肝素對氟尿嘧啶誘導(dǎo)的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞分泌IL-6、t-PA的影響

陳潤姣，張佳佳，王彥茹，林素蘭，吳蘭華，蔣 睿

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肝素對氟尿嘧啶誘導(dǎo)的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞分泌IL-6、t-PA的影響

陳潤姣，張佳佳，王彥茹，林素蘭，吳蘭華，蔣 睿

[目的]探討肝素對氟尿嘧啶(5-FU)誘導(dǎo)的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVECs)分泌IL-6、t-PA的影響。[方法]實(shí)驗(yàn)分為空白對照組、氟尿嘧啶組、肝素低濃度組、肝素中濃度組和肝素高濃度組，每隔24 h按照分組更換新鮮培養(yǎng)液，分別于孵育的第1天、第5天、第9天、第15天收集各組24 h上清液，采用酶聯(lián)免疫吸附雙抗體夾心分析法測定各組細(xì)胞上清液中的組織型纖溶酶原激活物(t-PA)和白細(xì)胞介素-6(IL-6)的含量。[結(jié)果]干預(yù)第5天、第9天和第15天，氟尿嘧啶組IL-6和t-PA的濃度與空白對照組比較有所升高(P<0.05)；干預(yù)第5天和第15天，高濃度肝素組IL-6、t-PA的分泌量較氟尿嘧啶組降低(P<0.05)。[結(jié)論]肝素可降低氟尿嘧啶誘導(dǎo)的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞IL-6、t-PA的分泌，對損傷后的血管內(nèi)皮細(xì)胞具有保護(hù)作用，肝素濃度以50 U/mL為宜。

肝素；氟尿嘧啶；人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞；組織型纖溶酶原激活物；白細(xì)胞介素-6

經(jīng)外周靜脈置入中心靜脈導(dǎo)管(peripherally inserted central catheter,PICC)是惡性腫瘤病人化療的理想輸液通路，被臨床廣泛應(yīng)用。但PICC置管后靜脈炎的發(fā)生率可達(dá)57.65%，40.7%的病人由于并發(fā)癥而不得不提前拔管[1]，影響病人治療方案的實(shí)施。PICC會引起血管內(nèi)膜損傷，受損的內(nèi)皮細(xì)胞將失去其抗血栓作用而導(dǎo)致炎癥反應(yīng)，炎癥又促進(jìn)血栓形成，形成惡性循環(huán)而導(dǎo)致血管堵塞。有臨床研究表明：在應(yīng)用套管針和中心靜脈導(dǎo)管時，封管液是保持導(dǎo)管通暢、防止導(dǎo)管阻塞、維持輸液通路的關(guān)鍵[2]。因此，正確選擇封管液是減少中心靜脈置管后血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷、血栓形成和靜脈炎發(fā)生的重要條件。目前臨床應(yīng)用的封管液不僅種類繁多，劑量也各異。肝素作為一種酸性黏多糖在體內(nèi)、體外應(yīng)用時均有強(qiáng)抗凝作用[3]，是臨床常用的封管液之一。但肝素對血管內(nèi)皮細(xì)胞的作用、血栓形成及靜脈炎影響的研究僅限于臨床觀察研究，且說法各異。本研究以體外培養(yǎng)的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVECs)為研究對象，觀察不同濃度的肝素稀釋液對氟尿嘧啶作用后HUVECs釋放組織型纖溶酶原激活物(t-PA)和白細(xì)胞介素-6(IL-6)的影響，探索肝素預(yù)防中心靜脈置管致靜脈炎的可能機(jī)制，找尋肝素保護(hù)內(nèi)皮細(xì)胞的較佳濃度和作用時間。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞、藥物及試劑 HUVECs細(xì)胞株購自江陰齊氏生物科技有限公司，胎牛血清購自美國Gibco公司，RPMI-1640培養(yǎng)基、胰蛋白酶、雙抗均購自美國Hyclone公司，白細(xì)胞介素-1(IL-1)、IL-6及t-PA試劑盒均購自武漢優(yōu)爾生科技股份有限公司，6孔板、96孔板購自美國康寧公司，氟尿嘧啶購自上海旭東海普藥業(yè)有限公司、肝素購自北京索萊寶有限公司。

1.1.2 儀器 HF 212UV二氧化碳培養(yǎng)箱、Thermo生物安全柜、Leica CTR6000倒置顯微鏡、酶標(biāo)儀Mode1680。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 將凍存的細(xì)胞株復(fù)蘇，加入含10%胎牛血清，5%青霉素/鏈霉素的M199培養(yǎng)液，放置于37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細(xì)胞長至80%～90%融合度時，以0.25%胰蛋白酶消化傳代，2代～3代用于實(shí)驗(yàn)。選擇對數(shù)生長期的細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃

度為1.0×105cells/mL,接種于96孔板中，每孔200 μL。待細(xì)胞生長至80%融合后，貼壁細(xì)胞隨機(jī)分為5組，每組3個復(fù)孔；倒置顯微鏡進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察并攝片。

1.2.2 實(shí)驗(yàn)分組 空白對照組：每孔加入200 μL的培養(yǎng)基孵育15 d；氟尿嘧啶組：每孔加入200 μL氟尿嘧啶濃度為25 mg/L的培養(yǎng)基孵育15 d；肝素組：①低濃度組為每孔加入200 μL肝素濃度為12.5 U/mL，氟尿嘧啶濃度為25 mg/L的培養(yǎng)基孵育15 d；②中濃度組為每孔加入200 μL，肝素濃度為25 U/mL，氟尿嘧啶濃度為25 mg/L的培養(yǎng)基孵育14 d；③高濃度組為每孔加入200 μL，肝素濃度為50 U/mL，氟尿嘧啶濃度為25 mg/L的培養(yǎng)基孵育15 d。培養(yǎng)液中每隔24 h加入上述不同濃度的肝素稀釋液，于孵育的第1天、第5天、第9天、第15天收集各組24 h上清液，-80 ℃凍存，待測。

1.2.3 HUVECs的形態(tài)觀察 分別于第1天、第5天、第9天、第15天，倒置相差顯微鏡觀察各組HUVECs的形態(tài)和數(shù)量變化。

1.2.4 酶聯(lián)免疫吸附雙抗體夾心法(ELISA)檢測內(nèi)皮細(xì)胞的炎性分子IL-6和t-PA濃度 分別將IL-6及t-PA標(biāo)準(zhǔn)品準(zhǔn)確復(fù)溶，用稀釋液做1.25次倍比稀釋，IL-6標(biāo)準(zhǔn)品濃度分別為6 ng/L、4 ng/L、2 ng/L、1 ng/L、0.5 ng/L，t-PA標(biāo)準(zhǔn)品濃度分別為12 ng/L、8 ng/L、4 ng/L、2 ng/L、1 ng/L。實(shí)驗(yàn)其余步驟嚴(yán)格按IL-6及t-PA蛋白測定試劑盒說明書操作。在450 nm波長處測得A值，以A450對應(yīng)抗原標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)量濃度，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，從標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出IL-6和t-PA濃度。

2 結(jié)果

2.1 HUVECs的形態(tài)觀察 在倒置相差顯微鏡觀察用不同方法培養(yǎng)的HUVECs，可見其形態(tài)均不規(guī)則?？瞻讓φ战M：HUVECs細(xì)胞的數(shù)目隨著時間的推移而增多，細(xì)胞稀疏呈梭形，隨著數(shù)目的增多，細(xì)胞密集，呈鋪路石樣外觀，細(xì)胞邊界清楚，胞漿豐富，胞核呈圓形或橢圓形，偶見雙核。氟尿嘧啶組: HUVECs細(xì)胞的數(shù)目隨著時間的推移而減少，細(xì)胞的間隙增寬,細(xì)胞收縮、變圓，細(xì)胞的邊界不清，部分細(xì)胞脫落。肝素組：低濃度肝素組為HUVECs細(xì)胞的數(shù)目隨著時間的推移而減少，細(xì)胞呈梭形，細(xì)胞邊界清楚，胞漿豐富，胞核呈圓形或橢圓形，偶見雙核；中濃度肝素組為HUVECs細(xì)胞的數(shù)目隨著時間的推移而減少，細(xì)胞形態(tài)同低濃度肝素組；高濃度肝素組為HUVECs細(xì)胞的數(shù)目隨著時間的推移而減少，細(xì)胞形態(tài)同低濃度肝素組。

2.2 不同培養(yǎng)方法對HUVECs釋放IL-6、t-PA的影響 不同時間3種濃度肝素組IL-6、t-PA分泌量比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。詳見表1。

表1 不同培養(yǎng)方法對HUVECs釋放IL-6、t-PA濃度的影響 ng/L

3 討論

PICC穿刺過程中執(zhí)行無菌技術(shù)不嚴(yán)格、穿刺技術(shù)不熟練、同一部位反復(fù)穿刺、置管時間過長等因素，可損傷血管內(nèi)膜或引起細(xì)菌感染，導(dǎo)致靜脈炎的發(fā)生。靜脈炎可分為機(jī)械性、化學(xué)性、細(xì)菌性及血栓性4種類型，特別是血栓性靜脈炎的發(fā)生，輕者可導(dǎo)致提前拔管，嚴(yán)重者可因血栓脫落而危及病人生命[4]。因此，正確選擇封管液是減少中心靜脈置管后血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷、血栓形成和靜脈炎發(fā)生的關(guān)鍵。目前，肝素稀釋液是臨床最常用的封管液，用以預(yù)防PICC所致并發(fā)癥的發(fā)生。臨床使用肝素稀釋液封管的最佳濃度眾說不一，差異較大，從1.00 U/mL～250.00 U/mL均有應(yīng)用[5-6]。本實(shí)驗(yàn)選擇的肝素分為3個濃度組：低濃度肝素組濃度為12.5 U/mL，中濃度肝素組濃度為25 U/mL，高濃度肝素組濃度為50 U/mL。各濃度組均能抑制HUVECs的炎癥反應(yīng)。

纖溶系統(tǒng)是防止血管內(nèi)形成的內(nèi)源性防御機(jī)制之一，其主要功能是清除沉淀于血管壁的纖維蛋白，溶解血凝塊，維持血流通暢，防止血栓形成[7]。t-PA是機(jī)體纖溶系統(tǒng)重要的組成部分。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，t-PA代表了從血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷到凝血纖溶激活的血栓前狀態(tài)的各個環(huán)節(jié)，是對血栓前狀態(tài)具有較高敏感性和特異性反應(yīng)的指標(biāo)[8]。IL-6對于血管炎性病變起著重要的調(diào)節(jié)作用，IL-6增強(qiáng)內(nèi)皮細(xì)胞黏附能力,還可以增加內(nèi)皮細(xì)胞的通透性，直接損傷內(nèi)皮細(xì)胞。IL-6是一種促炎癥細(xì)胞因子，循環(huán)中的IL-6是由許多細(xì)胞，包括激活的巨噬細(xì)胞和淋巴細(xì)胞分泌的誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞的趨化因子和粘附因子的表達(dá)、釋放[9]。

本研究結(jié)果顯示：與氟尿嘧啶組比較，給予肝素干預(yù)后第1天和第9天，僅中濃度肝素組IL-6分泌有所降低，而第5天和第15天3種濃度肝素干預(yù)后IL-6均降低，提示肝素可通過降低IL-6的分泌抑制靜脈內(nèi)皮細(xì)胞的炎癥反應(yīng)，對細(xì)胞有保護(hù)作用。此外，肝素干預(yù)后第1天，僅高濃度肝素組t-PA的分泌降低，第9天僅中濃度肝素組t-PA的分泌有所降低，而高濃度肝素組在干預(yù)第5天和第15天t-PA的分泌均降低。分析認(rèn)為氟尿嘧啶干預(yù)可能會增加t-PA的分泌量，增加血液的纖溶活性，高濃度肝素干預(yù)可抑制t-PA表達(dá)，使血液的纖溶活性降低，這與謝莉玲[4]的研究結(jié)果(在無禁忌病人中使用10 U/mL肝素稀釋液沖管和封管，可有效預(yù)防PICC置管期間血栓靜脈炎的發(fā)生)一致。本研究結(jié)果還顯示：不同時間3種濃度肝素組比較，IL-6和t-PA的分泌量比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，提示50 U/mL肝素濃度更適用于臨床應(yīng)用，這與劉玉芹等[10]的結(jié)論(腫瘤病人化療時靜脈留置針宜采用肝素鹽水封管，50 U/mL濃度肝素鹽水封管效果較好)一致。

本研究結(jié)果顯示：50 U/mL肝素可以降低氟尿嘧啶應(yīng)用后HUVECs的IL-6、t-PA的分泌，對損傷后的血管內(nèi)皮細(xì)胞可起到保護(hù)作用。

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(本文編輯崔曉芳)

Influence of heparin on secretion of IL-6 and t-PA of human umbilical vein endothelial cells induced by fluorouracil

Chen Runjiao,Zhang Jiajia,Wang Yanru,etal

(College of Nursing,Xinjiang Medical University，Xinjiang 830000 China)

2014年新疆醫(yī)科大學(xué)大學(xué)生創(chuàng)新項(xiàng)目，編號：CX2014032。

陳潤姣，本科，單位：830000，新疆醫(yī)科大學(xué)護(hù)理學(xué)院；張佳佳、王彥茹、林素蘭單位：830000，新疆醫(yī)科大學(xué)護(hù)理學(xué)院；吳蘭華單位：830000，新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院；蔣睿(通訊作者)單位：830002，新疆醫(yī)科大學(xué)第六附屬醫(yī)院。

R47

A

10.3969/j.issn.1009-6493.2016.36.015

1009-6493(2016)12C-4532-03

2016-02-18；

;2016-11-20)

引用信息 陳潤姣，張佳佳，王彥茹，等.肝素對氟尿嘧啶誘導(dǎo)的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞分泌IL-6、t-PA的影響[J].護(hù)理研究，2016，30(12C)：4532-4534.