湖北野生桑黃分離鑒定及培養(yǎng)研究

摘要：采用子實體組織分離法對桑黃（Inonotus sanghuang）進行分離，采用內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)序列分析對樣品進行分子鑒定。用桑葉提取物對桑黃進行培養(yǎng)。結(jié)果表明，不同濃度桑葉提取物對桑黃生長存在不同程度的影響，最佳添加濃度為0.5%。在基礎(chǔ)PDA培養(yǎng)基中添加0.5%桑葉提取物，桑黃生長速度為3.5 mm/d，與基礎(chǔ)PDA培養(yǎng)基存在極顯著差異。液體培養(yǎng)，菌絲體生物量達到11.7 g/L。桑葉提取物對桑黃菌絲體生長具有一定的促進作用。

關(guān)鍵詞：桑黃（Inonotus sanghuang）；桑葉提取物；生長速度；液體培養(yǎng)

中圖分類號：S567.3+9；S646.1+9 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2016）12-3154-03

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2016.12.037

Abstract： Inonotus sanghuang was isolated by sub entity organization isolation method. It was identified by sequence analysis method of internal transcribed sequence and cultured with mulberry leaf extract. The results showed its growth was affected by different concentrations of mulberry leaves extract， and the best adding concentration was 0.5%. Based on conventional solid medium， which was added 0.5% mulberry leaf extract， its growth rate was 3.5 mm/d. There was a very significant difference between the control group and the control group. The biomass of mycelium was 11.7 g/L， and the liquid medium was used. Mulberry leaf extract has a certain role in promoting the growth of Inonotus sanghuang.

Key words： Inonotus sanghuang； mulberry leaf extract； growth rate； liquid culture

桑黃（Inonotus sanghuang）俗稱桑臣、桑耳或胡孫眼等，是寄生于桑樹等闊葉樹上的一種多年生珍貴藥用真菌，《神農(nóng)本草經(jīng)》、《本草綱目》等均有記載，有“森林黃金”的美稱。桑黃含有多種活性物質(zhì)，如多糖、黃酮和三萜類物質(zhì)。研究顯示，桑黃多糖能促使腫瘤細胞自我毀滅，防止腫瘤細胞附著于體內(nèi)并抑制轉(zhuǎn)移，抑制率達96.78%，是國際公認的最有效的抗癌真菌，其突出的抗腫瘤功效在日韓等國備受關(guān)注，具有極大的藥用價值和開發(fā)潛力[1]。不同樹種桑黃活性物質(zhì)含量差異較大，以桑樹桑黃含量最高[2-4]。

中國野生桑黃主要分布在東北、華北、西北及四川、云南等地。本課題組首次在湖北省內(nèi)采集到野生桑樹桑黃，對其進行分離鑒定，研究桑葉提取物對桑黃生長的影響，為下一步人工栽培研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

野生桑樹桑黃由本課題組于2015年4月從湖北西部山區(qū)桑樹上采集得到，系湖北省內(nèi)首次發(fā)現(xiàn)。桑葉提取物（MLE）：取鮮桑葉，60 ℃烘干，取烘干桑葉500 g，加1 500 mL沸水浸提30 min，過濾，濃縮烘干提取液，得MLE。馬鈴薯葡萄糖（PDA）培養(yǎng)基：馬鈴薯200 g，去皮切丁，沸水煮20 min，取濾液，加葡萄糖20 g，加熱溶解，補足水1 000 mL，pH自然。葡萄糖蛋白胨培養(yǎng)基：葡萄糖20 g，蛋白胨5 g，水 1 000 mL，pH自然。MLE培養(yǎng)基：取一定量MLE，加水加熱溶解，pH自然。PDA-MLE培養(yǎng)基：取PDA培養(yǎng)基，加入一定量MLE，加熱溶解，pH自然。

1.2 儀器與試劑

Thermo Sorvall Biofuge Primo R型高速冷凍離心機（美國Thermo公司）；TaKaRa TP600型PCR儀（日本TaKaRa公司）；Applied Biosystems 3730-XL型測序儀（美國Applied Biosystems公司）；Tanon 2500型凝膠成像系統(tǒng)（上海天能科技有限公司）；FD-1A-50型冷凍干燥機（北京博醫(yī)康實驗儀器公司）；AUW220D型電子天平（日本島津公司）。

AxyPrep基因組DNA小量制備試劑盒AP-MN-BT-GDNA-50（美國Axygen公司）；DNA凝膠回收試劑盒（美國Axygen公司）；Taq DNA聚合酶（上海桑尼生物科技有限公司）；DNA Marker（日本TaKaRa公司）；葡萄糖、蛋白胨、瓊脂均為國產(chǎn)分析純。

1.3 方法

1.3.1 桑黃菌種的分離 取子實體內(nèi)部生長點，接種至PDA平板培養(yǎng)基，分離母種，28 ℃培養(yǎng)。取乳黃色菌絲轉(zhuǎn)接至PDA斜面培養(yǎng)基，28 ℃培養(yǎng)至菌絲滿管，置4 ℃保存。

1.3.2 桑黃菌種的鑒定 取分離菌種，提取基因組DNA，進行PCR擴增，采用內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)序列（ITS）分別對樣品進行分子鑒定。提取基因組DNA，進行PCR擴增。引物設(shè)計，ITS1：TCCGTAGGTGAACCTGCGC，ITS4：TCCTCCGCTTATTGATATGC。PCR產(chǎn)物用DNA凝膠回收試劑盒回收。取純化后的PCR產(chǎn)物，使用測序儀進行DNA測序[5-7]。

1.3.3 桑黃生長測定 取母種，接種至平板或斜面培養(yǎng)基，28 ℃培養(yǎng)，觀察記錄菌絲生長速度和濃密程度。菌絲生長速度=（菌落的直徑-菌種塊直徑）/2/菌落生長的時間。取母種，接種至液體培養(yǎng)基，250 mL三角瓶裝液量100 mL，28 ℃，160 r/min，培養(yǎng)21 d。發(fā)酵液5 000 r/min離心后收集菌絲體，用水清洗3次，冷凍干燥后稱重得菌絲體生物量[8，9]。

數(shù)據(jù)處理采用SAS 9.0軟件進行統(tǒng)計分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 野生桑黃菌種的鑒定

桑黃原基呈檸檬黃或嫩黃色，子實體較大，菌蓋表面黃棕色至棕色，多年生老熟子實體菌蓋呈棕褐色，無菌柄，菌蓋木質(zhì)化，具有反復(fù)生長停頓形成的年輪狀結(jié)構(gòu)，呈扇形、馬蹄形等。本研究中的野生桑黃采自40年左右老桑樹根部，14 cm×12 cm，重220 g。經(jīng)分離純化后，得到菌種母種（圖1）。采用測序儀對純化后的PCR產(chǎn)物進行DNA測序，結(jié)果為：A。經(jīng)美國國立生物技術(shù)信息中心（NCBI）數(shù)據(jù)庫比對，與菌種FS656161相似度為99%，命名為Inonotus linteus，與裂蹄木層孔菌（Phellinus linteus）為同種異名[10]。桑黃及相似種類大多演化出與其寄主樹木的專一性。世界上廣泛誤認為桑黃的學(xué)名為Phellinus linteus（現(xiàn)稱Inonotus linteus），實際上此類桑黃分布于熱帶美洲和非洲，不在東亞地區(qū)，不長在桑樹上。結(jié)合寄生數(shù)種、形態(tài)特征與分子鑒定，確定桑黃是分布于中、日、韓，僅生長于桑屬（Marus）植物上的新種，學(xué)名應(yīng)為Inonotus sanghuang，區(qū)別于Phellinus igniarius（火木層孔菌）、Phellinus linteus（裂蹄木層孔菌，現(xiàn)稱Inonotus linteus）、Phellinus baumii（鮑氏針層孔菌，現(xiàn)稱Inonotus baumii）、Phellinus vaninii（瓦尼針層孔菌，現(xiàn)稱Inonotus vaninii）[11，12]。

2.2 桑葉提取物對桑黃生長的影響

2.2.1 MLE濃度對桑黃菌絲體生長的影響 采用不同濃度MLE、葡萄糖斜面培養(yǎng)基培養(yǎng)桑黃（表1）。不同濃度MLE對桑黃生長存在不同程度的影響，最佳添加濃度為0.5%，高于0.5%對桑黃生長存在抑制作用。不同濃度MLE培養(yǎng)基中添加2%葡萄糖可增加菌絲濃密程度。0.5% MLE組與2%葡萄糖-0.5% MLE組生長速度均為2.4 mm/d，沒有顯著差異，后者比前者菌絲濃密。

采用基礎(chǔ)PDA培養(yǎng)基添加不同濃度MLE培養(yǎng)桑黃的結(jié)果見表2。由表2可知，MLE對桑黃生長有一定的促進作用，基礎(chǔ)PDA培養(yǎng)基添加0.5% MLE，桑黃生長速度為3.5 mm/d，與基礎(chǔ)PDA培養(yǎng)基組存在極顯著差異。添加量高于0.5%對桑黃生長存在抑制作用。

2.2.2 桑葉提取物對桑黃生物量的影響 不同液體培養(yǎng)基培養(yǎng)桑黃生物量見表3。采用PDA培養(yǎng)基，菌絲體生物量為9.5 g/L，添加0.5%MLE，菌絲體生物量達到11.7 g/L。采用葡萄糖蛋白胨培養(yǎng)基，菌絲體生物量為5.9 g/L，添加0.5%MLE，菌絲體生物量達到10.6 g/L。由此可見，在常規(guī)培養(yǎng)基中添加MLE，對桑黃菌絲體生長具有一定的促進作用。

3 小結(jié)與討論

桑葉是家蠶的主要飼料，含有粗蛋白、可溶性碳水化合物、維生素、多酚類物質(zhì)、黃酮類物質(zhì)、礦物質(zhì)、生物堿、植物纖維等多種營養(yǎng)與生物活性成分，在藥品和食品保健產(chǎn)業(yè)化開發(fā)方面有著廣闊的前景。桑黃作為珍貴的藥用真菌，已得到廣泛認可，但由于桑黃生長需要較為特殊的自然氣候環(huán)境，且生長期長，因而天然桑黃數(shù)量非常稀少。在湖北首次發(fā)現(xiàn)野生桑樹桑黃，為進一步科學(xué)研究奠定了基礎(chǔ)。經(jīng)分離鑒定，結(jié)合文獻資料，判定該野生桑樹桑黃學(xué)名為Inonotus sanghuang[11，12]。

研究表明，不同濃度MLE對桑黃生長存在不同程度的影響，最佳添加濃度為0.5%。MLE培養(yǎng)基中添加2%葡萄糖可增加菌絲濃密。基礎(chǔ)PDA培養(yǎng)基中添加0.5%MLE，桑黃生長速度為3.5 mm/d，與基礎(chǔ)PDA培養(yǎng)基組存在極顯著差異。采用PDA培養(yǎng)基，添加0.5%MLE，菌絲體生物量達到11.7 g/L。由此可見，在常規(guī)培養(yǎng)基中添加0.5%MLE，對桑黃菌絲體生長具有一定的促進作用，且菌絲體顏色較深，其中原因有待進一步研究。MLE對桑黃菌絲體的生長具有促進作用，對下一步桑黃人工栽培研究具有重要意義。

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