不同濃度H2對NaCl脅迫下甘薯苗生理指標(biāo)的影響

摘要：以徐薯28為材料，采用水培法，研究了不同濃度（0、10%、25%、50%、75%、100%）氫氣（H2）對NaCl脅迫下的甘薯[Dioscorea esculenta （Lour.） Burkill]葉片相對含水量、相對電導(dǎo)率、葉綠體色素含量、丙二醛（MDA）含量的影響。結(jié)果表明，200 mmol/L NaCl脅迫下添加不同濃度的H2后甘薯葉片的相對含水量、葉綠素含量均比僅用NaCl處理組的高，其中50%H2+NaCl和75%H2+NaCl處理組的葉片相對含水量顯著升高，75%H2+NaCl處理組的葉綠素含量與僅用NaCl處理組相比顯著升高；葉片的相對電導(dǎo)率值和MDA含量均比僅用NaCl處理組的低，其中50%H2+NaCl和75%H2+NaCl處理組的相對電導(dǎo)率和MDA含量顯著降低。選取最佳H2濃度（75%），研究200 mmol/L NaCl脅迫下徐薯28的MDA含量和POD活性。結(jié)果表明，9 d內(nèi)，200 mmol/L NaCl脅迫下添加H2后MDA含量顯著低于僅用NaCl處理組；POD活性先升高后降低，并顯著高于僅用NaCl處理組的POD活性。這表明外源H2的加入在一定程度上緩解了鹽脅迫對徐薯28的傷害。

關(guān)鍵詞：甘薯[Dioscorea esculenta （Lour.） Burkill]；H2；鹽脅迫；生理指標(biāo)

中圖分類號：S531；Q945.78 文獻標(biāo)識碼：A 文章編號：0439-8114（2016）12-3013-05

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2016.12.007

Abstract： The effect of different concentration（0，10%，25%，50%，75%，100%） of hydrogen-rich water（HRW） on relative water content， relative electrolytic leakage， chlorophyll content and membrane lipid peroxidation in sweet potato[Dioscorea esculenta （Lour.） Burkill] （Xushu28 cultivar） seedling leaves under salt stress were studied by the water culture method. The results showed that relative water content and the content of chlorophyll of the leaves treated with different concentration of HRW under 200 mmol/L NaCl stress were higher that of the leaves treated under only 200 mmol/L NaCl stress，the leaves treated with 50% and 70% saturation of HRW under 200 mmol/L NaCl stress led to a significant increase of relative water content，the chlorophyll content in leaves treated with 75%saturation of HRW and 200 mmol/L NaCl led to a significant increase. The relative electrolytic leakage and malonaldehyde content of leaves treated with HRW under 200 mmol/L NaCl stress were lower than that of the leaves treated under only 200 mmol/L NaCl； and the relative electrolytic leakage and malonaldehyde content of the leaves treated with 50% and 75% saturation of HRW under 200 mmol/L NaCl significantly decreased. The effect of optimum concentration（75%）of hydrogen-rich water（HRW） on membrane lipid peroxidation and POD activity in sweet potato（Xushu28 cultivar） seedling leaves under salt stress were studied by the water culture. The results showed that the malonaldehyde content of leaves treated with HRW under 200 mmol/L NaCl stress were significant lower than that of the leaves treated with only 200 mmol/L NaCl during the treatment；the activities of POD tend to increase firstly and then decrease， and the POD activity of leaves treated with HRW under 200 mmol/L NaCl stress were significant higher than that of the leaves treated with only 200 mmol/L NaCl. The results indicates that the addition of exogenous hydrogen to some extent could alleviate the salt stress of the sweet potato （Xushu 28）.

Key words： Dioscorea esculenta （Lour.） Burkill；hydrogen；salt stress；physiological index

由于自然因素、氣候因素、地形因素及人類活動等一系列因素的影響，導(dǎo)致土壤鹽堿化和次生鹽堿化問題越來越嚴(yán)重。土壤鹽堿化的問題已經(jīng)制約農(nóng)業(yè)經(jīng)濟的可持續(xù)發(fā)展。據(jù)不完全統(tǒng)計，世界鹽堿化土壤面積達9.54億hm2[1]。中國鹽堿化土壤面積很廣，約3 000萬hm2，其中超過2 000萬hm2等待開發(fā)利用。鹽堿土地會對植物造成傷害，主要表現(xiàn)在兩方面，一是鹽脅迫引起植物生理干旱，另一個是鹽脅迫引起植物體離子毒害[2]。同時還會抑制植物生長，嚴(yán)重時會造成植物死亡。

甘薯[Dioscorea esculenta （Lour.） Burkill]是一種多年生草本植物，屬于塊根糧食。在世界上，甘薯是重要的糧食作物和工業(yè)原料作物。中國是世界上最大的甘薯生產(chǎn)國，每年甘薯的種植面積約達600萬hm2[3]。甘薯具有豐富的營養(yǎng)成分，如蛋白質(zhì)、氨基酸、維生素等，同時也非常高的藥用價值，對于抗癌、抗氧化，穩(wěn)定膽固醇和血糖等都具有很好的功效[4]。雖然甘薯的適應(yīng)能力強，產(chǎn)量高，但是長期或者高濃度鹽堿脅迫會抑制甘薯的正常生長，甚至造成植株死亡，嚴(yán)重影響甘薯的產(chǎn)量。因此，緩解甘薯的鹽脅迫，提高甘薯對高鹽環(huán)境的適應(yīng)力，對于增加甘薯產(chǎn)量具有非常重要的意義。研究發(fā)現(xiàn)，氫氣在生物醫(yī)學(xué)上發(fā)揮著重大的作用[5-7]，而氫氣在植物學(xué)方面也有人研究[8，9]，其中有研究表明，H2可以有效緩解鎘脅迫對苜蓿植株的傷害[8]。本研究以徐薯28為材料，探討在NaCl脅迫下加入不同濃度外源H2后甘薯葉片的相對含水量、相對電導(dǎo)率、葉綠素含量、丙二醛（MDA）含量和POD活性的變化，旨在為甘薯的抗鹽栽培和耐鹽育種提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

以徐薯28為試驗材料，2014年4月將薯塊種于苗床，約2周薯塊發(fā)芽，再在苗床上培養(yǎng)2周左右，將甘薯幼苗移栽到盆中培養(yǎng)，待甘薯幼苗枝葉茂盛，采其莖葉作為試驗材料。

1.2 方法

選取長勢基本一致，長勢較好的植株，用去離子水洗凈后，置于1/4霍格蘭營養(yǎng)液中培養(yǎng)。待植株正常發(fā)根后，分12組，一組用1/4霍格蘭營養(yǎng)液（CK）培養(yǎng)，其他組用分別含有200 mmol/L NaCl、10%H2、25%H2、50%H2、75%H2、100%H2、10%H2+200 mmol/L NaCl、25%H2+200 mmol/L NaCl、50%H2+200 mmol/L NaCl、75%H2+200 mmol/L NaCl、100%H2+200 mmol/L NaCl的霍格蘭培養(yǎng)液處理幼苗（每天更換一次營養(yǎng)液），置于光照培養(yǎng)箱中24 ℃/20 ℃（晝/夜）、12 h/12 h（光/暗）條件下進行培養(yǎng)。待脅迫達到各自終濃度3 d后，選取植株倒數(shù)3～6片葉進行生理指標(biāo)測定，每組重復(fù)3次。

為了進一步證明H2可以緩解鹽脅迫對徐薯28的傷害，選取最佳H2濃度（75%），分4組處理，即CK、T1（75%H2）、T2（200 mmol/L NaCl）、T3（75%H2+200 mmol/L NaCl），按上述方法取材培養(yǎng)，測定脅迫9 d內(nèi)生理指標(biāo)的變化，每組重復(fù)3次。

H2水溶液的制備方法如下：利用H2發(fā)生裝置電解堿液，釋放出H2，通過過濾器以300 mL/min的速度向200 mL霍格蘭營養(yǎng)液中注入H2，約30 min達到100%H2飽和水溶液。然后將100%H2飽和水溶液稀釋為10%、25%、50%、75%濃度的H2水溶液。

葉片相對含水量采用植物組織鮮重法[10]測定；用相對電導(dǎo)率表示細胞質(zhì)膜透性，采用DDS-11A型數(shù)顯電導(dǎo)率儀測定[10]；葉綠體色素含量采用分光光度計法測定[11]；MDA含量采用硫代巴比妥酸（TBA）法測定[12]；POD活性采用愈創(chuàng)木酚法測定[12]。每項指標(biāo)測定均重復(fù)取材3次，取平均值。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

采用Excel 2013軟件作圖，應(yīng)用SPSS 16.0軟件進行數(shù)據(jù)方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同濃度H2對NaCl脅迫下甘薯葉片相對含水量的影響

由圖1可知，鹽脅迫3 d后，與CK組（H2和NaCl都不加的對照組，下同）相比，各加鹽處理組的葉片含水量呈現(xiàn)不同程度的降低。200 mmol/L NaCl溶液中加入不同濃度H2后，與僅用200 mmol/L NaCl處理組相比，其葉片含水量均呈現(xiàn)不同程度的增加，其中50%H2+NaCl和75%H2+NaCl處理組的葉片含水量顯著升高（P<0.05），分別提高了3.5%和5.3%。另外，僅用H2處理組中，50%H2處理的葉片相對含水量最高。這說明外源H2可使鹽脅迫下甘薯徐薯28葉片的保水能力增強，增強了其對鹽環(huán)境的適應(yīng)能力。

2.2 不同濃度H2對NaCl脅迫下甘薯葉片質(zhì)膜透性的影響

鹽脅迫直接影響植物細胞的膜脂，增加脂膜透性，使細胞膜的選擇性功能減弱，導(dǎo)致電解質(zhì)和某些有機物質(zhì)外滲，破壞細胞物質(zhì)交換平衡，從而使葉片的相對電導(dǎo)率增大[13]。相對電導(dǎo)率越大說明植物受的脅迫越嚴(yán)重，抗逆性越弱。由圖2可見，鹽脅迫3 d后，與CK組相比，各加鹽處理組的葉片相對電導(dǎo)率呈現(xiàn)不同程度的增加。200 mmol/L NaCl溶液中加入不同濃度H2后，與僅用200 mmol/L NaCl處理組相比，葉片相對電導(dǎo)率都有不同程度的降低，其中加入50%H2和75%H2處理組的葉片相對電導(dǎo)率分別降低了19%和23%（P<0.05）。這說明外源H2的加入，在一定程度上減小了鹽脅迫對甘薯葉片細胞膜的傷害。與CK相比，單獨H2處理可使葉片相對電導(dǎo)率稍有上升，但差異不顯著。

2.3 不同濃度H2對NaCl脅迫下甘薯葉片葉綠素含量的影響

鹽脅迫會使植物葉片中葉綠素含量降低，可能是因為鹽脅迫增強了葉綠素酶活性，將葉綠素分解；也可能是由于鹽脅迫導(dǎo)致葉綠素和葉綠體蛋白之間的結(jié)合松弛，而破壞了更多的葉綠素[14]。由圖3可見，鹽脅迫3 d后，與CK組相比，各加鹽處理組的葉片葉綠素含量呈現(xiàn)不同程度的降低。200 mmol/L NaCl培養(yǎng)液中加不同濃度H2后，與僅用200 mmol/L NaCl處理組相比，各處理組的葉綠素含量均有所增加，其中50%H2處理組的葉片葉綠素含量增加了17.1%，75%H2處理組增加了39.7%，差異達到顯著水平（P<0.05）。這說明外源H2可降低鹽脅迫下甘薯葉片中葉綠素的降解或者減少了鹽脅迫對甘薯葉片中葉綠素的傷害。單獨H2處理也可使甘薯葉片中葉綠素含量有所提高，但增加并不明顯，其中75%H2處理組的葉綠素含量提高較為明顯，但與CK組相比仍不顯著。

2.4 不同濃度H2對NaCl脅迫下甘薯葉片MDA含量的影響

MDA是細胞膜脂過氧化作用的產(chǎn)物之一，其含量的高低代表細胞膜脂過氧化的程度，可間接反映植物組織抗氧化能力的大小。由圖4可知，鹽脅迫3 d后，與CK組相比，各加鹽處理組的葉片MDA含量呈現(xiàn)不同程度的增加。200 mmol/L NaCl培養(yǎng)液中加入H2后，與僅用200 mmol/L NaCl處理組相比，葉片的MDA含量有所降低，其中50%H2和75%H2的MDA含量分別降低了12.2%和13.1%（P<0.05）。這說明外源H2的加入降低了葉片MDA的含量，緩解了細胞膜脂過氧化的程度。單獨用H2處理的甘薯葉片中MDA含量也有所升高，但不明顯，其中75%H2處理組升高幅度最小。

2.5 75%H2對NaCl脅迫下甘薯葉片MDA含量的影響

由圖5可知，在9 d內(nèi)CK的MDA含量處于較穩(wěn)定的狀態(tài)，T1和CK相比無明顯變化，T2、T3與CK相比MDA含量上升趨勢較明顯。脅迫第3天，T2與CK相比MDA含量提高了0.58倍，差異達到極顯著水平（P<0.01），T3組與CK組相比MDA含量提高了0.30倍，差異達到顯著水平（P<0.05）；T3的MDA含量顯著低于T2（P<0.05）。在脅迫第6天，T2與CK相比MDA含量提高了1.2倍，差異達到極顯著水平（P<0.01），T3與CK相比MDA含量提高了0.69倍，差異達到顯著水平（P<0.05）；T3的MDA含量顯著低于T2（P<0.05）。脅迫第9天，T3的MDA含量急劇上升，T2、T3與CK相比，MDA含量差異均達到極顯著水平（P<0.01），T3組MDA含量仍低于T2組，無顯著性差異。

2.6 75%H2對NaCl脅迫下甘薯葉片POD活性的影響

在植物逆境脅迫下，POD是一種重要的適應(yīng)性酶，可以防御植物細胞膜過氧化和降低細胞受損害的程度。由圖6可知，在處理9 d內(nèi)，CK和T1的POD酶活性比較穩(wěn)定，兩組無明顯差異，而T2、T3的POD酶活性均呈現(xiàn)出先升高再降低的趨勢。處理第3天，T2和T3的POD酶活性較CK分別升高了1.34和2.57倍，差異達到極顯著水平（P<0.01）；T3的POD酶活性極顯著高于T2（P<0.01）。處理第6天，T2、T3的POD酶活性達到峰值，較CK分別提高了3.08和4.63倍，差異達到極顯著水平（P<0.01）；T3的POD酶活性顯著高于T2組（P<0.05）。處理第9天，T2、T3的POD酶活性降低，分別為CK的1.77和2.01倍，T3的POD酶活性仍高于T2。

3 小結(jié)與討論

鹽脅迫會對植株造成滲透脅迫和離子毒害兩方面的傷害。滲透脅迫是指土壤溶液中的滲透勢大于植株細胞內(nèi)的滲透勢時，植株細胞不能正常吸水而枯死[15]。本試驗結(jié)果表明，200 mmol/L NaCl脅迫處理3 d后，徐薯28的葉片相對含水量降低，影響了植株的正常吸水，導(dǎo)致植株滲透脅迫，對徐薯28造成了顯著傷害。而外源H2的加入對鹽脅迫下的徐薯28有明顯的保護作用，特別是75%H2和50%H2顯著提高了葉片相對含水量，減少了植株水分的散失。這說明外源H2可以使甘薯的保水能力增強，使細胞代謝在鹽脅迫下仍可在適宜的水分條件下進行，其中75%和50%濃度的H2處理效果較好。

逆境環(huán)境下，植物體內(nèi)會發(fā)生各種生理變化，以提高植株的抗逆能力。細胞膜是活細胞與外界環(huán)境進行物質(zhì)、信息和能量交換的屏障，可以維持細胞內(nèi)環(huán)境的相對穩(wěn)定，而逆境脅迫首先會對細胞膜造成影響，細胞質(zhì)膜結(jié)構(gòu)和功能的紊亂以及膜透性的變化是逆境脅迫作用的關(guān)鍵所在[16]。鹽脅迫會破壞植物細胞膜透性，影響細胞正常的生理代謝[17]。細胞質(zhì)膜透性的大小與植物的抗鹽能力呈一定的負相關(guān)，細胞膜透性越大，相對電導(dǎo)率越大，植物受傷害程度就越大；反之，植物受脅迫的程度就越小。本研究結(jié)果表明，200 mmol/L NaCl脅迫時，徐薯28葉片的相對電導(dǎo)率增加，H2加入后，相對電導(dǎo)率降低，說明外源H2的加入降低了細胞膜受傷害的程度，在一定程度上緩解了鹽脅迫對徐薯28的傷害。特別是鹽脅迫下加入75%H2和50%H2，顯著降低了徐薯28的相對電導(dǎo)率，表明75%H2和50%H2能顯著緩解鹽脅迫對徐薯28的傷害，其中75%H2的緩解效果比50%H2更好。

葉綠素是植物進行光合作用的重要色素，其功能是捕獲光能和驅(qū)動電子轉(zhuǎn)移到反應(yīng)中心[18]。植物葉綠素代謝處在一個相對平衡的狀態(tài)，鹽脅迫條件下，葉綠素代謝平衡被破壞，葉綠素含量下降，光合作用受到影響。因為NaCl可以提高葉綠素酶的活性，促進葉綠素的分解，進而影響葉綠體的發(fā)育以及光合作用中光能的轉(zhuǎn)換和吸收；而且NaCl可以導(dǎo)致葉綠體數(shù)目減少、基粒模糊消失、基粒層斷裂并能降低基質(zhì)區(qū)的電子密度[19]。本研究中，200 mmol/L NaCl脅迫條件下，徐薯28葉片的葉綠素含量降低，加入H2后，葉綠素含量降低幅度變小，特別是加入75%H2后，葉綠素含量有顯著性提高，這說明外源H2可以減小鹽脅迫對徐薯28葉片光合作用的影響，提高了徐薯28的耐鹽性。與CK相比，單獨用H2處理對徐薯28葉片的葉綠素含量無明顯影響。

鹽脅迫環(huán)境下，MDA是細胞膜脂過氧化的產(chǎn)物之一，MDA含量的高低代表細胞膜脂過氧化的程度[20]，其含量越高，說明細胞膜脂過氧化程度越高，植物受到的傷害越大；反之，植物受到的傷害越小。MDA也可以間接地反映植物組織抗氧化的能力。本研究結(jié)果表明，200 mmol/L NaCl脅迫下，徐薯28葉片的MDA含量升高，75%H2和50%H2的加入使MDA含量呈現(xiàn)顯著性降低，這表明外源H2的加入可以緩解鹽脅迫對徐薯28葉片細胞質(zhì)膜的傷害，提高了徐薯28的耐鹽性。其中鹽脅迫條件下，75%H2和50%H2的加入緩解效果較好。這與H2緩解汞脅迫對苜蓿的質(zhì)膜傷害結(jié)果類似[21]。選取加入75%H2，200 mmol/L NaCl處理徐薯28，在脅迫第3天和第6天，75%H2+200 mmol/L NaCl處理組的MDA含量均顯著低于200 mmol/L NaCl處理組，更加進一步的說明外源氫氣的加入可以緩解鹽脅迫下徐薯28葉片細胞質(zhì)膜脂過氧化的程度。

逆境脅迫下，植物體內(nèi)會產(chǎn)生大量的活性氧，當(dāng)活性氧積累到一定程度時，會對植物造成氧化傷害。植物體自身的抗氧化酶（如POD、SOD、APX以及其他的抗氧化酶）可以有效降低活性氧的積累，緩解氧化脅迫[21]。植物遭受逆境脅迫時，過氧化物酶（POD）活性升高，以過氧化氫為電子受體催化底物氧化，在代謝中調(diào)控IAA水平，有效清除植物體內(nèi)的過氧化氫，降低活性氧的積累，緩解植物逆境脅迫。200 mmol/L NaCl脅迫條件下，T3和T2的POD酶活性均呈現(xiàn)先上升后下降的狀態(tài)。在脅迫第3天，T3的POD酶活極顯著高于T2（P<0.01），提高了徐薯28的抗氧化性。在脅迫第6天，T3的POD酶活性仍顯著高于T2（P<0.05），繼續(xù)增加徐薯28的耐鹽性。在脅迫第9天，T2、T3的POD酶活性均呈現(xiàn)下降趨勢，但T3的POD酶活性仍高于T2。表明200 mmol/L NaCl脅迫條件下，外源H2的加入可以顯著提高徐薯28的POD酶活性，特別是在脅迫前期，顯著提高了徐薯28的抗鹽能力，這對于維持細胞的正常生理功能及生長代謝起了重要作用。

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