不同抗性馬尾松無性系松材線蟲病癥狀發(fā)展與松材線蟲遷移、繁殖的關(guān)系

潘婷，陳雪蓮，郝焰平，姜春武，徐六一

（安徽省林業(yè)科學(xué)研究院，合肥 230031）

不同抗性馬尾松無性系松材線蟲病癥狀發(fā)展與松材線蟲遷移、繁殖的關(guān)系

潘婷，陳雪蓮，郝焰平，姜春武，徐六一

（安徽省林業(yè)科學(xué)研究院，合肥 230031）

為了探索馬尾松松材線蟲病抗性機(jī)制，對(duì)廣德20-5和廣德34-1這兩個(gè)具有不同松材線蟲病抗性的7年生馬尾松無性系接種了6 000頭松材線蟲，并分析接種1 d、5 d、9 d后兩個(gè)無性系中癥狀的發(fā)展、松材線蟲的數(shù)量和分布情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，松材線蟲的活動(dòng)引起了這兩個(gè)無性系的髓心的褐化和廣德20-5針葉的枯萎，但褐化癥狀在廣德34-1中較輕且擴(kuò)散較慢，同時(shí)松材線蟲在廣德34-1中的繁殖和遷移速度也較廣德20-5慢。表明廣德34-1能抑制松材線蟲在其體內(nèi)遷移和繁殖，所以它對(duì)髓心褐化和針葉枯萎等松材線蟲引起的癥狀表現(xiàn)出更高的抗性。

馬尾松；松材線蟲病抗性；遷移；繁殖；髓心褐化

馬尾松（Pinus massoniana）是中國(guó)特有的鄉(xiāng)土樹種，分布面積居全國(guó)針葉林首位，蓄積量居第四位[6]。有研究表明，馬尾松對(duì)松材線蟲的抗性較強(qiáng)[7-8]，是松材線蟲病抗性育種的好材料。2001～2008年，中日技術(shù)合作安徽省松材線蟲抗性育種中心實(shí)施了“馬尾松松材線蟲抗性育種項(xiàng)目”，引用日本黑松和赤松松材線蟲病抗性育種的成功經(jīng)驗(yàn)，在全國(guó)率先開展了馬尾松松材線蟲病抗性育種工作。該項(xiàng)目自2001～2002年從松材線蟲病疫區(qū)和非疫區(qū)馬尾松林分中選取優(yōu)良母樹324株，采種育苗得到314個(gè)家系、44 430株苗木；2003～2005年分批對(duì)苗木進(jìn)行兩次人工接種松材線蟲；2006年根據(jù)接種試驗(yàn)結(jié)果選拔出抗性馬尾松候選家系251個(gè)，單株1 201株[9]；2008年對(duì)獲得的馬尾松抗性候選家系（單株）進(jìn)行了嫁接，得到了馬尾松抗性候選無性系318個(gè)；2009～2014年，在國(guó)家林業(yè)公益性行業(yè)科研專項(xiàng)經(jīng)費(fèi)項(xiàng)目“抗松材線蟲病馬尾松種源及抗性育種技術(shù)研究”資助下，安徽省林科院又對(duì)獲得的馬尾松抗性候選無性系進(jìn)行了兩次人工接種松材線蟲測(cè)定，計(jì)算其生存率和健全率，并根據(jù)結(jié)果對(duì)無性系的抗性進(jìn)行了等級(jí)劃分，得到抗性指數(shù)為4、3、2和1的無性系分別有177、8、107和23個(gè)[10]。本試驗(yàn)以該項(xiàng)目選育出的抗性無性系為材料，進(jìn)行松材線蟲人工接種試驗(yàn)，分析不同抗性無性系接種后不同時(shí)間點(diǎn)體內(nèi)線蟲分布、數(shù)量的差異及癥狀表現(xiàn)的差異，初步探索馬尾松對(duì)松材線蟲病的抗性與松材線蟲遷移和繁殖的關(guān)系。

1 試驗(yàn)材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 植物材料

廣德20-5和廣德34-1是安徽省林科院選育出的抗松材線蟲病馬尾松無性系，廣德34-1抗性高于廣德20-5。兩個(gè)無性系于2008年嫁接，種植在合肥林業(yè)科技示范園。合肥林業(yè)科技示范園位于117°12′E，31°55′N，地處安徽省合肥市廬陽(yáng)區(qū)大楊鎮(zhèn)董鋪水庫(kù)北緣，屬暖溫帶季風(fēng)大陸性氣候，全年無霜期227 d，年平均氣溫15～15.7℃，年平均日照2 112 h左右，年平均降雨量986～1 300 mm，降雨主要集中在5～9月份。

1.1.2 松材線蟲材料

通過貝曼漏斗法從安徽省全椒縣瓦山林場(chǎng)在自然狀況下受松材線蟲病害致死的馬尾松枯死木中分離出“瓦山1號(hào)”松材線蟲株系。分離的松材線蟲于 25℃培養(yǎng)在長(zhǎng)滿灰葡萄孢霉菌（Botrytis cinerea）的PDA培養(yǎng)基上。

1.2 方法

將廣德20-5和廣德34-1無性系各6株平分為兩組，3株作為對(duì)照組，3株作為試驗(yàn)組。2015年9月，在每株植株上選取一枝直徑相近的當(dāng)年生新枝，截去頂梢并壓碎切口，使用移液器向?qū)φ战M切口注入100 μL蒸餾水，試驗(yàn)組則注入100 μL溶有6 000頭松材線蟲的蒸餾水。在接種后的第1、5和9 d對(duì)接種枝條進(jìn)行采樣，每次分別采兩個(gè)無性系對(duì)照組和試驗(yàn)組的1株植株。觀察接種枝條針葉的癥狀表現(xiàn)后，去掉針葉，以接種點(diǎn)為起點(diǎn)將枝條截為5段長(zhǎng)5 cm的莖段，收集接種點(diǎn)以下0～5 cm、10～15 cm和20～25 cm三節(jié)莖段，記為A、C和E。收集的莖段迅速放入冰盒中帶回實(shí)驗(yàn)室4℃保存。

在采集樣品時(shí)對(duì)接種松枝進(jìn)行觀察，檢查其生長(zhǎng)狀況和針葉顏色是否發(fā)生變化；并對(duì)采集回來的莖段進(jìn)行解剖，肉眼觀察接種引起的馬尾松組織中的病理變化。

采用貝曼漏斗法對(duì)采集的莖段樣品進(jìn)行松材線蟲分離。將解剖過的莖段包裹在兩層紗布中并放入連接有橡膠管的漏斗中，加入蒸餾水浸泡24 h，打開止水夾采集橡膠管底端濾液5 mL，并用解剖鏡對(duì)濾液中的松材線蟲進(jìn)行計(jì)數(shù)。

2 結(jié)果和分析

2.1 人工接種后癥狀表現(xiàn)的差異

就外部針葉癥狀看（表1），廣德34-1的試驗(yàn)組和兩個(gè)無性系的對(duì)照組植株在接種后的9 d內(nèi)針葉均為綠色，沒有出現(xiàn)失色的情況；而廣德20-5的試驗(yàn)組在接種松材線蟲后第9 d A段出現(xiàn)針葉失水變黃的癥狀。

解剖觀察莖段組織內(nèi)部情況（圖1），發(fā)現(xiàn)廣德20-5和廣德34-1的試驗(yàn)組和對(duì)照組都出現(xiàn)了髓心褐化的情況，即髓心由淺黃綠色轉(zhuǎn)為褐色。接種后第5 d兩個(gè)無性系的試驗(yàn)組和廣德34-1的對(duì)照組都出現(xiàn)了髓心褐化現(xiàn)象。其中廣德20-5的褐化程度最重，褐化范圍也最廣，達(dá)到C段；而廣德34-1的試驗(yàn)組和對(duì)照組褐化較輕，程度接近，且都只出現(xiàn)在A段。接種后第9 d，廣德34-1的試驗(yàn)組C段出現(xiàn)褐化現(xiàn)象，程度較輕，A段褐化加重超過對(duì)照。而此時(shí)，其余組的褐化程度都較第5 d加重。其中最嚴(yán)重的是廣德20-5的試驗(yàn)組，其A段髓心完全褐化，甚至皮層也出現(xiàn)褐化，其C段褐化也繼續(xù)加重。廣德20-5的試驗(yàn)組A段和C段的褐化程度都遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過此時(shí)廣德34-1試驗(yàn)組。整個(gè)過程中，兩個(gè)無性系對(duì)照組褐化范圍都只集中在A段，而試驗(yàn)組則都最終擴(kuò)展到了C段，褐化程度上試驗(yàn)組也都超過了各自對(duì)照組，同時(shí)廣德20-5試驗(yàn)組的褐化范圍擴(kuò)展速度和褐化程度也一直高于廣德34-1。

圖1 廣德20-5和廣德34-1中髓心褐化癥狀的發(fā)展

2.2 松材線蟲繁殖和遷移速度的差異

對(duì)采集的莖段樣品進(jìn)行線蟲分離計(jì)數(shù)，結(jié)果見表1。在廣德20-5中松材線蟲數(shù)量不斷增加，繁殖速度很快，線蟲總數(shù)由接種后第1 d的4條到第5 d和第9 d的14和137條，數(shù)量分別增加了2.5和34.25倍；而廣德34-1中松材線蟲數(shù)量在采樣時(shí)間內(nèi)一直維持在低水平，繁殖較慢，從接種后的第1 d 2條到第9 d的4條，線蟲只增加了一倍，中間第5 d甚至沒有松材線蟲檢出。松材線蟲在馬尾松體內(nèi)繁殖的同時(shí)向主枝方向擴(kuò)散，但在廣德20-5和廣德34-1中線蟲擴(kuò)散的速度不同。松材線蟲在接種后第1 d都只在兩個(gè)無性系的A段檢出，廣德20-5在C段檢出是接種后第5 d，而廣德34-1是第9 d，兩者E段檢出時(shí)間和各自C段相同，由此可見松材線蟲在廣德20-5中遷移更快。

表1 松材線蟲在廣德20-5和廣德34-1中的數(shù)量和分布

3 討論

（1）試驗(yàn)組和對(duì)照組在削頂接種線蟲后都出現(xiàn)了髓心褐化的現(xiàn)象，但試驗(yàn)組在褐化程度和范圍兩方面都超過對(duì)照組，說明松材線蟲在馬尾松無性系中的活動(dòng)會(huì)引起植物髓心褐化。劉軍民等[11]和陳玉惠等[12]也報(bào)道了松材線蟲接種引起馬尾松離體松枝和1年實(shí)生苗髓心褐化的現(xiàn)象。松材線蟲在植物體內(nèi)的活動(dòng)引會(huì)起植株輸水堵塞，水勢(shì)下降[13-14]，可能由此引起馬尾松髓心的失水褐化。本試驗(yàn)中對(duì)照組削頂接種蒸餾水后傷口未做處理，直接曝露于空氣中，出現(xiàn)接種點(diǎn)以下小范圍的髓心褐化現(xiàn)象，這說明了髓心褐化現(xiàn)象不僅會(huì)出現(xiàn)在接種了松材線蟲的馬尾松材料中，也會(huì)出現(xiàn)在接種蒸餾水且暴露傷口的馬尾松新枝中。而在陳玉惠等的試驗(yàn)中接種的切口敷有濕潤(rùn)的脫脂棉，保持了切口的濕潤(rùn)，空白對(duì)照則沒有出現(xiàn)褐化的現(xiàn)象。對(duì)比試驗(yàn)說明對(duì)照組的髓心褐化現(xiàn)象可能是由于接種枝曝露的傷口大量散失體內(nèi)水分引起的。

（2）分析廣德34-1和廣德20-5試驗(yàn)組的褐化癥狀發(fā)展和松材線蟲的數(shù)量和分布變化，可以看到兩個(gè)無性系髓心的褐化程度加重、褐化范圍擴(kuò)大的同時(shí)，體內(nèi)松材線蟲數(shù)量也增加、分布范圍也擴(kuò)大。在松材線蟲擴(kuò)散和褐化范圍擴(kuò)展方面，兩個(gè)無性系中松材線蟲擴(kuò)散到E段時(shí)，其髓心的褐化也分別擴(kuò)散到C段，褐化范圍的擴(kuò)展稍微滯后于線蟲的擴(kuò)散。在松材線蟲繁殖和褐化程度加重方面，廣德34-1體內(nèi)松材線蟲的數(shù)量一直維持在低水平，其褐化程度也比較接近其對(duì)照；而廣德20-5體內(nèi)隨著松材線蟲數(shù)量的不斷增加，其髓心褐化程度不斷加重，遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過其對(duì)照，最終在松材線蟲數(shù)量爆發(fā)增長(zhǎng)的第9 d時(shí)，其A段髓心和皮層徹底褐化，該段針葉也同時(shí)出現(xiàn)黃化[15]。不難看出，馬尾松髓心褐化范圍和程度與線蟲的遷移和繁殖有關(guān)，褐化的范圍隨著松材線蟲的擴(kuò)散而擴(kuò)大，但速度滯后于線蟲擴(kuò)散速度，同時(shí)髓心褐化的程度隨著松材線蟲數(shù)量增加而加重，直至髓心徹底褐化且針葉表現(xiàn)出失水黃化病征。

（3）松材線蟲在廣德34-1體內(nèi)的繁殖和遷移速度都比廣德20-5慢，說明相較廣德20-5，廣德34-1體內(nèi)一定存在著抑制松材線蟲繁殖和遷移的機(jī)制。通過這種相對(duì)的抑制，廣德34-1的褐化程度比廣德20-5低，褐化范圍擴(kuò)展也比廣德20-5慢，最終抑制了植物髓心褐化現(xiàn)象的迅速惡化，防止了針葉黃化癥狀的出現(xiàn)，表現(xiàn)出比廣德20-5高的松材線蟲病抗性。在黑松和赤松中也發(fā)現(xiàn)松材線蟲病抗性無性系與非抗性或感病無性系相比可以抑制松材線蟲的繁殖和遷移，從而抑制松材線蟲病病程的發(fā)展[16-17]，但其具體機(jī)制仍然沒有被明確揭示，有待進(jìn)一步的研究。

（4）本試驗(yàn)中馬尾松無性系廣德34-1在接種松材線蟲后表現(xiàn)出比廣德20-5高的抗性，這與它們6年前接受的兩次接種試驗(yàn)的綜合抗性評(píng)定結(jié)果相反。分析后認(rèn)為，造成抗性發(fā)生逆轉(zhuǎn)的原因可能有以下三個(gè)。首先是無性系樹齡的變化。在日本對(duì)黑松的松材線蟲病抗性育種研究中就發(fā)現(xiàn)，選育出的黑松抗性隨著樹齡增長(zhǎng)存在變化，且該抗性的變化在不同家系間具有差異性[18]，所以在廣德34-1的抗性可能后來居上超過廣德20-5。其次是接種線蟲的不同。6年前接種所使用的“廣朱3B”松材線蟲株系在多次繼代培養(yǎng)后繁殖力和致病力都急劇退化[19]，不再使用；本次試驗(yàn)采用的是“瓦山1號(hào)”株系。來自不同的地理位置的松材線蟲株系對(duì)馬尾松的致病性不同[20]，這也可能是造成兩次試驗(yàn)結(jié)果不同的原因。最后是本次接種試驗(yàn)采用樣本數(shù)量較少。因?yàn)?年前兩次接種試驗(yàn)存活下來的無性系數(shù)目有限，因此，本試驗(yàn)每個(gè)馬尾松無性系只對(duì)3株植株進(jìn)行了松材線蟲接種，由于個(gè)體的差異，其結(jié)果可能存在偏差，造成兩次的試驗(yàn)結(jié)果不同。最終是哪種或幾種原因造成兩個(gè)馬尾松松材線蟲病抗性無性系廣德34-1和廣德20-5抗性高低發(fā)生逆轉(zhuǎn)需要進(jìn)一步的驗(yàn)證。

[1]Kiyohara T.and Tokushige Y.Inoculation experiments of a nematode,Bursaphelenchus sp.onto pine trees[J].Journal of the Japanese Forestry Society,1971,53(7）:210-218.

[2]Mamiya Y.and Enda N.Transmission of Bursaphelenchus lignicolus(Nematoda:Aphelenchoididae）by Monochamus alternatus(Coleoptera:Cerambycidae） [J].Nematologica, 1972,18:159-162.

[3]Mamiya Y.Initial pathological changes and disease development in pine trees induced by the pine wood nematode,Bursaphelenchus xylophilus[J].Annals of the Phytopathological Society of Japan,1985,51(5）:546-555.

[4]孫永春.南京中山陵發(fā)現(xiàn)松材線蟲[J].江蘇林業(yè)科技，1982（4）：47，27.

[5]楊寶君，潘宏陽(yáng)，湯堅(jiān)，等.松材線蟲病[M].北京:中國(guó)林業(yè)出版社，2003.

[6]周政賢.中國(guó)馬尾松[M].北京:中國(guó)林業(yè)出版社，2001.

[7]楊寶軍，王秋麗，鄒衛(wèi)東，等.不同松樹品種對(duì)松材線蟲的抗性[J].植物病理學(xué)報(bào)，1987，17（4）：211-214.

[8]汪企明，吳禮才，楊寶君，等.馬尾松抗松材線蟲病的驗(yàn)證及黑松感病進(jìn)程[J].森林病史通訊，1992（4）：4-6.

[9]徐六一，戶田忠雄.馬尾松松材線蟲病抗性候補(bǔ)木的選拔及評(píng)價(jià)研究[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2006，34（17）：4303-4304.

[10]徐六一，章健，高景斌，等.馬尾松抗松材線蟲病候選無性系的抗病性測(cè)定[J].林業(yè)科技開發(fā)，2012，26（4）：27-30.

[11]劉軍民，馮志新.應(yīng)用水培馬尾松離體松枝接種觀察松材線蟲的致病過程[J].植物檢疫，1944，8（3）：145-146.

[12]陳玉惠，葉建仁，魏初獎(jiǎng).松幼苗和幼樹離體枝對(duì)松材線蟲侵染的反應(yīng) [J].南京林業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版），2005，29（3）:19-22.

[13]Fukuda K.and Suzuki K..Changes of water relation parameters in pine-wood nematode-infested Japanese red pine[J].Journal of the Japanese Forestry Society,1988,70（9）:390-394.

[14]Fukuda K.and Suzuki K..Water relation parameters of pine seedlings in pine wilt disease and water deficiency[J].Bulletin of the Tokyo University Forests,1988,（80）:25-35.

[15]Fukuda K.Physiological process of the symptom development and resistance mechanism in pine wilt disease[J]. Journal of Forest Research,1997,2（3）:171-181.

[16]Keiko K..Inhibiting factors of symptom development in several Japanese red pine.（Pinus densiflora）families selected as resistant to pine wilt[J].Journal of Forest Research,2004,9（3）:217-224.

[17]Dai K.,Takashi Y.,Hiroki I.,et al.Comparison of histological responses and tissue damage expansion between resistant and susceptible Pinus thunbergii infected with pine wood nematode Bursaphelenchus xylophilus[J].Journal of Forest Research,2014,19（2）:285-294.

[18]Kuroda,K.,Ohira,M.,Okamura,M.,et al.Migration and population growth of the pine wood nematode（Bursaphelenchus xylophilu） related to the symptom development in the seedlings of Japanese black pine（Pinus thunbergii）families selected as resistant to pine wilt[J]. Journal of the Japanese Forestry Society,2007,89（4）: 241-248.

[19]高景斌，戶田忠雄.多次繼代培養(yǎng)的松材線蟲分離種致病力變異的研究 [J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2006，34（13）：3106-3107，3109.

[20]楊寶君，胡凱基，王秋麗，等.松樹對(duì)松材線蟲杭性的研究[J].林業(yè)科學(xué)研究，1993，6（3）：249-255.

（責(zé)任編輯：楊婷婷）

Relationship between Symptom Development of Pinewood Nematodiasis and Migration and Reproduction of Pinewood Nematode in Pinus massoniana Clones with Different Resistance

PAN Ting,CHEN Xuelian,HAO Yanping,JIANG Chunwu,XU Liuyi
(Anhui Academy of Forestry,Hefei 230031,China)

In this paper,in order to explore the pinewood nematodiasis-resistance mechanism,7-year-old Pinus massoniana clones Guangde 20-5 and Guangde 34-1 with different nematodiasis resistance were selected and inoculated with 6 000 pinewood nematodes and an analysis was made on the symptom development,number and distribution of nematodes in the clones 1 d、5 d and 9 d after inoculation.The results showed that the nematode activities caused pith browning in both of the clones and needle withering in Clone 20-5,while the pith browning symptom was milder and spread more slowly in Clone 34-1 than in 20-5 and both the speeds of reproduction and migration of nematodes were slower in Clone 34-1.It showed that compared with Clone 20-5,Clone 34-1 could suppress internal reproduction and migration of nematodes and showed higher resistance to the symptoms induced by nematodes like pith browning and needle withering.

Pinus massoniana;Pine nematodiasis resistance;Migration;Reproduction;Pith browning

S763.3

A

2095-0152（2016）06-0013-04

016-08-29

2016-09-25

潘婷（1989-），女，研究實(shí)習(xí)員，研究方向：馬尾松松材線蟲病抗性育種。E-mail:pantene14@163.com的松材線蟲病給我國(guó)帶來了巨大的生態(tài)壓力和經(jīng)濟(jì)損失。據(jù)國(guó)家森防總站不完全統(tǒng)計(jì)，截止2015年，全國(guó)累計(jì)致死松樹5億多株，造成直接、間接經(jīng)濟(jì)損失約275億元。

松材線蟲病是由松材線蟲（Bursaphelenchus xylophilus）入侵引起的松樹萎蔫病[1]，松材線蟲通過松褐天牛（Monochamus alternatus）噬咬松樹幼嫩組織時(shí)產(chǎn)生的傷口進(jìn)入植物樹脂道[2-3]，以樹脂道薄壁細(xì)胞為食并進(jìn)行大量繁殖，沿著樹脂道遷移，引起植物失水，最終導(dǎo)致植株由冠層開始自上而下整株枯萎。

松材線蟲病對(duì)于松屬植物是毀滅性的，它能夠在短時(shí)間內(nèi)造成松樹大量死亡，有松樹“癌癥”之稱。目前松材線蟲主要分布在美國(guó)、加拿大、墨西哥、葡萄牙、日本、韓國(guó)和中國(guó)。自從1982年我國(guó)首次在南京中山陵黑松中發(fā)現(xiàn)松材線蟲病以來[4]，疫情迅速蔓延。根據(jù)中國(guó)林業(yè)網(wǎng)報(bào)告，到2015年我國(guó)內(nèi)地松材線蟲病疫區(qū)已經(jīng)達(dá)到187個(gè)，分布在江蘇、浙江、安徽、福建、江西、山東、河南、湖北、湖南、廣東、廣西、重慶、四川、貴州、云南和陜西，共計(jì)16省（市、自治區(qū)）。此外香港和臺(tái)灣也分別在1982年和1983年發(fā)現(xiàn)了松材線蟲病，現(xiàn)也已廣為分布[5]。大面積蔓延