小麥航天誘變抗條銹病突變體的篩選與鑒定

呂興娜,杜久元,蘇萍萍,王琪琳,吳建輝,黃麗麗,康振生,韓德俊

(1.西北農(nóng)林科技大學(xué)旱區(qū)作物逆境生物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，陜西楊凌 712100； 2.西北農(nóng)林科技大學(xué)農(nóng)學(xué)院，陜西楊凌 712100； 3.甘肅省農(nóng)科院小麥研究所，甘肅蘭州 730070； 4.西北農(nóng)林科技大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院，陜西楊凌 712100)

小麥航天誘變抗條銹病突變體的篩選與鑒定

呂興娜1,2,杜久元3,蘇萍萍1,2,王琪琳1,4,吳建輝1,4,黃麗麗1,4,康振生1,4,韓德俊1,2

(1.西北農(nóng)林科技大學(xué)旱區(qū)作物逆境生物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，陜西楊凌 712100； 2.西北農(nóng)林科技大學(xué)農(nóng)學(xué)院，陜西楊凌 712100； 3.甘肅省農(nóng)科院小麥研究所，甘肅蘭州 730070； 4.西北農(nóng)林科技大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院，陜西楊凌 712100)

航天誘變后代遺傳變異評(píng)價(jià)和表型鑒定對(duì)航天誘變育種材料的篩選具有重要意義。為了從小麥品種蘭天15和鄭麥9023的航天誘變后代中篩選出抗條銹病突變體，采用21對(duì)核心引物對(duì)其航天誘變后代與親本的遺傳相似性進(jìn)行評(píng)估，用條銹菌菌株CYR32、CYR33和V26/G22對(duì)航天誘變后代進(jìn)行苗期和成株期抗病性鑒定。結(jié)果表明，蘭天15的航天誘變衍生系與親本間差異標(biāo)記數(shù)量較多，且抗條銹性和芒的有無(wú)等性狀發(fā)生了遺傳分離，推測(cè)可能存在異花授粉導(dǎo)致的遺傳重組；鄭麥9023的航天誘變衍生系與親本差異標(biāo)記數(shù)量均不超過(guò)2個(gè)，且苗期抗病性等絕大部分性狀均與親本相同，僅成株期抗病性較其親本有明顯提高，推測(cè)成株期抗病性變異可能來(lái)自航天誘變。結(jié)果表明，鄭麥9023部分具有成株期抗病性的優(yōu)良選系，可用于小麥抗條銹育種。

小麥；航天誘變；條銹病抗性突變體；遺傳相似性

由條型柄銹菌小麥專(zhuān)化型(Pucciniastriiformisf.sp.tritici)引起的小麥條銹病是一種氣流傳播病害，分布廣泛，嚴(yán)重威脅小麥高產(chǎn)和穩(wěn)產(chǎn)[1-2]，選育抗病品種是控制小麥條銹病最為經(jīng)濟(jì)、有效的途徑[3-4]。因此，必須不斷發(fā)掘新抗源以滿足小麥育種對(duì)抗源的需求。

利用誘變技術(shù)誘發(fā)基因突變，可產(chǎn)生自然界原來(lái)沒(méi)有的或一般常規(guī)方法難以獲得的新類(lèi)型、新性狀、新基因[5-6]。從突變體中選育新種質(zhì)，是現(xiàn)代育種技術(shù)體系的有效手段，對(duì)作物品種改良具有獨(dú)特的作用。隨著航天技術(shù)的發(fā)展，利用空間環(huán)境誘發(fā)農(nóng)作物產(chǎn)生性狀變異，從中篩選優(yōu)良突變體的航天誘變育種，為農(nóng)作物的種質(zhì)創(chuàng)新提供了新的技術(shù)并取得了顯著成效[7]。我國(guó)于1987 年開(kāi)始進(jìn)行空間誘變育種，至今已搭載了水稻、小麥、大豆、油菜等9大類(lèi)作物[8-9]。選育出的特早熟、優(yōu)質(zhì)、抗病新品系太空5號(hào)和太空6號(hào)[10]、植申1號(hào)[11]等小麥品種(系)已進(jìn)入生產(chǎn)應(yīng)用。然而，當(dāng)前的航天誘變育種多停留在“送種子上天，返地后篩選”的初級(jí)階段，太空育種的系統(tǒng)選育方法和理論研究明顯滯后，特別是航天搭載誘變獲得的突變個(gè)體與其原始親本的遺傳學(xué)比較和分子生物學(xué)分析較少，絕大部分突變發(fā)生位點(diǎn)未知。杜久元等[12]利用衛(wèi)星搭載，將不同小麥品種送入太空處理，從返回的航天誘變小麥中系統(tǒng)選育了突變衍生系，本研究擬對(duì)蘭天15和鄭麥9023的航天誘變材料進(jìn)行誘變衍生系與其親本的遺傳相似性評(píng)估，并進(jìn)行苗期和成株期抗條銹病鑒定及芒的有無(wú)調(diào)查，以期從中篩選出小麥抗條銹病新種質(zhì)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試材料為小麥品種蘭天15和鄭麥9023及其航天誘變材料。蘭天15于2011 年11 月搭載于神州八號(hào)飛船；鄭麥9023于2005年9月搭載于中國(guó)第22顆返回式衛(wèi)星，均由甘肅農(nóng)科院杜久元研究員提供。條銹菌小種為CYR32、CYR33和從貴農(nóng)22小麥標(biāo)樣中分離得到的對(duì) Yr26有毒性的致病型V26/G22，由西北農(nóng)林科技大學(xué)小麥銹病實(shí)驗(yàn)室經(jīng)單孢分離獲得，并經(jīng)一套中國(guó)小麥條銹病鑒別寄主鑒定后，隔離繁殖備用。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 航天誘變材料的系譜選育

按照系譜法選育航天誘變后代。M1代種子按1 m行長(zhǎng)、0.2 m行距、0.05 m株距點(diǎn)播，種植2行親本為對(duì)照，分單株收獲、考種；M2代及其衍生系單株點(diǎn)播，成株期進(jìn)行抗條銹病鑒定，將M2代及其衍生系群體中出現(xiàn)明顯抗感分離的家系，選擇具有代表性的抗病株系分單株編號(hào)收獲，結(jié)合農(nóng)藝性狀，篩選抗條銹病株系。本研究中，蘭天15的M3代材料來(lái)源于M2代編號(hào)為L(zhǎng)T15-2的家系，鄭麥9023的M5代材料來(lái)自M2代編號(hào)為ZM-39的家系，LT15-2與ZM-39在M2代均為抗感分離明顯的家系。1.2.2 航天誘變材料與其親本的遺傳相似性評(píng)估

參照王立新等[13]評(píng)估小麥純度的方法，用小麥染色體上特異性和穩(wěn)定性較好的21對(duì)核心引物[14]對(duì)篩選的突變體與其親本進(jìn)行遺傳相似性評(píng)估，以確定其遺傳變異是否存在異花授粉導(dǎo)致的遺傳重組。引物詳細(xì)信息見(jiàn)表1。

1.2.3 苗期抗條銹病鑒定

在溫室以 Avocet S為感病對(duì)照，在二葉期采用抖粉法[15]分別接種CYR32和V26/G22條銹菌小種，黑暗保濕 24 h 后，轉(zhuǎn)到溫室生長(zhǎng)。接種后約 15 d 左右，待感病對(duì)照充分發(fā)病時(shí)，按照 Line 等[16]的標(biāo)準(zhǔn)記載反應(yīng)型(IT)，此后每 5 d 調(diào)查一次，共調(diào)查 3 次，以最高反應(yīng)型作抗病性評(píng)價(jià)。每個(gè)小種鑒定進(jìn)行3次生物學(xué)重復(fù)，以最高反應(yīng)型為準(zhǔn)。

1.2.4 成株期抗條銹病鑒定

小麥成株期抗病鑒定分別于 2013-2014 和2014-2015兩個(gè)生長(zhǎng)季，分別在陜西楊凌西北農(nóng)林科技大學(xué)實(shí)驗(yàn)農(nóng)場(chǎng)(34°16′N(xiāo)，108°4′E)和甘肅省天水市秦州區(qū)平南鎮(zhèn)萬(wàn)家莊村(34°27′N(xiāo)，105°56′E)進(jìn)行。每份供試小麥品種種植兩行，每隔 20 個(gè)品種種植兩行小偃 22 做為感病對(duì)照，感病品種銘賢169為誘發(fā)行。3月上旬，在楊凌人工病圃的誘發(fā)行接種條銹菌小種 CYR32和CYR33；4月中旬開(kāi)始監(jiān)測(cè)病圃發(fā)病狀況，5月上、中旬條銹病盛發(fā)期，記載各供試小麥品種旗葉和倒二葉的反應(yīng)型和嚴(yán)重度。天水自然誘發(fā)圃于5月下旬條銹病進(jìn)入盛發(fā)期后，記載小麥成株期抗病反應(yīng)型和嚴(yán)重度。按照 Line等[16]0～9級(jí)標(biāo)準(zhǔn)記載反應(yīng)型，0～3為抗病(R)，4～6為中抗(MR)，7為中感(MS)，8～9為感病(S)。按照李振岐等[17]的方法，調(diào)查30 株小麥的嚴(yán)重度，分為1%、5%、10%、20%、40%、60%、80%和100%共8個(gè)等級(jí)，每隔5～7 d 記錄 1 次，調(diào)查 3 次，最終結(jié)果按照最高反應(yīng)型和嚴(yán)重度為準(zhǔn)。

表1 21對(duì)引物的詳細(xì)信息

Table 1 Detailed information of 21 primers

引物Primer引物類(lèi)型Primertype染色體位置Chromosomallocation退火溫度Tm/℃片段大小Fragmentsize/bpcwm65EST?SSR1A65220～260barc80Genomic?SSR1BL65100～125cfd72Genomic?SSR1D65210～240gwm294Genomic?SSR2AL6550～120gwm429Genomic?SSR2BS58190～230gwm261Genomic?SSR2DS65160～200gwm155Genomic?SSR3AL60120～160gwm285Genomic?SSR3BS65210～250gdm72Genomic?SSR3DL60110～150gwm610Genomic?SSR4AL60160～175ksum62EST?SSR4B65160～220barc91Genomic?SSR4DL60110～160cwem40EST?SSR5A58110～180gwm67Genomic?SSR5BS6070～100cfd29Genomic?SSR5DL63180～200gwm334Genomic?SSR6AS50100～150barc198Genomic?SSR6BL65110～160cfd76Genomic?SSR6DL68140～170cfa2028Genomic?SSR7AS65220～240gwm333Genomic?SSR7BL63150gwm437Genomic?SSR7DL5090～140

2 結(jié)果與分析

2.1 航天誘變后代的遺傳相似性

用21對(duì)引物對(duì)航天誘變衍生系與親本進(jìn)行遺傳背景相似性評(píng)估。參照小麥純度檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)[13]，差異標(biāo)記≥3表示與親本遺傳相似性低，存在異花授粉的可能性。結(jié)果表明，蘭天15的M3代誘變衍生系與親本差異標(biāo)記均≥3，最多可達(dá)12個(gè)(表2)，推測(cè)可能存在異花授粉。鄭麥9023的M5代誘變衍生系與親本差異標(biāo)記均≤2(表3)，與親本遺傳相似性高。圖1、圖2分別為利用引物gwm333對(duì)蘭天15衍生系和鄭麥9023衍生系的部分PCR擴(kuò)增、電泳結(jié)果。圖1中，衍生系與對(duì)照相比明顯出現(xiàn)了多種變異，部分蘭天15的航天誘變M3代衍生系擴(kuò)增條帶數(shù)目增加，10個(gè)衍生系中只有3個(gè)與親本擴(kuò)增產(chǎn)物一致。圖2中10個(gè)鄭麥9023的M5代誘變衍生系均與親本帶型一致。

1～10:M3衍生系;CK:蘭天15;M:DS100 marker。

1-10:M3 derives;CK:Lantian 15;M:DS100 marker.

圖1 蘭天15及其部分M3代衍生系的gwm333擴(kuò)增結(jié)果

Fig.1 PCR profile of gwm333 in Lantian 15 and some M3 derives

1～10:M5衍生系;CK:鄭麥9023; M:DS100 marker。

1-10:M5 derive;CK:Zhengmai 9023;M: DS100 marker.

圖2 鄭麥9023及其部分M5代衍生系的gwm333擴(kuò)增結(jié)果

Fig.2 PCR profile of gwm333 in Zhengmai 9023 and some M5 derivers

2.2 航天誘變后代的農(nóng)藝性狀

2.2.1 蘭天15誘變衍生系農(nóng)藝性狀

經(jīng)過(guò)苗期接種鑒定，蘭天15對(duì)CYR32、V26/G22兩個(gè)小種均表現(xiàn)為感病，其M2代抗病性出現(xiàn)分離，有5個(gè)衍生系對(duì)小種CYR32表現(xiàn)抗病，9個(gè)衍生系對(duì)小種CYR32表現(xiàn)抗感分離，其余衍生系均表現(xiàn)感病。1個(gè)衍生系對(duì)小種V26/G22表現(xiàn)抗病，其余衍生系均表現(xiàn)感病。

由表2可知，蘭天15 的16個(gè)M2代的167份M3代衍生系的抗銹性和芒的有無(wú)發(fā)生了不同程度的分離。

2.2.2 鄭麥9023航天誘變衍生系的抗條銹性

經(jīng)過(guò)苗期分小種鑒定，親本鄭麥9023及46份M5代誘變衍生系對(duì)CYR32和V26/G22兩個(gè)小種均表現(xiàn)為感病。成株期鑒定結(jié)果(表3)表明，親本鄭麥9023在楊凌和天水兩年兩地的鑒定均表現(xiàn)高感，46份M5代誘變衍生系材料均表現(xiàn)抗病，嚴(yán)重度為5%～10%。

表2 蘭天15航天誘變衍生系分子標(biāo)記和農(nóng)藝性狀差異

Table 2 Differences in molecular markers and agronomic traits of space mutagenesis of Lantian 15

M2代編號(hào)M2lineNo．M3代株系數(shù)No．ofM3lines差異標(biāo)記數(shù)目DifferenceNo．成株期抗銹性(抗/感/分離)Separationofadultresistance(R/S/Separate)芒的分離(有芒/無(wú)芒/分離)Separationofawn(Awn/Awnless/Separate)蘭天150R無(wú)芒LT15?2?3225～918/2/221/0/1LT15?2?4267～96/6/1426/0/0LT15?2?5138～1012/1/013/0/0LT15?2?996～93/5/18/0/1LT15?2?1995～93/6/08/0/1LT15?2?2455～75/0/00/0/5LT15?2?2587～98/0/08/0/0LT15?2?27123～97/0/50/0/12LT15?2?2886～123/5/08/0/0LT15?2?30136～82/11/013/0/0LT15?2?3184～74/4/00/8/0LT15?2?4176～117/0/00/7/0LT15?2?5035～71/2/03/0/0LT15?2?57106～127/1/20/10/0LT15?2?5976～93/3/13/3/1LT15?2?8278～103/3/13/3/1

R:Resistance;S:Susceptible.

3 討 論

3.1 航天誘變材料遺傳變異評(píng)估的必要性

航天誘變變異方向不定[18]，可能產(chǎn)生花器官變異，使穎殼張開(kāi)[19]，如果不進(jìn)行嚴(yán)格套袋，可能導(dǎo)致異花授粉，使誘變衍生系出現(xiàn)混雜。因此分析航天誘變材料與親本遺傳背景的相似性至關(guān)重要。本研究借鑒小麥純度檢測(cè)的分子檢測(cè)方法進(jìn)行遺傳相似性評(píng)估，所采用的21對(duì)全基因組的引物多態(tài)性信息量高，具有較強(qiáng)分辨率，可完成95%～100%的品系的種子純度檢測(cè)[14]。分子檢測(cè)結(jié)果表明，蘭天15的M3代衍生系與親本之間的差異標(biāo)記數(shù)目達(dá)3～12個(gè)，初步判斷該誘變系群在早代發(fā)生了異花授粉，其性狀變異可能來(lái)自遺傳重組。鄭麥9023的M5代誘變衍生系群內(nèi)，差異標(biāo)記數(shù)量極少，最多不超過(guò)2個(gè)，該誘變系群存在異花授粉的可能性較低。為了驗(yàn)證分子檢測(cè)結(jié)果，本研究對(duì)誘變系群進(jìn)行了田間部分農(nóng)藝性狀調(diào)查，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，被測(cè)蘭天15的M3代誘變衍生系不僅芒的性狀出現(xiàn)明顯分離，株高，葉色等多個(gè)農(nóng)藝性狀與親本均有差異且后代呈規(guī)律性分離，進(jìn)一步證明蘭天15誘變系群存在遺傳重組導(dǎo)致性狀變異的可能。調(diào)查中發(fā)現(xiàn)，在小麥開(kāi)花期間，部分衍生系穎殼明顯外張，推測(cè)可能由此導(dǎo)致異花授粉。被測(cè)鄭麥9023的M5代誘變衍生系的農(nóng)藝性狀與其親本基本一致，只有部分衍生系成株期抗病性明顯提高，據(jù)此認(rèn)為，其抗病性改變可能是航天誘變的結(jié)果。突變發(fā)生的位點(diǎn)及突變導(dǎo)致抗病性改變的機(jī)制有待進(jìn)一步研究。針對(duì)航天誘變后代衍生系可能出現(xiàn)異花授粉的情況，今后將對(duì)新創(chuàng)制的材料進(jìn)行嚴(yán)格地套袋，并進(jìn)行開(kāi)花習(xí)性的調(diào)查，對(duì)花器官發(fā)生變異的植株進(jìn)行重點(diǎn)保護(hù)。

表3 鄭麥9023航天誘變M5代抗條銹性評(píng)價(jià)及差異標(biāo)記數(shù)目

Table 3 Resistance of Zhengmai 9023 progenies of wheat space mutagenesis to stripe rust and the different numbers of markers

M5代選系編號(hào)M5LineNo．苗期抗性SeedinginfecttypeCYR32V26成株期抗性Adultresistance2014(Y)2014(T)2015(Y)2015(T)抗性評(píng)價(jià)Resistanceevolution差異標(biāo)記數(shù)目DifferentNo．鄭麥9023SSS60S80S40S60S0ZM?39?26?4?5?1SSR5R10R10R10APR1ZM?39?26?5?5?3SSR10R10R10R10APR1ZM?39?26?19?6?1SSR10R10R10R10APR1ZM?39?40?19?10?6SSR5R10R10R10APR2ZM?39?40?3?1?2SSR10R10R5R10APR2ZM?39?40?8?2?7SSR10R10R10R10APR1ZM?39?63?20?9?5SSR10R10R10R10APR1ZM?39?63?20?10?1SSR5R10R5R10APR1ZM?39?63?12?9?7SSR10R10R10R10APR1

R：抗??；S：感??；R或S后面的數(shù)字代表嚴(yán)重度；APR：成株期抗??；Y：楊凌；T：天水。

R:Resistance; S:Susceptible;Values following R or S mean severity;APR:Adult plant resistance; Y:Yangling; T:Tianshui.

航天搭載處理導(dǎo)致植物突變的機(jī)制目前尚不明確。張志勇等[20]利用重測(cè)序技術(shù)對(duì)水稻航天誘變突變體及其野生型進(jìn)行全基因組測(cè)序，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，航天誘變對(duì)水稻基因組的改變以單堿基變化為主，因此本研究使用一定數(shù)量的分子標(biāo)記進(jìn)行遺傳相似性檢測(cè)，可降低航天誘變引起的變異對(duì)檢測(cè)結(jié)果的影響。通過(guò)本研究建立了篩選航天誘變后代衍生系的技術(shù)體系，在利用系譜法選育誘變突變體衍生系過(guò)程中，應(yīng)結(jié)合遺傳相似性的評(píng)估。

3.2 航天誘變育種是創(chuàng)制新種質(zhì)的重要途徑

空間搭載小麥因太空環(huán)境的特殊性可以產(chǎn)生罕見(jiàn)的突變體，是獲得新基因的重要途徑之一。曹 麗等[21]研究表明，航天搭載能夠使小麥產(chǎn)生株高的變異。王美芳等[22]研究表明，航天誘變可引起小麥株高、葉色、穗長(zhǎng)、產(chǎn)量性狀、品質(zhì)性狀等方面的變異。趙洪兵等[23]通過(guò)航天搭載發(fā)現(xiàn)了葉綠素缺失突變體，對(duì)發(fā)掘光合作用相關(guān)基因具有重要意義。本研究中，鄭麥9023的部分航天誘變后代衍生系的成株期抗性明顯提升且抗病性穩(wěn)定，經(jīng)遺傳相似性分析，未發(fā)現(xiàn)異花授粉，說(shuō)明航天誘變產(chǎn)生了抗條銹性的變異。可將這些抗性明顯提高的衍生系應(yīng)用于抗條銹育種。

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Screening and Identification Resistance to Stripe Rust from Space Mutagenesis of Wheat

Lü Xingna1,2,DU Jiuyuan3,SU Pingping1,2,WANG Qilin1,4,WU Jianhui1,4,HUANG Lili1,4,KANG Zhensheng1,4,HAN Dejun1,2

(1.State Key Laboratory of Crop Stress Biology in Arid Areas,Northwest A&F University,Yangling,Shaanxi 712100,China; 2.College of Agronomy,Northwest A&F University,Yangling ,Shaanxi 712100,China; 3.Wheat Research Institute,Gansu Academy of Agricultural Sciences,Lanzhou,Gansu 730070,China; 4.College of Plant Protection,Northwest A&F University,Yangling,Shaanxi 712100,China)

The evaluation of the genetic variation and the phenotype identification of space mutation progeny is of great significance to space mutation breeding. To select the stripe rust mutants from the space mutagenesis of Liantian 15 and Zhengmai 9023,the genetic similarity between the space mutagenesis and their parents were assessed through 21 pairs of core primers and the stripe rust resistance were assessed through inoculating the prevalent stripe rust race CYR32，CYR33 and the main pathotype V26/G22 in the seedling stage in the greenhouse and in the adult plant stage in the field,respectively. And the agronomic traits were investigated in the field. The results showed that more than three molecular markers in the space mutagenesis of Liantian 15 were different from those in the mutagenic parents and the separation existed in the stripe rust resistance,the character of their awns and other agronomic traits. We speculated the variation of the characters resulted from cross pollination in Liantian 15. In the mutagenesis of Zhengmai 9023,less than two molecular markers were different from their parents,and the stripe rust resistance at the seedling stage to the tested races and most agronomic traits was consistent with Zhengmai 9023. However,the resistance to stripe rust of adult plant was improved. It can be concluded that the variation of adult plant resistance resulted from space mutation. The mutagenesis with adult resistance to stripe rust of Zhengmai 9023 can be useful in the future stripe rust resistance breeding.

Wheat; Space mutation; Stripe rust resistance mutant; Genetic similarity

麥類(lèi)作物學(xué)報(bào) 2016，36(12)：1605?1610JournalofTriticeaeCropsdoi：10．7606/j．issn．1009?1041．2016．12．08

2016-04-11

2016-05-04

國(guó)家“十二五”科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目(2012BAD19B04)；甘肅省航天工程生物育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室建設(shè)項(xiàng)目(1309RTSE003); 國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(31371924)；高等學(xué)校學(xué)科創(chuàng)新引智計(jì)劃資助項(xiàng)目(B07049)

E-mail:lvxingna2016@163.com(呂興娜); dujiuyuan1962@163.com(杜久元，與第一作者同等貢獻(xiàn))

康振生(E-mail:kangzs@nwsuaf.edu.cn)；韓德俊(E-mail:handj@nwsuaf.edu.cn)

時(shí)間：2016-12-07

S512.1；S333

A

1009-1041(2016)12-1599-06

網(wǎng)絡(luò)出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/61.1359.S.20161207.1748.012.html