諾氟沙星在日本鰻鱺體內(nèi)的代謝動力學(xué)及殘留消除規(guī)律

范紅照，林茂，*，鄢慶枇，湛嘉，李忠琴

(1. 集美大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院，福建 廈門 361021；2. 鰻鱺現(xiàn)代產(chǎn)業(yè)技術(shù)教育部工程研究中心，福建 廈門361021；3. 寧波出入境檢驗檢疫局，浙江 寧波 315010)

諾氟沙星在日本鰻鱺體內(nèi)的代謝動力學(xué)及殘留消除規(guī)律

范紅照1，林茂1，2*，鄢慶枇1，湛嘉3，李忠琴2

(1. 集美大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院，福建 廈門 361021；2. 鰻鱺現(xiàn)代產(chǎn)業(yè)技術(shù)教育部工程研究中心，福建 廈門361021；3. 寧波出入境檢驗檢疫局，浙江 寧波 315010)

為研究諾氟沙星(NFX)在鰻鱺體內(nèi)的代謝和消除規(guī)律，以超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定日本鰻鱺在混飼口灌后血液和組織中NFX的含量變化，并進(jìn)行藥動學(xué)分析。結(jié)果表明，NFX以30 mg/kg的劑量單次混飼口灌日本鰻鱺后，吸收分布迅速，達(dá)峰時間(Tmax)、吸收(T1/2Ka)和分布半衰期(T1/2α)分別為3.000、1.012和1.570 h；NFX在鰻鱺體內(nèi)消除較快，消除半衰期(T1/2β)為15.267 h，總清除率(CL)為1.315 L/(h·kg)。此外，峰濃度(Cmax)為1.273 mg/L，藥時曲線下面積(AUC(0～∞))為22.670 mg/(L·h)。NFX以30 mg/kg的劑量連續(xù)3 d混飼口灌日本鰻鱺后，在肌肉、肝臟、腎臟和血漿中的消除速率常數(shù)分別為0.144、0.125、0.102和0.093 1/d。根據(jù)WT1.4計算的理論休藥期(WDT)分別為肌肉22.97 d，肝臟21.30 d，腎臟33.40 d，血漿18.29 d。本研究結(jié)果為諾氟沙星在水產(chǎn)動物中的實際應(yīng)用提供理論依據(jù)。[中國漁業(yè)質(zhì)量與標(biāo)準(zhǔn), 2016, 6(1):22-28]

諾氟沙星；日本鰻鱺；藥代動力學(xué)；殘留；消除規(guī)律

諾氟沙星(norfloxacin，NFX)屬于第三代喹諾酮類藥物，該藥對大多數(shù)革蘭氏陰性菌、部分革蘭氏陽性菌及某些支原體、立克次氏體均有殺菌效果，同時在體內(nèi)作用迅速、分布廣泛且與其他抗生素之間無交叉耐藥性，因此應(yīng)用廣泛[1]。農(nóng)業(yè)部1435號公告第一批《獸藥試行標(biāo)準(zhǔn)轉(zhuǎn)正標(biāo)準(zhǔn)目錄》中水產(chǎn)用的諾氟沙星制劑有諾氟沙星粉、乳酸諾氟沙星可溶性粉、煙酸諾氟沙星預(yù)混劑、諾氟沙星鹽酸小檗堿預(yù)混劑等4種，這些列入國家標(biāo)準(zhǔn)的諾氟沙星制劑在水產(chǎn)動物細(xì)菌性疾病防治中發(fā)揮了重要的作用。目前已有諾氟沙星在歐洲鰻鱺(Anguillaanguilla)[2]、奧尼羅非魚(Oreochromisaureus×O.niloticus)[3]、大黃魚(Larimichthyscrocea)[4]、牙鲆(Paralichthysolivaceus)[5]、鯉(Cyprinuscarpio)[6]、鯽(Carassiusauratus)[7]、草魚(Ctenopharyngodonidellus)[8]、南美白對蝦(Penaeusvannamei)[9]、菲律賓蛤仔(Ruditapesphilippinarum)[10]等10余種魚蝦貝類的藥動學(xué)或殘留消除規(guī)律的研究報道，獲得了諾氟沙星在這些動物體內(nèi)的藥動學(xué)參數(shù)和理論休藥期。在這些研究中，國內(nèi)學(xué)者對于諾氟沙星休藥期的獲得通常根據(jù)一級消除指數(shù)方程計算，但國外的報道更趨向于使用美國FDA規(guī)定的回歸法進(jìn)行分析[11]。

日本鰻鱺(Anguillajaponica)是中國重要的優(yōu)勢養(yǎng)殖品種和主要的出口創(chuàng)匯水產(chǎn)品，聯(lián)合國糧食及農(nóng)業(yè)組織(FAO)漁業(yè)水產(chǎn)養(yǎng)殖部的統(tǒng)計數(shù)據(jù)[12]表明，2013年日本鰻鱺的全球養(yǎng)殖產(chǎn)量23.2萬t，而中國的產(chǎn)量為20.8萬t，占全球產(chǎn)量的89.7%。諾氟沙星具有較好的抗菌活性，但其在日本鰻鱺疾病防治中的應(yīng)用還需要更多藥理學(xué)實驗數(shù)據(jù)的支持。因此，本研究模擬實際養(yǎng)殖條件，采用混飼口灌給藥方式，研究諾氟沙星在日本鰻鱺體內(nèi)的藥動學(xué)和殘留消除規(guī)律，并提出給藥方案和休藥期建議，以期為該類藥物的安全使用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗用魚

日本鰻鱺購于廈門同安鰻魚養(yǎng)殖場，體重為(518±66)g，實驗前日本鰻鱺在生態(tài)室循環(huán)水養(yǎng)殖系統(tǒng)中暫養(yǎng)一周，水溫(28±0.5)℃，pH(7.04±0.28)。隨機(jī)抽取5尾進(jìn)行色譜分析，確認(rèn)無NFX殘留。

1.2 儀器和試劑

超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用儀(UPLC-MS/MS，色譜柱為T3 C18(2.1 mm×100 mm，1.8 μm))及其配套MassLynx Version 4.0工作站。

諾氟沙星標(biāo)準(zhǔn)對照品(≥99.6%)，購自中國藥品生物制品檢定所；諾氟沙星粉(規(guī)格為100 g∶10 g)為北京漁經(jīng)公司產(chǎn)品，檢測含量符合獸藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；鰻鱺飼料購自天馬飼料集團(tuán)，檢測無NFX成分。

1.3 給藥和取樣

選用諾氟沙星粉，給藥劑量為300 mg/kg(相當(dāng)于諾氟沙星 30 mg/kg)。藥代動力學(xué)研究采用單次混飼口灌給藥，在給藥后分別于0.25、0.5、1、2、3、4、6、9、15、24、36和48 h取樣；藥物殘留消除研究采用連續(xù)3 d混飼口灌給藥，每天1次，分別在給藥后1、2、3、5、8、12、20和30 d取樣。每個時間點都取樣5尾。血液采集后于0.1 mg/L肝素鈉潤洗風(fēng)干的離心管中，振蕩混勻后，5 000 r/min離心10 min，取上層血漿置-80 ℃保存。肌肉、肝臟和腎臟樣品置于封口袋中，-80 ℃凍存。另外取未給藥的鰻鱺的各組織作為空白樣品。

1.4 前處理方法

吸取0.2 mL血漿(肌肉、肝和腎等組織稱取0.2 g，勻漿成糊狀)到試管中，加入2 mL 含0.1%甲酸的50%ACN，振蕩30 s，超聲波5 min，10 000 r/min離心5 min；用2 mL 100% ACN二次提取沉淀中的NFX；合并兩次提取得到的上清液，并加入2 mL正己烷，析出脂類；吸取前處理液250 μL，混合750 μL 20%的DMSO，用一次性針頭濾器(尼龍)過濾到進(jìn)樣瓶中。

1.5 檢測方法及條件

樣品中的藥物濃度采用UPLC-MS/MS測定，流動相A2為含0.1%甲酸的水；流動相B2為含0.1%甲酸的甲醇。參數(shù)設(shè)置如下：色譜柱溫度為40 ℃；進(jìn)樣量為10 μL；去溶劑氣溫度為450 ℃；去溶劑流速為800 L/h；錐孔流速為50 L/h；碰撞氣體為氬氣3.2×10-3mba；采用流動相梯度洗脫方式分離NFX。測定標(biāo)準(zhǔn)品時，以負(fù)離子模式在m/z50～400范圍內(nèi)進(jìn)行一級質(zhì)譜圖和子離子掃描，確定NFX的離子碎片為m/z320.4的母離子和m/z分別為 302.2、276.3、233.2和205.1四種子離子，選擇響應(yīng)值最高的m/z302.2和m/z276.3的作為檢測離子。

1.6 分析方法驗證

1)制備標(biāo)準(zhǔn)曲線

在空白血漿或組織中加入NFX，使其質(zhì)量濃度分別為0、0.02、0.2、0.8、2和4 μg/mL(或μg/g)，每個質(zhì)量濃度設(shè)置3組平行，混勻振蕩2 min后，按方法1.4處理，得各質(zhì)量濃度的響應(yīng)值，在Mass Lynx Version 4.0 中建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，并確定相關(guān)系數(shù)。以3倍信噪比(S/N)計算最低檢測限。

2)測定精密度

在空白血漿或組織中加入NFX，使其質(zhì)量濃度分別為0.02、0.2和2.0 μg/mL(或μg/g)，混勻振蕩2 min后，按方法1.4處理，記錄測定得到的響應(yīng)值。此過程每隔2 h進(jìn)行一次，共6次。用Excel計算出各質(zhì)量濃度對應(yīng)的響應(yīng)值的日內(nèi)平均變異系數(shù)(CV)。同上述方法比較日間隔6次/周所測定的3種濃度對應(yīng)的響應(yīng)值，得到日間平均變異系數(shù)(CV)。

3)相對回收率

上述加標(biāo)樣品的響應(yīng)值代入標(biāo)準(zhǔn)曲線公式計算，得到實測濃度。相對回收率=實測濃度/理論濃度×100%。

1.7 數(shù)學(xué)模型擬合與休藥期的確定

藥動學(xué)和殘留消除的藥時數(shù)據(jù)分別采用DAS 2.0和SPSS 16.0軟件進(jìn)行擬合[13-14]。理論休藥期的分析依據(jù)美國FDA規(guī)定的回歸法[11]，采用休藥期計算軟件WT 1.4，以對數(shù)線性回歸曲線95%置信區(qū)間的上限降至藥物最高殘留限量(MRL)所需要的時間作為休藥期[15]。中國農(nóng)業(yè)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定諾氟沙星在魚體中的MRL是50 μg/kg[16]，本研究的休藥期據(jù)此標(biāo)準(zhǔn)計算。

2 結(jié)果與分析

2.1 質(zhì)譜特征

諾氟沙星的子離子中，以m/z302.2響應(yīng)值最高，保留時間為3.17 min(圖1)。

2.2 分析方法驗證

鰻鱺血漿中0.02、0.2和2.0 μg/mL等3個質(zhì)量濃度水平的NFX的日內(nèi)變異系數(shù)為(4.01±0.13)% ～(6.51±1.45)%，日間變異系數(shù)為(4.13±1.27)% ～(6.52±1.84)%。實驗樣品以當(dāng)日繪制的標(biāo)準(zhǔn)曲線計算濃度，每次所繪標(biāo)準(zhǔn)曲線只有細(xì)微差別，但相關(guān)系數(shù)(R2)均大于0.998。在0.02～4 μg/mL范圍內(nèi)NFX質(zhì)量濃度與峰面積呈線性相關(guān)，相關(guān)系數(shù)良好，最低檢測限為2.5 ng/mL。相對回收率為(95.76±8.24)% ～(119.10±2.12)%。

圖1 諾氟沙星標(biāo)準(zhǔn)品及樣品的質(zhì)譜圖a: 標(biāo)準(zhǔn)品，10 ng·mL-1；b: 空白樣；c: 空白樣中添加標(biāo)準(zhǔn)品，10 ng·mL-1；d: 給藥4 h后的樣品。Fig.1 The LC-MS chromatogram of NFX standard and samplesa: Standard, 10 ng·mL-1; b: Blank; c: Standard in blank, 10 ng·mL-1; d: Plasma sample at 4 h.

2.3 藥動學(xué)曲線與參數(shù)

NFX以30 mg/kg的劑量單次混飼口灌日本鰻鱺，0.25 h后血漿中藥物的質(zhì)量濃度為0.063 μg/mL，隨后呈快速上升趨勢，于3 h時達(dá)峰濃度(Cmax)1.273 μg/mL，之后持續(xù)下降，至48 h時NFX質(zhì)量濃度為0.105 μg/mL，為峰濃度的8.2%(圖2)。此藥時曲線經(jīng)DAS軟件擬合分析，表明諾氟沙星口灌給藥后在日本鰻鱺體內(nèi)的代謝符合一級吸收，二室模型，藥時曲線方程為Ct= 5.226×e-0.441t+0.79×e-0.036t- 7.762×e-0.685t，擬合度(R2)為0.935。藥動學(xué)房室參數(shù)(表1)顯示，口服給藥后NFX在日本鰻鱺體內(nèi)吸收、分布和消除均較快，其吸收(T1/2Ka)、分布(T1/2α)和消除(T1/2β)半衰期分別為1.012、1.570 和15.267 h。

2.4 藥物殘留消除曲線

在(28±0.5)℃水溫下，分析NFX以30 mg/kg的劑量連續(xù)混飼口灌日本鰻鱺3 d后的消除情況(圖3)。第1～5天在肌肉和腎中含量較高且相近，但肌肉中含量下降最快，由第1天的1.14 μg/g下降至第5天的0.19 μg/g，而腎中含量由1.10 μg/g下降至0.36 μg/g。肝內(nèi)含量由第1天的0.58 μg/g降至第5天的0.046 μg/g，已經(jīng)位于MRL以下。血漿中濃度與其他組織比較一直為最低。第5天后各組織血藥濃度下降趨于平緩。根據(jù)消除曲線方程(表2)可知，NFX在肌肉、肝臟、腎臟和血漿中的消除速率常數(shù)分別為0.144、0.125、0.102和0.093 1/d。

圖2 諾氟沙星(30 mg·kg-1)在日本鰻鱺血漿中的藥時曲線Fig.2 The concentration-time curve of NFX in Anguilla japonica after single oraladministration at the dose of 30 mg·kg-1

表1 日本鰻鱺單劑量口灌諾氟沙星(30 mg·kg-1)的藥代動力學(xué)參數(shù)

Tab.1 Pharmacokinetics parameters following single oral adiministration of 30 mg·kg-1of NFX toAnguillajaponica

房室參數(shù)Compartmentparameter單位Unit參數(shù)值Value非房室參數(shù)Noncompartmentparameter單位Unit參數(shù)值Value曲線下面積AUC(0～t)Mg·(L·h)-119.533曲線下面積AUC(0～t)Mg·(L·h)-119.776曲線下面積AUC(0～∞)Mg·(L·h)-122.670曲線下面積AUC(0～∞)Mg·(L·h)-122.815表觀分布容積V1/FL·kg-111.441表觀分布容積Vz/FL·kg-128.968清除率CL/FL·(h·kg)-11.323清除率CLZ/FL·(h·kg)-11.315吸收相半衰期T1/2Kah1.012平均駐留時間MRT(0～t)h16.680分布相半衰期T1/2αh1.570平均駐留時間MRT(0～∞)h23.786消除相半衰期T1/2βh19.389消除半衰期T1/2h15.267吸收速率常數(shù)Kah-10.685達(dá)峰時間Tmaxh3.000中央室消除速率常數(shù)K10h-10.116峰濃度Cmaxmg·L-11.273

表2 諾氟沙星在日本鰻鱺各組織中的消除曲線方程和參數(shù)

Tab. 2 Elimination curve equations and parameters inAnguillajaponica

組織Tissue殘留消除方程Eliminateequation相關(guān)系數(shù)(R2)Correlation消除半衰期/d T1/2Eliminationhalflife肌肉C=0.730×e-0.144t0.9304.813肝C=0.230×e-0.125t0.9255.544腎C=0.821×e-0.102t0.9576.794血漿C=0.085×e-0.093t0.9187.452

圖3 日本鰻鱺連續(xù)3 d混飼口灌諾氟沙星(30 mg﹒kg-1)后的殘留消除曲線Fig.3 Elimination curve of NFX in Anguilla japonica after 3 d oral dosing (30 mg·kg-1)

2.5 理論休藥期

理論休藥期釆用回歸計算方法分析(圖4)，結(jié)果表明，(28±0.5)℃水溫條件下，諾氟沙星以30 mg/kg的給藥劑量連續(xù)3 d混飼口灌日本鰻鱺后，在各組織中的理論休藥期分別是：肌肉為26.34 d，肝臟為24.32 d，腎臟為 35.13 d，血漿為20.72 d(MRL=50 μg/kg)。

3 討論

3.1 諾氟沙星在鰻鱺體內(nèi)的藥動學(xué)特征

口灌給藥方式下，諾氟沙星在日本鰻鱺體內(nèi)的吸收、分布和消除較快。NFX在日本鰻鱺體內(nèi)的T1/2Ka為1.012 h，吸收速率快于奧尼羅非魚(1.97 h)[3]，但慢于鯉(0.15 h)[6]和大黃魚(0.70 h)[4]。NFX在日本鰻鱺體內(nèi)的T1/2α為1.570 h，分布速率快于奧尼羅非魚(1.97 h)[3]、大黃魚(2.09 h)[4]、鯉(3.41 h)[6]和鯽(1.61 h)[7]，但慢于草魚(0.51 h)[8]。CL是反映藥物從體內(nèi)消除速率的重要參數(shù)[17-18]。NFX在奧尼羅非魚[3]、鯽[7]和草魚[8]體內(nèi)的CL分別為0.55、0.57和1.08 L/(h·kg)，而在日本鰻鱺體內(nèi)的CL為1.315 L/(h·kg)，相對而言消除更快。

圖4 諾氟沙星在鰻鱺各組織中的理論休藥期a:擬合回歸線；b:95%置信區(qū)間的上限。Fig.4 Plot of the withdrawal time calculation for NFX in Anguilla japonicaa:Linear regression line; b:Tolerance limit with 95% confidence.

諾氟沙星在日本鰻鱺體內(nèi)能達(dá)到較高的峰濃度(1.273 μg/mL)，持續(xù)時間長，理論上對于大部分細(xì)菌性疾病的治療有好的效果。王曉潔等[19]測得NFX對鰻鱺細(xì)菌性病原嗜水氣單胞菌(Aeromonas.hydrophila)的最低抑菌濃度(MIC)為0.16 μg/mL，劉艷輝等[20]測得NFX對淡水養(yǎng)殖魚類常見的致病菌蘇伯利產(chǎn)氣單胞菌(A.sobria)、點狀產(chǎn)氣單胞菌(A.punctata)、熒光假單胞菌(P.fluorescens)和腸型點狀氣單胞菌(A.intertinalis)的MIC分別為0.02、0.039、0.039和0.313 μg/mL。氟喹諾酮類對水產(chǎn)動物病原菌的MIC普遍較低[1]，在臨床應(yīng)用時的給藥劑量取決于該劑量下的Cmax/MIC能否達(dá)到10[21]。本研究中日本鰻鱺給藥2 h時NFX血藥濃度升到0.85 μg/mL，到15 h時血藥濃度才降為0.335 μg/mL，期間血藥濃度均大于各菌MIC，Cmax/MIC界于4.07～63.65之間，說明30 mg/kg的給藥劑量可在鰻鱺體內(nèi)對常見致病菌產(chǎn)生一定范圍的治療窗。結(jié)合半衰期T1/2為15.267 h，建議其混飼口灌給藥一天兩次。

3.2 諾氟沙星殘留在鰻鱺體內(nèi)消除規(guī)律和建議休藥期

殘留的消除半衰期(T1/2)反映了藥物在動物體內(nèi)的消除速度。(28±0.5)℃水溫條件下，諾氟沙星多劑量給藥后在日本鰻鱺肌肉、肝、腎和血漿中的T1/2分別為4.813、5.544、6.794和7.452 d(表2)，消除較快。對于國內(nèi)市場，行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定諾氟沙星在魚體中的MRL為50 μg/kg[9]，以此計算，(28±0.5)℃水溫條件下，若考慮肌肉為主要食用組織，建議休藥期為27 d；若考慮所有組織，則以消除最慢的腎臟為靶組織，建議把休藥期延長為36 d。

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Norfloxacin pharmacokinetics and the residue elimination in Anguilla japonica

FAN Hongzhao1, LIN Mao1，2*, YAN Qinpi1, ZHAN Jia3, LI Zhongqin2

(1.Fisheries College, Jimei University, Xiamen 361021, China; 2. Engineering Research Center of the Modern Technology forEel Industry, Ministry of Education, Xiamen 361021, China; 3. Ningbo Entry-Exit Inspection and QuarantineBureau, Ningbo 315010, China)

To investigate the pharmacokinetics of Norfloxacin (NFX) in eel (Anguillajaponica), the concentration-time data of NFX was determined by UPLC-MS/MS. Pharmacokinetic analysis showed that after oral administration of mixed feed at the dose of 30 mg/kg, the absorption and distribution of NFX were fast, with the peak time (Tmax), absorption (T1/2Ka) and distribution half-life (T1/2α) of 3.000, 1.012 and 1.570 h, respectively. The elimination of NFX was also quick, with the elimination half-life (T1/2) of 15.267 h and total body clearance (CL) was 1.315 L/(h·kg). In addition, peak concentration (Cmax) was 1.273 mg/L, and the area under the concentration-time curve (AUC(0～∞)) was 22.67 mg/(L·h). After 3 d of successive oral administration at the dose of 30 mg/(kg·d) NFX, the elimination rate constant were 0.144, 0.125, 0.102 and 0.093 1/d in muscle, liver, kidney and plasma, respectively. In theory, the withdrawal time calculated by WT1.4 program was 22.97 d in muscle, 21.30 d in liver, 33.40 d in kidney and 18.29 d in plasma. The results provided a theoretical basis for practical applications of norfloxacin in aquatic animals.[Chinese Fishery Quality and Standards, 2016, 6(1):22-28]Key words:norfloxacin;Anguillajaponica;pharmacokinetics;residues;depletionCorresponding author:LIN Mao, linmao@jmu.edu.cn

2015-08-03；接收日期：2015-11-17

公益性行業(yè)(農(nóng)業(yè))科研專項(201203085)； 鰻鱺現(xiàn)代產(chǎn)業(yè)技術(shù)教育部工程研究中心開放基金(RE201507)；福建省自然科學(xué)基金(2014J01131)；海洋經(jīng)濟(jì)發(fā)展區(qū)域示范項目(14CZP032HJ06,14PYY050SF03)

范紅照(1987-)，男，碩士，研究方向為水產(chǎn)動物藥動學(xué)與殘留檢測技術(shù)，535773640@qq.com 通信作者：林茂，副教授，研究方向為水產(chǎn)動物病害控制，linmao@jmu.edu.cn

S948

A

2095-1833(2016)01-0022-07