微生物轉(zhuǎn)化去氫表雄酮生成7琢 15琢—二羥基雄烯醇酮的研究

蔣衛(wèi)敏

摘 要：7α，15α-二羥基雄烯醇酮是合成屈螺酮的重要中間體，應(yīng)用亞麻刺盤孢（Colletotrichum lini AS 3.4486）的羥化酶體系對去氫表雄酮（DHEA）底物進(jìn)行轉(zhuǎn)化，合成7α，15α-二羥基雄烯醇酮。文章采用平板篩選、投料方法、發(fā)酵過程的控制，在去氫表雄酮（DHEA）投料濃度10 g/L的條件下，轉(zhuǎn)化率可達(dá)80%以上，主要產(chǎn)物為7α，15α-二羥基雄烯醇酮。比原來的投料濃度有較大的提高。

關(guān)鍵詞：去氫表雄酮；亞麻刺盤孢；7α，15α-二羥基去氫表雄酮；微生物轉(zhuǎn)化工藝

中圖分類號：R977.1 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A 文章編號：1006-8937（2016）33-0211-03

1 概 述

隨著甾體化學(xué)的飛速發(fā)展，甾體激素類藥物已逐漸成為醫(yī)藥領(lǐng)域的重要門類。屈螺酮是一種高效、低毒、副作用小的新一代女用避孕藥。由于屈螺酮具有廣闊的市場前景，其前體化合物7α，15α-二羥基去氫表雄酮也受到廣泛關(guān)注。之前合成7α，15α-二羥基雄烯醇酮主要使用化學(xué)方法，由于化學(xué)法合成7α，15α-二羥基雄烯醇酮步驟繁瑣，產(chǎn)物收率低，對人和環(huán)境影響大。

20世紀(jì)70年代德國先令首先將生物轉(zhuǎn)化法用于屈螺酮的合成，利用微生物的羥化酶體系，在去氫表雄酮的C7和C15位引入羥基，得到7α，15α-二羥基去氫表雄酮，再經(jīng)化學(xué)法合成屈螺酮。使用微生物法引入羥基縮短了屈螺酮的合成路線，但其轉(zhuǎn)化效率較低。目前對去氫表雄酮轉(zhuǎn)化效率比較高的菌株主要來自Colletotrichum lini屬，但高濃度的DHEA對具有菌種具有毒害作用，因此尋找耐受性強(qiáng)、轉(zhuǎn)化率高、生命力強(qiáng)的菌種非常重要。

由于絲狀真菌的細(xì)胞壁成份復(fù)雜，直接以孢子或菌絲進(jìn)行誘變比較難。本實(shí)驗(yàn)通過孢子稀釋培養(yǎng)篩選生長速度快的菌種，選擇加料溶劑、以及添加表面活性劑和各種轉(zhuǎn)化條件的控制，達(dá)到最佳培養(yǎng)條件以提高投料濃度和轉(zhuǎn)化率。

2 材料與方法

2.1 菌 種

亞麻刺盤孢由本實(shí)驗(yàn)室保存

2.1.2 培養(yǎng)基

斜面培養(yǎng)基PDA（g/L）：土豆200，葡糖糖20，瓊脂20，pH自然

種子（發(fā)酵）培養(yǎng)基（g/L）：葡糖糖30，玉米漿10，磷酸二氫鉀1，磷酸氫二鉀2，硫酸鎂0.244，泡敵適量

2.1.3 試 劑

DHEA，7α，15α-二羥基去氫表雄酮，7α-羥基去氫表雄酮由本實(shí)驗(yàn)室分離制備。培養(yǎng)基各種營養(yǎng)成分購置上海試劑公司，投料使用的各種溶劑為工業(yè)級，分析使用試劑均為分析純。

2.1.4 使用儀器

菌種培養(yǎng)箱（上海博訊實(shí)業(yè)有限公司SPX-150B-Z型），恒溫?fù)u床（上海世平的SPH-211C），臺式離心機(jī)（TGL-16C高速離心機(jī)），立式電熱壓力蒸汽滅菌鍋（上海申安LDZX-75KBS），菌種保藏（杭州華日電冰箱股份有限公司），超凈工作臺（蘇州凈化有限公司），顯微鏡， 高效液相色譜。

2.2 試驗(yàn)方法

2.2.1 生長速率快菌種篩選

PDA培養(yǎng)基的配置，土豆去皮稱取200 g，切成小塊置燒杯中加水1 000 ml，煮沸5～10 min，用紗布濾去土豆塊，加水補(bǔ)充蒸發(fā)水分，加入20克葡萄糖和20克瓊脂溶解，分裝滅菌。滅菌之后均勻的傾到于平皿，冷卻凝固，28 ℃培養(yǎng)2天備用。取保存菌種用無菌水洗下孢子，吸取1 ml加入到裝有9 ml無菌水的試管中，為101，混合均勻之后按同樣方法稀釋，直至1010，取104～108每級涂布5個平皿，29 ℃培養(yǎng)。

2.2.2 生長速度快菌株的擴(kuò)培

選擇平皿中生長速度快，顏色深的菌落，擴(kuò)培到茄形瓶中，29 ℃培養(yǎng)，待種子成熟之后，保存于冰箱。

2.2.3 孢子懸浮液的培養(yǎng)

將無菌水加入亞麻刺盤孢霉菌茄形瓶保藏培養(yǎng)基中，用接種環(huán)輕輕刮取表層孢子，將洗下的孢子懸浮液置于無菌的盛有玻璃珠的三角瓶內(nèi)，打散孢子懸浮液約20 min。用血球計(jì)數(shù)板計(jì)算孢子懸浮液的濃度。將計(jì)數(shù)后的懸浮液于4 ℃冰箱內(nèi)保藏。盡量保證優(yōu)化過程中每瓶菌種生長狀態(tài)一致。

2.2.4 亞麻刺盤孢生長曲線的測定

采用過濾法測定菌體的生物量。取24個容量為500 ml的搖瓶，注明培養(yǎng)時(shí)間，分別準(zhǔn)確加入100 ml種子培養(yǎng)液，120 ℃滅菌30 min。接種前置無菌室開紫外燈30 min，向每瓶培養(yǎng)基中分別加入1 ml孢子懸浮液，29 ℃、160 rpm/min培養(yǎng)。

從開始培養(yǎng)每隔4 h取2瓶，用恒重的濾紙抽濾菌體，至真空抽不在滴水，棄去濾紙稱其重量即為菌體的重量。取2瓶的平均值，以時(shí)間為橫坐標(biāo)，菌體量為縱坐標(biāo)，得到亞麻刺盤孢的生長曲線。

2.2.5 種子液的培養(yǎng)

按種子培養(yǎng)基配方配置種子培養(yǎng)基，分裝于500 ml搖瓶中，每瓶裝200 ml ， 塞紗布之后包牛皮紙，120 ℃滅菌30 min，冷卻。

無菌條件下接種亞麻刺盤孢。

29 ℃、160 rpm/min培養(yǎng)。

2.2.6 投料前培養(yǎng)

按發(fā)酵培養(yǎng)基配方配置發(fā)酵培養(yǎng)基，分裝于500 ml搖瓶中，每瓶裝200 ml，塞紗布之后包牛皮紙，120 ℃滅菌30分鐘，冷卻。待種子液生長到一定間段，且生長良好，無雜菌。在無菌條件下將種子液按10%的量移種到發(fā)酵培養(yǎng)基中，置搖床29 ℃180 r/min培養(yǎng)。

2.2.7 投料時(shí)間的確定

移種之后，由生長曲線觀察，觀察菌絲生長良好，鏡檢無雜菌，分別在對數(shù)生長期、穩(wěn)定前期、穩(wěn)定中期、穩(wěn)定后期、衰亡期投料。底物用溶劑（水、甲醇、乙醇、DMF）混合投料。

2.2.8 投料量的確定

分別考察投料量為2 g/l、4 g/l、6 g/l、8 g/l、10 g/l、12 g/l、14 g/l。每個投料量考察2個搖瓶。

2.2.9 投料溶劑及倍率的考察

分別考察溶劑為水、甲醇、乙醇、DMF。選擇最優(yōu)條件后，考察不同倍率投料，

2.2.10 分析方法

發(fā)酵液混合均勻，取1 ml發(fā)酵液離心，棄去上清，菌絲加入乙酸乙酯，萃取離心取上清檢測。檢測方法采用高效液相色譜（HPLC）檢測DHEA、7α-OH-DHEA、7α，15α-二羥基去氫表雄酮的濃度。

Agilent C18柱，流動相乙腈：水=7：3，柱溫30 ℃，檢測波長206，進(jìn)樣量為10微升，流速0.5 ml/min.產(chǎn)物計(jì)算方法=7α，15α-二羥基去氫表雄酮峰面積/DHEA、7α-OH-DHEA、7α，15α-二羥基去氫表雄酮峰面積。

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析

3.1 菌種篩選

由于菌種生長時(shí)間較長，培養(yǎng)基滅菌之后倒于平皿之時(shí)，需要稍微增加平皿中種子培養(yǎng)基的量，以保證培養(yǎng)后期培養(yǎng)基不會因缺水開裂。

菌種篩選過程簡單，但工作量大，且不能保證篩選的菌種能夠長期穩(wěn)定的遺傳，需要不斷的進(jìn)行篩選，待選擇最佳的培養(yǎng)菌種為止。

3.2 菌體生長曲線的測定

制備亞麻刺盤孢孢子懸浮液，接種至種子培養(yǎng)基中搖瓶培養(yǎng)。通過不同培養(yǎng)時(shí)間的菌絲體稱重，計(jì)算生物量，以培養(yǎng)時(shí)間為橫坐標(biāo)，菌體量為縱坐標(biāo)，得到生長曲線如圖1所示

由圖1觀察得到，亞麻刺盤孢生長基本呈現(xiàn)潛伏期、對數(shù)期、穩(wěn)定期和衰亡期的趨勢。接種后（0）-（6）h為菌體生長潛伏期，（6）-（18）為對數(shù)生長期，（18）-（36）為穩(wěn)定期，（36）達(dá)到最大生物量為31 g/L，之后進(jìn)入衰亡期。

3.3 投料時(shí)間的確定

選擇在不同時(shí)期投料，取樣檢測至底物不在消耗為止。以投料時(shí)期為橫坐標(biāo)，轉(zhuǎn)化率為縱坐標(biāo)，如圖2所示

如圖2所示，選擇在對數(shù)中后期菌體生長12 h左右投料較佳，轉(zhuǎn)化率可達(dá)80%，加底物后繼續(xù)轉(zhuǎn)化培養(yǎng)至發(fā)酵結(jié)束。最優(yōu)選擇為生長至12 h投料。

3.4 不同投料溶劑的影響

甾體微生物轉(zhuǎn)化的一個主要問題是底物和產(chǎn)物在水溶液中的溶解度較低，且底物會被析出產(chǎn)物包裹，影響底物和菌種的接觸，限制最終的轉(zhuǎn)化。使用溶劑加吐溫投料不但可以使底物在水溶液中的溶解度變大，而且溶劑能夠增加菌體細(xì)胞膜的通透性，使底物和酶系更容易接觸。

實(shí)驗(yàn)中使用水、甲醇、乙醇、DMF等生產(chǎn)中比較常見的溶劑?？瞻讓φ諡椴患尤軇?，以溶劑為橫坐標(biāo)，轉(zhuǎn)化率為縱坐標(biāo)得到如圖3所示。

以不同溶劑投料，可得到最優(yōu)溶劑為DMF其轉(zhuǎn)化率達(dá)81%，這是由于物料在DMF中溶解性大，DMF本身對菌體的毒害性較小，故其轉(zhuǎn)化效果更好，而甲醇與乙醇對菌體有一定的毒害性，會影響菌體生長，水做溶劑時(shí)原料溶解性較差不能有效的與菌絲體接觸。

3.5 不同投料濃度的影響

選擇不同投料量，以投料量為橫坐標(biāo)，轉(zhuǎn)化率為縱坐標(biāo)作圖。得到如圖4所示，最優(yōu)選擇為10 g/L，轉(zhuǎn)化率達(dá)84%。投料濃度越低轉(zhuǎn)化率越高，但投料濃度過低，降解很嚴(yán)重，最后產(chǎn)物也被降解了，收率比較低。當(dāng)投料量達(dá)到10 g/L時(shí)候，通過加入表面活性劑等方法仍然可以達(dá)到轉(zhuǎn)化80%以上。

當(dāng)投料量過大時(shí)，底物會抑制菌體生長，且對酶有抑制作用；而且過多底物會在發(fā)酵液中結(jié)團(tuán)存在，導(dǎo)致菌絲體無法利用底物；底物轉(zhuǎn)化為產(chǎn)物后析出由于發(fā)酵液中底物濃度過高，產(chǎn)物就會在包裹底物形成顆粒，影響轉(zhuǎn)化。

3.6 投料溶劑倍率考察

選擇投料溶劑為DMF，依次選擇比例為0、1%、2%、3%、4%、5%（按照裝液量計(jì)算）。每批次2個搖瓶。500ml帶刺三口瓶裝液量100ml，以溶劑量為橫坐標(biāo)，轉(zhuǎn)化率為縱坐標(biāo)做圖。如圖5所示。

最優(yōu)選擇為2%，轉(zhuǎn)化率達(dá)83%。雖然DMF的溶解性較大且毒性較小，但當(dāng)溶劑量過少時(shí)仍有部分底物未溶解，造成轉(zhuǎn)化未完全；但溶劑量過大時(shí)，也會對菌絲體造成損傷，不利于菌絲體生長及轉(zhuǎn)化。

4 結(jié) 語

通過一系列的條件考察，我們最終以葡糖糖30，玉米漿10，磷酸二氫鉀1，磷酸氫二鉀2，硫酸鎂0.244，泡敵適量（不起泡沫即可）為培養(yǎng)基，最優(yōu)培養(yǎng)條件為：種子培養(yǎng)條件29℃，

160 rpm/min，發(fā)酵培養(yǎng)條件29 ℃，180 rpm/min，最優(yōu)轉(zhuǎn)化條件為：種子培養(yǎng)30～36 h，發(fā)酵培養(yǎng)為10%移種量培養(yǎng)12～18 h，生長良好，無雜菌使用2倍DMF投料。最終通過亞麻刺盤孢轉(zhuǎn)化DHEA生成目標(biāo)產(chǎn)物轉(zhuǎn)化率可達(dá)80%以上。且工藝穩(wěn)定，通過比例放大驗(yàn)證工藝可行，適用于大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)。

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