香蕉α—1 4—葡聚糖淀粉磷酸化酶基因家族全基因組鑒定與進(jìn)化分析

摘要：為了研究香蕉（Musa nana Lour.）α-1，4-葡聚糖淀粉磷酸化酶（α-1，4-glucan starch phosphorylase，PHS）基因家族的特征和功能，利用生物信息學(xué)方法對(duì)香蕉PHS家族進(jìn)行了全基因組查找、鑒定及相關(guān)分析。結(jié)果表明，在香蕉中共鑒定出2個(gè)成員，MaPHS1的開放閱讀框長度為2 784 bp，編碼927個(gè)氨基酸，分子質(zhì)量為104.8 ku，等電點(diǎn)為6.59；MaPHS2的開放閱讀框長度為2 517 bp，編碼838個(gè)氨基酸，分子質(zhì)量為95.09 ku，等電點(diǎn)為6.09。MaPHS1和MaPHS2分別含有17個(gè)和15個(gè)外顯子；MaPHS1和MaPHS2均含有淀粉磷酸化酶的保守性基序，進(jìn)化過程中比較保守。

關(guān)鍵詞：香蕉（Musa nana Lour.）；α-1，4-葡聚糖淀粉磷酸化酶；生物信息；基因家族；進(jìn)化分析

中圖分類號(hào)：S668.1 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：0439-8114（2016）12-3200-04

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2016.12.051

Abstract： In order to uncover the characteristics and functions of PHS（α-1，4-glucan starch phosphorylase） gene family in banana，the PHS family in banana were searched，identified and analyzed in whole genome level through using the bioinformatics methods. The results showed that two members in banana were identified. The open reading frames of MaPHS1 and MaPHS2 were 2 784 and 2 517 bp in length，coded 927 and 838 amino acids with protein molecular weights were 104.8 and 95.09 ku， pI were 6.59 and 6.09. Intron/exon structure analysis indicated that MaPHS1 contained 17 extons and 16 introns， whereas MaPHS1 contained 15 extons and 14 intron. MaPHS1 and MaPHS2 were contained starch phosphorylase conserved motif，MaPHS were an evolutionarily conserved gene family.

Key words： banana（Musa nana Lour.）； α-1，4-glucan starch phosphorylase； bioinformatics； gene family； phylogeny analyses

淀粉磷酸化酶在高等植物碳水化合物代謝，即淀粉的合成和降解過程中發(fā)揮動(dòng)態(tài)調(diào)節(jié)的作用[1]。淀粉磷酸化酶和糖原磷酸化酶類似，惟一的差異就是淀粉磷酸化酶作用的底物是淀粉而非糖原。植物的α-葡聚糖磷酸化酶通常也被稱為淀粉磷酸化酶（EC 2.4.1.1），通過磷酸化作用分解淀粉。淀粉磷酸化酶由2個(gè)亞基組成，并且每個(gè)亞基都含有高度保守的C-端催化區(qū)域（1個(gè)磷酸吡哆醛位點(diǎn)和1個(gè)影響非催化葡聚糖結(jié)合的“儲(chǔ)存”位點(diǎn)）[2]。淀粉磷酸化酶催化可逆反應(yīng)是淀粉磷酸化酶催化α-1，4-葡聚糖和無機(jī)磷酸鹽轉(zhuǎn)化為葡萄糖-1-磷酸[3，4]。淀粉磷酸化酶廣泛存在高等植物中[5-7]。馬鈴薯[8]、甘薯[9]、木薯[10]、擬南芥[11]、玉米[12]等多種植物中已有報(bào)道。調(diào)查發(fā)現(xiàn)，淀粉磷酸化酶在高等植物中有2種同工酶型，為質(zhì)體形式與胞質(zhì)形式[13]。質(zhì)體形式主要位于葉綠體或造粉體中，分子質(zhì)量大于100 ku；胞質(zhì)形式，分子質(zhì)量約為90 ku[14]。2種不同形式的淀粉磷酸化酶對(duì)葡聚糖的親和性方面存在差異，低親和型為質(zhì)體形式，又稱為Pho-L型；高親和型為外質(zhì)體形式，又稱為Pho-H[15]。2種不同形式的淀粉磷酸化酶的結(jié)構(gòu)不同，且反應(yīng)所需的底物也存在差異。質(zhì)體形式淀粉磷酸化酶Pho-L對(duì)支鏈淀粉具有高度的親和性，而胞質(zhì)形式的淀粉磷酸化酶Pho-H對(duì)支鏈淀粉的親和性很小[16]。

香蕉是熱帶、亞熱帶最為重要水果之一，淀粉的合成與降解是香蕉果實(shí)發(fā)育過程中重要的生理過程，不僅決定著香蕉的產(chǎn)量，同時(shí)也決定著香蕉果實(shí)的品質(zhì)。香蕉果實(shí)中糖積累方式是典型的淀粉轉(zhuǎn)化型，光合產(chǎn)物輸入果實(shí)后，首先轉(zhuǎn)化為淀粉形式積累于果實(shí)中直至成熟，采后后熟過程中淀粉分解轉(zhuǎn)化為可溶性糖。香蕉果實(shí)在發(fā)育過程中碳水化合物主要以淀粉形式存在，未成熟果實(shí)中淀粉含量可達(dá)到20%～25%，后熟過程中淀粉逐漸降解，轉(zhuǎn)化為可溶性糖。香蕉果實(shí)采后后熟過程中，淀粉含量變化很大，從原來的20%下降到軟化時(shí)的1%，與此同時(shí)可溶性糖含量增加，完全水解后，可溶性糖含量突增至15%～20%[17]。

有關(guān)淀粉磷酸化酶的研究對(duì)了解果實(shí)成熟機(jī)理及果實(shí)品質(zhì)的形成具有重要的意義。然而當(dāng)前在基因組水平對(duì)香蕉PHS基因家族鮮有報(bào)到。本研究通過對(duì)香蕉最新測序的全基因組數(shù)據(jù)庫搜索，利用生物信息學(xué)的方法，對(duì)香蕉PHS基因家族進(jìn)行了鑒定與比較分析，通過對(duì)PHS基因家族成員的基本信息分析，為后續(xù)鑒定香蕉PHS蛋白的功能奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 香蕉PHS基因數(shù)據(jù)來源

香蕉PHS基因、蛋白和CDS數(shù)據(jù)來源于Banana Genome Hub數(shù)據(jù)庫（http：//banana-genome.cirad.fr/）的香蕉種小果野蕉全基因組數(shù)據(jù)和Phytozome 10.3（http：//phytozome.jgi.doe.gov/pz/portal.html）；擬南芥PHS蛋白序列來源于Tair（http：//www.arabidopsis.org/index.jsp）；水稻、玉米、高粱PHS數(shù)據(jù)來源于Phytozome 10.3（http：//phytozome.jgi.doe.gov/pz/portal.html）。

1.2 香蕉PHS蛋白生物信息學(xué)分析

香蕉PHS蛋白氨基酸序列基本理化性質(zhì)采用在線軟件ProtParam（http：//expasy.org./tools/protparam.html）分析。二級(jí)結(jié)構(gòu)采用在線SOPMA程序（http：//npsa-pbil.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl？page=npsa_sopmahtml）分析，所有參數(shù)均為默認(rèn)值。利用在線工具GreenPhyl V4分析不同物種中PHS蛋白中的數(shù)量（http：//www.greenphyl.org/cgi-bin/family.cgi？p=idfamily_id=1325#tab-famcomp）。通過NCBI CDD（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi）預(yù)測PHS蛋白的保守結(jié)構(gòu)域。

1.3 香蕉PHS基因結(jié)構(gòu)分析

將從香蕉全基因組數(shù)據(jù)庫得到的香蕉PHS基因序列和cDNA序列， 利用Gene Structure Display Server （http：//gsds.cbi.pku.edu.cn/index.php）分析基因結(jié)構(gòu)。

1.4 香蕉PHS進(jìn)化樹構(gòu)建

將香蕉PHS蛋白和擬南芥、水稻、玉米、高粱蛋白通過Clustalx 1.83軟件進(jìn)行多重序列比對(duì)后采用MEGA6.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。參數(shù)設(shè)置：使用neighbor-joining法則的P-距離（P-distance）模型構(gòu)建，選擇了成對(duì)刪除（paiwise deletion）空位（gap）的選項(xiàng)， Bootstrap method取值1 000。

1.5 香蕉PHS蛋白的結(jié)構(gòu)和保守基序查找與注釋

蛋白的保守基序采用MEME4.0 （http：//meme.nbcr.net/meme/）分析， 基序的最大數(shù)目設(shè)置為10， 基序長度設(shè)為6～200個(gè)氨基酸。對(duì)得到的保守基序運(yùn)用SMART（http：//smart.embl-heidelberg.de/）在線工具進(jìn)行功能注釋。

2 結(jié)果與分析

2.1 香蕉PHS蛋白家族成員的鑒定

根據(jù)香蕉全基因組數(shù)據(jù)庫以及擬南芥、水稻、玉米等其他植物中淀粉磷酸化酶基因序列信息，從香蕉全基因組中鑒定到2個(gè) PHS 淀粉磷酸化酶家族成員（表 1），其登錄號(hào)分別為GSMUA_Achr4G32600_

001和GSMUA_Achr6G33840_001。通過PFAM及 NCBI-CDD工具進(jìn)行蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)分析，2個(gè)香蕉PHS蛋白均含有α-葡聚糖磷酸化酶特征結(jié)構(gòu)域（圖1）。其中，GSMUA_Achr4G32600_001與擬南芥AtPHS1（AT3G29320）同源，命名為MaPHS1；GSMUA_ Achr6G33840_001與擬南芥AtPHS2（AT3G46970）同源，命名為MaPHS2。MaPHS1定位于4號(hào)染色體，基因方向?yàn)榉聪?；該基因全長7 906 bp，開放讀碼框長度2 784 bp，編碼927個(gè)氨基酸；分子質(zhì)量為104.8 ku。MaPHS2定位于6號(hào)染色體，基因方向?yàn)檎?；該基因全長7 888 bp，開放讀碼框長度2 517 bp，編碼838個(gè)氨基酸；分子質(zhì)量為95.09 ku。MaPHS1和MaPHS2的等電點(diǎn)分別為6.59和6.09，偏酸性。不穩(wěn)定指數(shù)分析發(fā)現(xiàn)2個(gè)MaPHS蛋白不穩(wěn)定指數(shù)均大于40，為不穩(wěn)定蛋白。疏水性分析表明，2個(gè)MaPHS蛋白均為親水性蛋白。利用在線工具GreenPhyl V4分析發(fā)現(xiàn)在37個(gè)物種中PHS蛋白的數(shù)量為265個(gè)（圖2）。由保守區(qū)預(yù)測（圖1）顯示，MaPHS具有保守的糖基磷酸化催化區(qū)，由功能區(qū)預(yù)測顯示，MaPHS1和MaPHS2蛋白分別在765～777及675～689處有1個(gè)磷酸吡哆醛結(jié)合位點(diǎn)：EASGTSNMKFA（S）M（L）N。

分析MaPHS蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)（表2）表明，二級(jí)結(jié)構(gòu)均由α-螺旋、擴(kuò)展鏈結(jié)構(gòu)、β-轉(zhuǎn)角和無規(guī)則卷曲4種形式組成，其百分比大小為α-螺旋>無規(guī)則卷曲>擴(kuò)展鏈結(jié)構(gòu)>β-轉(zhuǎn)角。利用Plant-mPLoc對(duì)MaPHS基因家族的蛋白質(zhì)進(jìn)行亞細(xì)胞定位分析發(fā)現(xiàn)均定位于葉綠體中。

2.2 香蕉PHS家族基因結(jié)構(gòu)及系統(tǒng)進(jìn)化分析

利用GSDS軟件構(gòu)建MaPHS基因結(jié)構(gòu)（圖3），MaPHS1由17個(gè)外顯子和16個(gè)內(nèi)含子組成；MaPHS2由15個(gè)外顯子和14個(gè)內(nèi)含子組成。為研究MaP5CS基因系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系，利用雙子葉植物擬南芥和單子葉水稻、玉米、高粱的P5CS蛋白序列為參考，利用MEGA軟件對(duì)香蕉基因組中的PHS蛋白采用鄰接法繪制系統(tǒng)進(jìn)化樹，結(jié)果如圖4所示。

2.3 PHS蛋白的結(jié)構(gòu)和保守基序分析

通過MEME軟件預(yù)測PHS蛋白結(jié)構(gòu)結(jié)果如圖5所示。利用SMART軟件對(duì)預(yù)測的保守基序進(jìn)行命名結(jié)果見表3所示。結(jié)果表明，香蕉PHS蛋白均含有8個(gè)基序（基序1～7，9），不包含基序8和10。AtPHS1含有9個(gè)基序，相比PHS2多了基序8，長度為80個(gè)氨基酸。進(jìn)一步通過SMART在線工具對(duì)基序命名，基序1～7為磷酸化酶保守結(jié)構(gòu)域。

3 小結(jié)與討論

淀粉磷酸化酶在淀粉代謝發(fā)揮重要的作用，其有2種不同的類型，即PHS1和PHS2[13]，根據(jù)對(duì)糖原親和程度不同分為低親和型與高親和型，PHS1為低親和型，PHS2為高親和型[15]。PHS在模式植物擬南芥和禾本科植物中高度保守，大多為2個(gè)PHS蛋白。袁亞芳[4]對(duì)水稻額淀粉磷酸化酶進(jìn)行了較為深入的研究，分析了2個(gè)不同類型PHS基因的表達(dá)特性，并通過基因工程手段將該基因?qū)胫仓牦w內(nèi)，從而改良稻米品質(zhì)。劉世才[18]在鹽藻中克隆了PHS1，并進(jìn)行了系統(tǒng)的生物信息學(xué)分析。

淀粉是香蕉果實(shí)中的主要成分，在香蕉采后果實(shí)品質(zhì)形成過程中，淀粉大量水解轉(zhuǎn)化為可溶性糖，在達(dá)到最佳食用期時(shí)果實(shí)淀粉含量只有1%。正是由于香蕉果實(shí)采后成熟過程中淀粉的降解轉(zhuǎn)化使得果實(shí)具有獨(dú)特的口感、適宜的硬度及豐富的營養(yǎng)[19]。而淀粉磷酸化酶在淀粉降解過程中發(fā)揮著重要的作用[20]，研究淀粉磷酸化酶的功能對(duì)了解果實(shí)發(fā)育成熟機(jī)理和果實(shí)品質(zhì)形成具有重要的意義。

本研究對(duì)香蕉PHS基因家族進(jìn)行了初步分析， 為深入研究該基因家族的表達(dá)調(diào)控、結(jié)構(gòu)和功能等提供參考數(shù)據(jù)，通過調(diào)控其表達(dá)來達(dá)到提高香蕉果實(shí)成熟中淀粉降解轉(zhuǎn)化為可溶性糖的能力，進(jìn)一步提高香蕉果實(shí)的品質(zhì)。

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