顯微外科血管插管模型中的小鼠福利倫理關懷

谷元亮， 周 琪， 林夏露， 王 欣， 周 飛， 趙進順， 鄒寶波

(寧波大學 醫(yī)學院， 浙江 寧波 315211)

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·實驗室環(huán)境與安全·

顯微外科血管插管模型中的小鼠福利倫理關懷

谷元亮， 周 琪， 林夏露， 王 欣， 周 飛， 趙進順， 鄒寶波

(寧波大學 醫(yī)學院， 浙江 寧波 315211)

小鼠顯微外科血管插管手術模型是一種用途廣泛的實驗研究模型，與體外細胞實驗相比，更接近人體的實際狀況。但在動物模型制作與使用過程中，應充分考慮實驗動物的福利倫理，決不可因為動物實驗的不可替代性而忽視動物的福利倫理。該文就制作與使用該模型實驗過程中，如何使小鼠享有充分的福利倫理關懷進行了闡述，目的是促進動物實驗福利倫理的改善，以便更好地推動小鼠血管插管顯微外科手術模型在生物醫(yī)學中的正確應用。

血管插管模型； 福利倫理關懷； 小鼠； 顯微外科

0 引 言

在現(xiàn)代生命科學研究中，動物實驗往往是不可替代的。在對人的各種生理現(xiàn)象和病理機制的研究中，大多都需要借助動物實驗加以闡明或證實。有人統(tǒng)計，生物醫(yī)學科研課題中，有60%以上需要動物實驗。動物實驗在整個生物醫(yī)學發(fā)展的歷程中有舉足輕重的作用，如早在1912年，Carrel通過動物實驗[1]開創(chuàng)了血管與器官移植研究，并因此獲得諾貝爾生理學與醫(yī)學獎。近年來，動物顯微外科活體模型技術的逐步成熟，進一步推動了實驗外科向更高更深層次的發(fā)展。

在既往的顯微外科手術模型研究中，實驗往往采用大型動物(如豬、狗、兔等)，利用大鼠制作動物模型的也有許多報道。但是，由于大動物價格相對昂貴以及純系品種來源困難等，大大限制了其推廣應用。近年來，小鼠由于具有品系較純、來源廣、價格便宜、免疫學檢測方便，且其在食物結構、生理生化和發(fā)育過程與人類較為接近，基因和人類基因有大于80%的同源性等諸多優(yōu)點，被廣泛應用于制作顯微外科手術模型。

小鼠顯微外科血管插管活體手術模型是一種用途廣泛的實驗研究模型。目前，國外研究機構已經(jīng)開始采用該模型進行諸多方面的醫(yī)學實驗研究[2-12]，國內也已經(jīng)開始有該手術實驗模型技術建立和應用的研究報道[13-14]。但在該活體動物模型的制作和實驗中，采取的外科操作必然對正常組織結構、生理功能產(chǎn)生影響，如炎性反應、出血、創(chuàng)傷、疼痛等。另外，若粗暴地對待動物，動物的心理和生理都會處于不正常的應激狀態(tài)。這些反應既會干擾動物實驗結果，也與生命倫理學尊重、行善、不傷害和公正對待動物的福利倫理原則相沖突。

本文就小鼠血管插管顯微外科活體手術模型建立與實驗過程中的福利倫理關懷進行簡述，以促進動物實驗福利倫理的改善，確保該技術模型在動物實驗中的正確應用。

1 小鼠血管插管顯微外科手術模型的種類及應用

常用的手術模型有股動、靜脈血管插管手術模型，頸動、靜脈血管插管手術模型等。這種活體動物模型是模擬人體活體環(huán)境，讓動物在清醒、自由活動與進食的狀態(tài)下，通過靜脈插管及動脈插管采集血樣檢測各種因素的動態(tài)變化。因此，該模型在生理、病理、器官移植、藥物代謝及毒理學等研究領域中用途廣泛。

目前，應用該模型進行營養(yǎng)與代謝的研究比較多。如Hanaya等[3]應用STOP KO小鼠在股動、靜脈插管后3h，研究小鼠大腦對糖的利用；Levitt等[4]利用股、動靜脈插管模型研究糖刺激對人類胰腺β細胞的增殖作用；Pascoe等[5]用該模型研究游離脂肪酸對糖刺激胰腺β細胞增殖的抑制作用；Alonso等[6]在小鼠自由活動狀態(tài)下，研究糖刺激下的胰島素敏感性、胰島素分泌及其分泌指數(shù)。Lee等[7]通過該模型研究間歇性缺氧對糖代謝的影響。另外也有進行毒物的毒性研究，如Woodske等[8]利用股動、靜脈插管研究LPS的毒性作用，以及高胰島素血癥預測高血糖的嚴重性。也有進行藥物代謝研究的報道，Rippe等[9]報道用股動脈與頸靜脈插管建立的腹腔透析模型研究高分子腹膜清除時的基礎腹膜轉運影響因子；Rodriques等[10]、Lataro等[11]使用小鼠進行心血管的動力學研究；Ferl等[12]在注入F-FDG掃描藥劑后從股動脈采樣60 min連續(xù)采血15次，研究血漿的數(shù)據(jù)效應曲線。

由此可見，利用該活體動物模型，通過對藥物、毒物或營養(yǎng)物等在體內的代謝、生理和病理作用的動態(tài)觀察，可以探索人類疾病的發(fā)病機理、藥物的作用機制、疾病預防的效果等。

2 維護實驗動物福利倫理的重要性

作為一名生物醫(yī)學工作者，必須清醒的認識到，維護實驗動物福利倫理是人類進步和社會發(fā)展的必然結果。我們在不斷通過動物實驗為生命科學發(fā)展和人類健康提供更多更有益成果的同時，必須積極采納動物保護主義者的合理意見，通過科學、高效、經(jīng)濟的方法和人道主義原則，不斷改進和提高研究方法和質量，盡量減少實驗動物的數(shù)量，減輕實驗動物的痛苦，維護實驗動物應有的福利倫理。

盡管實驗動物是一群不會說話的生靈，它們沒有能力去維護自身的生存權力和利益，但它們也是有感覺的生命實體。它們有享受快樂、回避痛苦和恐懼的需求，人類有責任與義務去尊重、善待它們，而落實到行動中就是要重視和維護實驗動物福利。

國際上普遍承認的動物福利倫理原則是享受“五大自由”[15]，即：免于饑渴的自由；免于不適的自由；免于疼痛、傷害和疾病的自由；表達正常天性的自由；免于恐懼與憂傷的自由。也就是說，在飼養(yǎng)管理和使用實驗動物活動中，必須采取有效措施，保證實驗動物能夠受到良好的管理與照料，為其提供清潔、舒適的生活環(huán)境，提供保證健康所需的充足的食物、飲用水和空間，使實驗動物減少或避免不必要的傷害、饑渴、不適、驚恐、疾病和疼痛。

維護實驗動物福利并不是排斥動物實驗，而是體現(xiàn)在進行實驗的過程中對這些動物進行全方面的關愛和呵護。保證為人類做出貢獻和犧牲的實驗動物在康樂的狀態(tài)下生存，在無痛苦的狀態(tài)下死亡。盡可能為它們提供舒適的環(huán)境、標準營養(yǎng)的飼料和清潔的飲用水，做好疾病的預防保健與診治，讓它們免受各種額外的痛苦，保持身心愉悅，享受生存的樂趣。3R原則也是國際上公認的改善實驗動物福利的重要內容，特別對避免諸如毒性實驗、人類疾病動物模型等給動物造成的傷害尤為重要。動物倫理福利不僅能保證實驗動物身心健康，同時也能保證研究結果客觀、準確、真實、科學、可靠。

在小鼠顯微外科插管活體手術模型的制作和應用中，由于存在麻醉、手術、術后活體給藥、活體病理生理反應觀察記錄、動物飼養(yǎng)等諸多環(huán)節(jié)，這些環(huán)節(jié)都會涉及到動物的福利倫理。因此，做好動物的福利倫理關懷，對于正確使用該模型和確保得到正確的實驗結果都是十分重要的。

3 充分保障動物的福利倫理

近年來，小鼠活體血管插管顯微外科技術已經(jīng)在藥物代謝、糖尿病與肥胖機理研究中得到了應用[3-8]。鑒于該類模型動物是在清醒、自由活動與進食狀態(tài)下進行的連續(xù)動態(tài)實驗，手術的麻醉方式、手術過程中的失血量多少、手術中的保暖措施、手術過程中的無菌技術、手術所用的導管粗細及材料等均可以對實驗結果產(chǎn)生影響。另外，在實驗期間實驗動物的福利保障，也直接影響到實驗動物日常的生理指標。保障動物福利也是優(yōu)化實驗數(shù)據(jù)，保證其完整與準確性的重要因素。

作者在美國從事小動物顯微外科模型制作多年，回國后繼續(xù)從事實驗動物管理工作，有多年制作小鼠顯微外科活體動物模型經(jīng)驗。完成了多系統(tǒng)，多器官模型的制作，并建立了多種實驗動物模型。使用的小鼠種類也很多，如C57BL/6、BALB/c、ICR、SCID等?，F(xiàn)就建立小鼠血管插管顯微外科活體手術模型中，實驗小鼠應該享有的福利進行簡介，以期對相關工作者有所借鑒。

3.1 手術前的準備要充分

建立小鼠血管插管手術模型是利用顯微外科技術在小鼠動、靜脈血管分別置入一根很細的塑料軟管，兩管在頸背部固定后與自動給藥系統(tǒng)連接。該模型通過靜脈插管給予研究因素，動脈插管采集血樣，檢測各種因素的動態(tài)變化。因為手術精細，熟練的手術人員也需要1 h左右才能完成1例手術。由于手術時間長，手術前的準備工作就顯得更為重要。就像醫(yī)生給病人做手術，充分術前準備，可以減少手術中的忙亂，縮短手術時間，減少動物的痛苦，利于手術后的小鼠盡快恢復，這是保障本實驗成功的前提條件。

手術中使用的器械與物品要按其特點選用不同的消毒方法，如手術器械使用熱力消毒，塑料血管插管選用環(huán)氧乙烷消毒，手術后的自動給藥系統(tǒng)用含氯消毒液與75%乙醇處理等等。嚴格按規(guī)定配置手術中使用的抗菌素、肝素、去痛劑、麻醉劑及生理鹽水等。由于血管插管手術模型是將動物血液與外界系統(tǒng)連接，因此在配置各種液體的過程中必須嚴格無菌技術，避免污染配置液體，從而大大減少手術中與手術后小鼠的感染機會，減少了實驗動物的痛苦。

3.2 手術中的操作要輕柔

外科手術是一門熟能生巧的技術，每一個步驟，每一處細節(jié)都要經(jīng)歷細致的培訓和精確的操作。在手術前除了進行必要的撫摸安撫，還要為它們注射麻醉藥(或吸入麻醉)，并確保麻醉到位。在具體手術操作過程中，手術人員在實驗開始前要充分了解實驗動物的生理結構，熟練掌握抓取、注射、取樣、測量等操作技巧，應遵循“溫和保定，善良撫慰，減少痛苦和應激反應”的原則，使對動物身體的強制性限制減少到最低程度。在進行備皮、游離血管、傷口縫合這些操作的時候，應盡最大的可能減少動物承受的痛苦。

另外，在手術中要盡量減少出血，嚴格無菌技術操作，防止傷口與血液系統(tǒng)感染。由于手術時間長，手術過程中動物的保溫也很重要。將麻醉后的小鼠固定在37℃恒溫床上進行手術，可以預防手術期間動物的體溫下降，有利于其手術后的盡快康復。

3.3 手術后的護理與安樂死

為減少小鼠手術后的疼痛與感染，手術后連續(xù)2 d給予鎮(zhèn)痛、消炎處理。手術后的小鼠動、靜脈插管與自動給藥系統(tǒng)連接，通過插管持續(xù)的輸入肝素以保持動、靜脈插管的暢通。因此，手術后的自動給藥系統(tǒng)與血管插管應該連接緊密，更換液體時要嚴格無菌技術，以防止小鼠血液系統(tǒng)的感染。手術后的小鼠放置在單籠中飼養(yǎng)，由于使用旋轉臂固定插管，小鼠可以在飼養(yǎng)籠中自由運動、進食，充分保障了動物的福利倫理。手術2 d后，動物進入實驗階段，取血與給藥必須在沒有驚嚇、痛苦的狀態(tài)下完成的。

實驗結束后，對實驗動物采用吸入性麻醉實施安樂死。處死動物場所要遠離其他動物，以避免動物產(chǎn)生心理恐懼。動物死亡后，放置在專用的塑料袋中存放在專用的冰柜中，由專業(yè)部門統(tǒng)一回收焚燒處理。

3.4 在動物實驗過程中倫理委員會的作用

在美國，對涉及動物實驗研究項目的倫理審查已經(jīng)形成一種制度，明文規(guī)定未經(jīng)倫理委員會審查的項目不準立項，未提交倫理審查報告的論文不能發(fā)表，未通過倫理審查的新技術不得應用。倫理委員會的審查工作獨立、透明、公正、科學、民主，不受利益沖突的影響。審查時他們考慮以下要素：研究資質、實驗設施和條件；研究者是否在廣泛收集數(shù)據(jù)的基礎上精心設計了實驗方案；肯定沒有其他替代方法或更好的選擇；使用了最少的動物和最合適的動物種類；動物被飼養(yǎng)在較好的環(huán)境中；使用了合適的麻醉、鎮(zhèn)痛方式；對實驗動物的處置方法恰當?shù)鹊取惱砦瘑T會有跟蹤審查的責任和權力，對所有批準的項目進行監(jiān)督檢查。作者在匹茲堡大學醫(yī)學中心工作期間，實驗室被特別批準有飼養(yǎng)小鼠與制作小鼠動物模型的權利。匹茲堡大學實驗動物中心每周派專人到實驗室檢查動物飼養(yǎng)與使用情況，并利用“哨兵鼠”每月檢查小鼠飼養(yǎng)環(huán)境是否合格。如發(fā)現(xiàn)有異常情況，他們立即反饋。因此，實驗室負責人及所有實驗人員，人人都自覺遵守動物實驗的相關規(guī)定，否則倫理委員會有權暫?；蚪K止實驗。一旦被停止動物實驗，這個實驗室在3～4年后才有權利再次申請動物實驗，手續(xù)繁瑣且時間長?？梢?，美國動物實驗倫理委員會的審查與跟蹤不是只停留在制度和形式上，而是在保護實驗動物福利倫理中發(fā)揮真正有效的作用。

4 展 望

在醫(yī)學研究飛速發(fā)展的今天，新的藥物和食物不斷研制成功，新的毒物或潛在的毒物也在不停的產(chǎn)生。為了確保人類的健康與安全，研究者需要通過活體動物模型對藥物、毒物，營養(yǎng)物等在體內的代謝、生理和病理作用進行動態(tài)連續(xù)觀察，以探索人類疾病的發(fā)病機理、藥物的作用機制、疾病預防的效果等。由于小鼠與人類基因的同源性及其研究價格的低廉，利用小鼠制作活體顯微外科手術模型將成為一種趨勢，在醫(yī)學研究領域中必將得到廣泛應用。但在進行動物實驗的過程中必須充分考慮實驗動物的福利倫理關懷。不能因為動物實驗對生物醫(yī)學的重要性而不受生命倫理學的監(jiān)督和限制，當然，也不能因為動物的福利倫理而完全禁止動物實驗。在創(chuàng)造良好的實驗倫理環(huán)境下，讓生物醫(yī)學研究與倫理道德文明同步、協(xié)調和諧發(fā)展。

為做到科學、人道地實驗，應充分利用已有的數(shù)據(jù)，優(yōu)化設計實驗程序、技術和方法，避免重復實驗。在符合科學的前提下盡可能使用替代方法，減少活體動物的使用。整個實驗應確保用最少的動物獲得最多的科學研究結果。

有專家建議[16]，國家相關部門應該盡快將分散在各單位、課題組和個人手中的大量的動物實驗數(shù)據(jù)收集起來，運用現(xiàn)代信息處理技術分門別類地進行整理、加工、存儲和開發(fā)利用，建立實驗動物資源數(shù)據(jù)庫，通過網(wǎng)絡實現(xiàn)動物實驗數(shù)據(jù)的資源共享，以避免不必要的動物實驗，減少實驗動物的使用數(shù)量。

[1] Carrel A.Results of the permanent intubation of the thoracic aortia [J].Surg Gynecol Obstet,1912,15(3):245-248.

[2] Yue X, Yu H, Lin X,etal. Investigation into the optimal surgical conditions for coronary artery ligation for establishing a myocardial infarction model in mice[J]. Exp Ther Med, 2013,6(2):341-346.

[3] Hanaya R, Koning E, Ferrandon A,etal. Deletion of the STOP gene, a microtubule stabilizing factor, leads only to discrete cerebral metabolic changes in mice[J]. Neurosci Res, 2008, 86(4):813-820.

[4] Levitt H E, Cyphert T J, Pascoe J L,etal. Glucose stimulates human beta cell replication in vivo in islets transplanted into NOD-severe combined immunodeficiency (SCID) mice[J]. Diabetologia, 2011, 54(3):572-582.

[5] Pascoe J, Hollern D, Stamateris R,etal. Free fatty acids block glucose-induced β-cell proliferation in mice by inducing cell cycle inhibitors p16 and p18[J]. Diabetes, 2012, 61(3):632-641.

[6] Alonso L C, Watanabe Y, Stefanovski D,etal. Simultaneous Measurement of Insulin Sensitivity, Insulin Secretion, and the Disposition Index in Conscious Unhandled Mice[J]. Obesity, 2012, 20(7):1403-1412.

[7] Lee E J, Woodske M E, Zou B,etal. Dynamic arterial blood gas analysis in conscious, unrestrained C57BL/6J mice during exposure to intermittent hypoxia[J]. J Appl Physiol, 2009, 107(1):290-294.

[8] Woodske M E, Yokoe T, Zou B,etal. Hyperinsulinemia predicts survival in a hyperglycemic mouse model of critical illness[J]. CritCare Med, 2009, 37(9):2596-2603.

[9] Rippe A, Rippe C, Sward K,etal. Disproportionally low clearance of macromolecules from the plasma to the peritoneal cavity in a mouse model of peritoneal dialysis[J]. Nephrol Dial Transplant, 2007, 22(1):88-95.

[10] Rodriques F L, de Oliveira M, Salqado H C,etal. Effect of baroreceptor denervation the autonomic control of arterial pressure in conscious mice[J]. Exp Physiol, 2011. 96(9):853-862.

[11] Lataro R M, Castania J A, Chapleau M W,etal. Baroreceptor and chemoreceptor contribution to the hypertensive response to bilateral carotid occlusion in conscious mice[J]. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 2010, 299(6):1990-1995.

[12] Ferl G Z, Zhang X, Wu H M,etal. Estimation of the 18F-FDG Input Function in Mice by Use of Dynamic Small-Animal PET and Minimal Blood Sample Data[J]. J Nucl Med, 2010, 51(10):1658-1662.

[13] 史宏博,Ruth Magaye,王 尊,等.小鼠股動脈及股靜脈插管手術模型制備方法[J].寧波大學學報(理工版),2012, 25(3):71-74.

[14] 岳 霞,Ruth Magaye,王 尊,等.小鼠股動脈及胃插管復合手術模型制備方法[J].實驗動物與比較醫(yī)學,2013,33(2):139-142.

[15] 賀爭鳴,李根平.實驗動物福利與動物實驗科學[M].北京:科學出版社,2011.

[16] 何聞愷,邵義祥,聞素琴.醫(yī)學動物實驗與生命倫理學的沖突及緩和途徑[J].實驗室研究與探索, 2013, 32(8):157-160.

Ethical Welfare Care during Preparation and Application of a Microsurgical Vascular Catheter Model in Mice

GUYuan-liang,ZHOUQi,LINXia-lu,WANGXin,ZHOUFei,ZHAOJin-shun,ZOUBao-bo

(Medical School of Ningbo University, Ningbo 315211, China)

Microsurgical vascular catheterization is a widely used experimental mouse model in biomedical research. It is much closer to the actual human conditions than the in vitro experiments. However, during preparation and application of this animal model, ethical welfare concerns should be fully taken into consideration. In this paper, how to ensure the animals to get full ethical welfare care during the preparation and application of the model is discussed. The aim of this paper includes improving animal ethical welfares and ensuring a proper application of microsurgical vascular catheter model in the biomedical field.

vascular catheter model; ethical welfare care; mice; microsurgery

2015-03-15

國家自然科學基金(81273111);寧波市科技項目(2012C5019)

谷元亮(1989-)，男，安徽馬鞍山人，碩士生，主要研究方向：勞動衛(wèi)生與環(huán)境衛(wèi)生學。 E-mail: gurice@yeah.net

鄒寶波(1962-)，女，山東海陽人，副主任技師，主要研究方向：實驗動物與管理。

Tel.:0574-87609599; E-mail: zoubaobo@nbu.edu.cn

R 332; R 052

A

1006-7167(2016)01-0271-04