DGGE電泳及熒光定量PCR分析比較了不同方法所提取DNA的質(zhì)量以及對后期分子生物學(xué)研究的適用性。結(jié)果表明，使用PVPP和硫酸鋁銨聯(lián)用吸附腐殖酸雜質(zhì)后，采用PEG 8 000沉淀能夠有效地提取桉樹根際土壤DNA。該方法提取的DNA純度最高，OD260 nm/OD230 nm達(dá)到2.45，OD260 nm/OD280 nm達(dá)到1.78，DNA得率為5.56 μg/g土壤，適用于PCR擴(kuò)增和熒光定量分析，并且通過DGGE電泳分離出最豐富的條帶，是一種高效的提取土壤微生物DNA方法。

關(guān)鍵詞：桉樹（Eucalyptus）人工林；根際；土壤；DNA提??；PCR擴(kuò)增

中圖分類號：Q781；Q939.96 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A 文章編號：0439-8114（2016）12-3207-05

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2016.12.053

Abstract： In order to obtain DNA with high purity， high yield and good integrity from the soil， for the analysis of the soil microbial diversity of Eucalyptus plantation， after comprehensive comparison of strengths and weaknesses of the commonly used methods for microbial DNA isolation，seven methods were designed to extract microbial DNA directly from the rhizosphere soil，and the different extraction methods were evaluated comprehensively for the DNA quality and applicability of the molecular biology by PCR， DGGE and RT-PCR. The results showed that during the improved high salt extraction procedures， PVPP and AlNH4（SO4）2 added in the DNA extraction buffer， and PEG 8 000 precipitation were required for the effective adsorption of humic acid impurities.The method gave the purest DNA with 2.45 at OD260 nm/OD230 nm and 1.78 at OD260 nm/OD280 nm， and the yield was appropriate with 5.56 μg/g DNA rhizosphere soil， which was suitable for PCR and RT-PCR， and the most abundant bands could be obtained by DGGE as well.

Key words： Eucalyptus plantation； rhizosphere； soil； DNA extraction； PCR amplification

土壤微生物是影響土壤生態(tài)過程的一個重要因素，在土壤形成與發(fā)育、土壤結(jié)構(gòu)改良、肥力保持以及高等植物的生長等方面具有重要作用[1]。根際作為植物根和土壤的界面，定殖了大量的微生物和無脊椎動物，被認(rèn)為是地球上最具動態(tài)的交界面[2]。在植物根系和土壤微生物相互作用的過程中，土壤微生物群落結(jié)構(gòu)變化對根際微生態(tài)系統(tǒng)中養(yǎng)分活化、植物抗病性等方面都產(chǎn)生一系列影響[3]。近些年，關(guān)于林木根際土壤微生物的研究日趨增多，已在多個地區(qū)和多個樹種上得到開展（茶樹、落葉松、刺槐等）[4，5]。但目前關(guān)于桉樹根際土壤微生物的研究仍以少量分離培養(yǎng)的方法為主[6，7]。桉樹（Eucalyptus robusta Smith）是桃金娘科（Myrtaceae）桉屬（Eucalyptus）樹種的總稱，具有速生、高產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)的特點(diǎn)，現(xiàn)已成為中國南方速生豐產(chǎn)林的戰(zhàn)略性樹種。近年來，關(guān)于速生樹種經(jīng)營而產(chǎn)生的系列生態(tài)問題包括土地退化、生產(chǎn)力下降、小氣候改變、生物多樣性減少等，受到了極大的關(guān)注[8，9]。

從土壤中獲得高純度、高得率和完整性好的總DNA是在基因水平上研究土壤微生物群落多樣性的基礎(chǔ)[10]。利用常規(guī)的研究方法對土壤微生物分離、培養(yǎng)、鑒定有一定難度，相當(dāng)多的微生物因無法人工培養(yǎng)而未被認(rèn)識。采用分子生物學(xué)手段，基于16S rDNA和18S rDNA在進(jìn)化過程中的保守性對植物根際土壤微生物進(jìn)行分類鑒定已經(jīng)取得了一些成果[11，12]。然而由于土壤中金屬離子、腐殖酸等物質(zhì)的影響，導(dǎo)致所提取的DNA不能較好地滿足后續(xù)的分子生物學(xué)操作[13]，因此對土壤樣品中高效提取DNA方法的探索對于在分子水平研究根際土壤微生物多態(tài)性具有重要意義。

本研究通過比較不同土壤微生物總DNA的提取方法對桉樹根際土壤總DNA提取效率和腐殖酸等雜質(zhì)去除率的影響，確定最適桉樹根際土壤微生物總DNA提取方法，為后續(xù)利用分子生物學(xué)手段分析研究桉樹根際土壤微生物多態(tài)性和功能特征奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試土壤類型為褐色土，取自重慶市永川區(qū)茶山竹海景區(qū)（105°51′23′′E，29°14′19′′N）“重慶市永川區(qū)速生豐產(chǎn)桉樹試驗示范基地”巨桉（Eucalyptus grandis Hill ex Maiden）人工林根際。巨桉種植3年，生長條件良好，生長健壯，面積共1.5 hm2，分3塊樣地，各0.5 hm2。將巨桉根際表層枯枝落葉層去除后，取距表層土深度約0～15 cm處土壤，5點(diǎn)取樣法取樣，將所取得的土樣混勻置冰盒中帶回實驗室，置于-20 ℃保存。

1.2 試劑與儀器

主要試劑：SDS、Tris、EDTA、PVPP、PEG 8 000、RNase A、乙酸銨、乙醇、硫酸鋁銨、氯仿、異戊醇、異丙醇、Ezup柱式土壤基因組DNA抽提試劑盒，E.Z.N.A.TM Soil DNA Kit、熒光定量試劑盒。

主要儀器：微量高速離心機(jī)、凝膠成像分析系統(tǒng)、超微量核酸定量儀、基因突變檢測系統(tǒng)（DCODE）、實時熒光定量PCR儀。

1.3 試驗方法

1.3.1 桉樹根際土壤總DNA提取方法

1）方法1：根據(jù)文獻(xiàn)[14，15]改良高鹽提取法，稱取0.3 g土壤，加入650 μL DNA裂解液（500 mmol/L NaCl， 50 mmol/L Tris-HCl，50 mmol/L EDTA， 4% SDS，pH 8.0），150～600 μm酸洗玻璃珠（50 mg），70 ℃水浴10 min，使用TissueLyserⅡ 30 Hz研磨3 min，70 ℃水浴10 min，12 000 r/min室溫離心3 min，吸取800 μL上清至干凈離心管，提取液加入3 μL RNase A（20 mg/mL），室溫放置5 min，加入200 μL的雜質(zhì)沉淀劑10 mol/L乙酸銨，顛倒混勻，呈白色或者淡黃色渾濁液，冰浴5 min，12 000 r/min離心2 min，吸取約600 μL上清至干凈離心管，加入等體積氯仿∶異戊醇（24∶1）充分混勻，12 000 r/min離心5 min，吸取上清至干凈離心管，加入等體積PEG 8 000沉淀劑（13% PEG 8 000 1.6 mol/L NaCl），-80 ℃凍存30 min，離心獲取沉淀并使用75%乙醇清洗2次，使用50 μL TE 37 ℃溶解沉淀，得到的DNA溶液置于-20 ℃保存。1%瓊脂糖凝膠電泳檢測并采用超微量核酸定量裝置測定DNA的含量及純度。

2）方法2：將方法1中的PEG 8 000沉淀劑改為異丙醇沉淀，其他操作不變。

3）方法3：在方法1的提取緩沖液中加入200 μL絮凝劑（200 mmol/L硫酸鋁銨），其他操作不變。

4）方法4：在方法1的提取緩沖液中加入2%PVPP吸附劑，其他操作不變。

5）方法5：采用E.Z.N.A.TM Soil DNA Kit提取，操作見說明書。

6）方法6：采用生工生物工程（上海）股份有限公司Ezup柱式土壤基因組DNA抽提試劑盒提取，操作見說明書。

7）方法7：在方法1的基礎(chǔ)上，同時加入2%PVPP和200 μL絮凝劑（200 mmol/L硫酸鋁銨），其他操作不變。

1.3.2 細(xì)菌16S rDNA的PCR擴(kuò)增效率檢測 以7種方法提取所得DNA原液以及稀釋50倍的DNA為模板。采用細(xì)菌16S rDNA保守片段V3區(qū)通用引物（357f，518r）進(jìn)行PCR擴(kuò)增。20 μL PCR擴(kuò)增體系包含10 μL 2×PCR Mix，模板0.8 μL，上、下游引物各0.2 μL，BSA 2 μL，去離子水6.8 μL。PCR程序為95 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃變性10 s，55 ℃退火15 s，72 ℃ 延伸30 s，34個循環(huán)；最后72℃延伸7 min。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的檢測以1.0%瓊脂糖凝膠，凝膠成像系統(tǒng)觀察并照相記錄。

1.3.3 細(xì)菌16S rDNA V3區(qū)變性梯度凝膠電泳檢測 PCR-DGGE分析采用8%聚丙烯酰胺凝膠配制30%～60%的變性梯度膠，上樣量為50 μL PCR反應(yīng)產(chǎn)物（357fGC-518r），200 V預(yù)電泳10 min后80 V電泳15 h。用0.01% GelRed染色50 min，在凝膠成像系統(tǒng)紫外光下觀察并照相記錄。

1.3.4 細(xì)菌16S rDNA的V3區(qū)熒光定量PCR擴(kuò)增檢測 將方法7提取的桉樹種植地土壤DNA梯度稀釋，以16S rDNA通用引物（357f，518r）進(jìn)行熒光定量PCR擴(kuò)增，檢測擴(kuò)增效率。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

利用Quantity one軟件進(jìn)行DGGE圖譜分析，使用Shannon多樣性指數(shù)（H’）、Margalef豐富度指數(shù)（D）以及Pielou均勻度指數(shù)（E）對細(xì)菌16S rDNA V3區(qū)變性梯度凝膠電泳條帶圖譜多樣性進(jìn)行分析，其計算公式[16]為：

H’=-Σ（ni/N）lg（ni/N）

D=（S-1）/lnN

E=H’/lnS

式中，ni為每條電泳條帶光密度峰值；N是同一泳道中所有條帶光密度峰值總和。電泳條帶光密度的峰值通過分析軟件Quantity one進(jìn)行讀取，S為每一泳道總的條帶數(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同方法對桉樹根際土壤總DNA粗提和純度的影響

7種DNA提取方法均可有效提取桉樹種植地土壤總DNA。不同方法提取DNA的電泳圖（圖1）和核酸定量檢測儀紫外檢測值（表1）顯示沉淀劑和腐殖酸去除劑對土壤總DNA質(zhì)量的影響較大。采用PEG 8 000（方法1）比用異丙醇沉淀（方法2）效果好，異丙醇將大量的腐殖酸等雜質(zhì)帶入DNA溶液，并且和DNA結(jié)合牢固，溶液呈黃色，電泳時樣品更多地停留在點(diǎn)樣孔上（圖1）。在腐殖酸的去除劑選擇上，硫酸鋁銨（方法3）作為金屬離子絮凝劑較2% PVPP（方法4）沉淀效果更加明顯，DNA純度更高，但DNA得率有部分損失。硫酸鋁銨和PVPP聯(lián)用去除腐殖酸，同時采用PEG 8 000沉淀DNA（方法7）與使用商業(yè)試劑盒（方法5、方法6）相比，DNA純度都較高，OD260 nm/OD280 nm接近1.8，OD260 nm/OD230 nm大于2.0，顯示純度很高。方法7由于聯(lián)用硫酸鋁銨和PVPP導(dǎo)致DNA得率有所下降，為5.56 μg/g土壤，但也能夠達(dá)到商業(yè)試劑盒的水平。

2.2 16S rDNA擴(kuò)增分析

由于土壤中的雜質(zhì)如腐殖酸、腐殖酸樣物、酚類化合物及重金屬（鐵離子等）等物質(zhì)可顯著抑制PCR擴(kuò)增反應(yīng)，可通過對DNA原液稀釋50倍進(jìn)行PCR分析，判斷所提取核酸中抑制物含量。從擴(kuò)增后電泳圖可以看出，直接使用未稀釋的DNA原液進(jìn)行16S rDNA V3-V5區(qū)擴(kuò)增，只有方法3、方法5、方法7能夠擴(kuò)增出正確條帶，而稀釋50倍后，除方法2外都能成功擴(kuò)增（圖2）。方法7通過聯(lián)用硫酸鋁銨、PVPP結(jié)合PEG沉淀能夠很好地去除干擾PCR擴(kuò)增的雜質(zhì)成分，能夠達(dá)到進(jìn)口商業(yè)試劑盒的提取效果，使得大量提取復(fù)雜樣本核酸的成本顯著降低。

2.3 細(xì)菌16S rDNA變性梯度凝膠電泳

采用方法3、方法5、方法7提取的桉樹根際土壤DNA，對其進(jìn)行細(xì)菌16S rDNA V3區(qū)DGGE分析。結(jié)果（圖3）表明，這3種方法提取的DNA均能進(jìn)行PCR-DGGE分析，能夠表征桉樹根際土壤中豐富的細(xì)菌群落組成。但不同提取方法間DGGE圖譜條帶組成顯示出一定差異，方法7提取的16S rDNA DGGE圖譜的Shannon多樣性指數(shù)、Margalef豐富度指數(shù)以及Pielou均勻度指數(shù)均高于方法3和方法5（表2），該提取方法更能較好反映桉樹根際土壤微生物群落組成。

2.4 細(xì)菌16S rDNA的V3區(qū)熒光定量PCR擴(kuò)增檢測分析

利用PVPP和硫酸鋁銨聯(lián)用吸附抑制物，并采用聚乙二醇沉淀DNA（方法7）提取桉樹種植地土壤DNA，將DNA原液按5倍濃度梯度稀釋，以16S rRNA通用引物（357f，518r）進(jìn)行熒光定量PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增曲線中各稀釋樣品CT值符合稀釋預(yù)期，擴(kuò)增效率為1.96，R2為0.996 7（圖4）。表明方法7提取的桉樹根際土壤DNA不含抑制PCR擴(kuò)增的腐殖酸等雜質(zhì)，能用于分子生態(tài)學(xué)分析，如PCR-DGGE、熒光定量、宏基因組測序等。

3 小結(jié)與討論

土壤微生物群落結(jié)構(gòu)和多樣性及其變化在一定程度上反映土壤生態(tài)系統(tǒng)的穩(wěn)定性，也反映土壤生態(tài)機(jī)制和土壤脅迫對微生物多樣性的影響[17]。從自然環(huán)境中提取基因組DNA檢測不可培養(yǎng)的微生物，跟蹤某些目標(biāo)菌株或重組基因在自然環(huán)境中的行為，從分子生物學(xué)角度研究微生物基因資源的方法是目前土壤微生態(tài)學(xué)研究的重要途徑[18]。然而來自環(huán)境復(fù)雜的成分，尤其是土壤中的腐殖酸類物質(zhì)有類似于核酸的物理化學(xué)性質(zhì)，在DNA提取過程中與DNA共同被萃取，嚴(yán)重影響后續(xù)的PCR擴(kuò)增、雜交、內(nèi)切酶消化等。因此比較幾種不同的土壤DNA提取方法對桉樹根際土壤樣品提取效果，對于在分子水平研究根際土壤微生物多態(tài)性及功能特征具有重要意義。

本試驗中桉樹根際土壤相對于普通田園土壤中存在更多抑制劑成分如腐殖酸、腐殖酸樣物、酚類化合物、桉樹根際分泌物等，它們可通過干擾裂解微生物細(xì)胞裂解、使核酸降解或非特異性吸附DNA、抑制PCR中的聚合酶活性、干擾限制性內(nèi)切酶的消化[19]等方式嚴(yán)重影響PCR擴(kuò)增。王麗娜等[20]利用Martin法提取土壤DNA和高鹽改進(jìn)法提取土壤DNA法提取的DNA污染較嚴(yán)重。本試驗在前人研究的基礎(chǔ)上采用直接提取法，使用了PVPP、硫酸鋁銨和PEG，可有效去除腐殖酸，提高了DNA的得率和質(zhì)量。在提取方法中，對所用試劑的量以及是否加入某些試劑進(jìn)行了多次嘗試，最初所用的提取緩沖液中加入10%PVP，PVP能夠有效地避免酚類物質(zhì)與核酸結(jié)合，但容易使土壤中抑制物過多溶解于提取液中，在后續(xù)試驗中易于共沉淀。基于文獻(xiàn)[21，22]的研究結(jié)果，本試驗采取加入不溶性的PVPP吸附酚類物質(zhì)，硫酸鋁銨作為金屬離子絮凝劑在沉淀抑制劑效果方面明顯，所獲得的DNA純度更高。其DNA得率有部分損失，原因可能是硫酸鋁銨通過絮凝腐殖酸等大分子沉淀雜質(zhì)，在這過程中可能會使部分微生物細(xì)胞沉淀，降低了核酸得率。通過調(diào)整硫酸鋁銨的用量，在細(xì)胞裂解的同時將吸附在PVPP中的腐殖質(zhì)類抑制物從溶液中沉淀清除，降低后續(xù)步驟中共沉淀抑制物的量。沉淀劑的選擇上，采用PEG 8 000比用異丙醇沉淀效果好，電泳可以看出異丙醇共沉淀的雜質(zhì)推高了DNA溶液的紫外吸收值，PEG 8 000沉淀可以明顯降低腐殖酸和其他小分子雜質(zhì)的共沉淀，其紫外測量值更加符合真實情況。

PCR-DGGE分析和熒光定量PCR進(jìn)一步證明在直接提取法中，使用PVPP、硫酸鋁銨聯(lián)用吸附沉淀腐殖酸雜質(zhì)后，采用PEG 8 000沉淀核酸是一種高效的提取土壤微生物DNA的方法。在進(jìn)行大量桉樹土壤DNA提取中，能夠顯著降低試驗成本。

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