燈盞乙素抑制熱應(yīng)激誘導(dǎo)豬腎小管上皮細(xì)胞凋亡研究

叢霞，李華濤，陳健偉，張東君，曹榮峰，田文儒*

（1.青島農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，山東青島 266109；2.肥城市畜牧獸醫(yī)局，山東肥城 271600）

燈盞乙素抑制熱應(yīng)激誘導(dǎo)豬腎小管上皮細(xì)胞凋亡研究

叢霞1，李華濤1，陳健偉1，張東君2，曹榮峰1，田文儒1*

（1.青島農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，山東青島 266109；2.肥城市畜牧獸醫(yī)局，山東肥城 271600）

燈盞乙素（Scu）為燈盞花中提取的單一黃酮類化合物，具有清熱解毒和保護(hù)細(xì)胞免受熱應(yīng)激損傷的作用。試驗(yàn)將不同濃度Suc培養(yǎng)的豬腎小管上皮細(xì)胞（LLC-PK1）在42℃下熱應(yīng)激1 h，采用RNA干擾法沉默細(xì)胞HSP72基因表達(dá)，熒光定量PCR和Western blot檢測(cè)細(xì)胞熱休克蛋白（HSP）70、Bcl-2、Bax、細(xì)胞色素C（Cyt-c）和caspase-3裂解。結(jié)果表明，Scu顯著增加細(xì)胞Bcl-2蛋白和HSP70蛋白水平，增加Bcl-2/Bax比值，抑制Cyt-c的釋放及pro-caspase-3裂解和caspase-3表達(dá)；但沉默HSP70后，細(xì)胞Cyt-c釋放和caspase-3表達(dá)均顯著增加。由此可知，Scu抑制LLC-PK1凋亡，保護(hù)細(xì)胞免受熱應(yīng)激損傷。

燈盞乙素；LLC-PK1；凋亡；熱應(yīng)激；HSP70

腎臟疾病如急性腎小管阻塞、慢性痛風(fēng)性腎病、尿酸腎結(jié)石等，可引起腎臟組織損害，炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，導(dǎo)致腎功能損傷。Choe等研究認(rèn)為，細(xì)胞凋亡可能是腎臟（尤其是腎小管上皮）細(xì)胞損傷發(fā)病機(jī)制之一[1]。細(xì)胞凋亡具有兩個(gè)主要調(diào)節(jié)途徑，即死亡受體誘導(dǎo)的外源性和線粒體小體介導(dǎo)的內(nèi)源性途徑。Bax和Bcl-2在線粒體介導(dǎo)的凋亡途徑中發(fā)揮重要作用，能調(diào)節(jié)線粒體外膜通透性，使細(xì)胞色素C（Cyt-c）釋放到細(xì)胞質(zhì)中。Cyt-c促進(jìn)凋亡蛋白酶激活因子活化并激活caspase-9，促進(jìn)procaspase-3裂解成caspase-3，導(dǎo)致蛋白水解和細(xì)胞凋亡[2]。在內(nèi)源性途徑中，HSP70能穩(wěn)定部分變性蛋白，去除不可逆損傷蛋白，維持細(xì)胞正常功能并抑制熱應(yīng)激引起細(xì)胞凋亡。Bcl-2/Bax值是腎小管上皮細(xì)胞發(fā)生凋亡關(guān)鍵因素[3]。HSP70可阻止應(yīng)激反應(yīng)中Bax易位，抑制線粒體釋放Cyt-c及caspase-3激活[4-5]。HSP70與線粒體釋放的另一個(gè)凋亡誘導(dǎo)因子結(jié)合形成復(fù)合物，可阻止細(xì)胞染色質(zhì)聚集和細(xì)胞凋亡[6]。

燈盞乙素（Scu）是燈盞花中提取的單一黃酮類化合物，在中醫(yī)臨床上廣泛用于治療心血管疾病[7]。Zhang等研究表明，Scu能抑制線粒體功能損傷和大腦缺血再灌注損傷所誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡[8]，通過(guò)上調(diào)Bcl-xL表達(dá)和降低caspase-3活性而抑制CoCl2誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞凋亡[9]，Scu保護(hù)熱應(yīng)激誘導(dǎo)的細(xì)胞損傷研究報(bào)道鮮見(jiàn)，對(duì)Scu解熱作用及機(jī)制研究較少。

本文采用RNA干擾、實(shí)時(shí)定量PCR和western blot方法，研究Scu對(duì)受熱應(yīng)激LLC-PK1細(xì)胞Bcl-2、Bax、HSP70、cyt-c和pro-caspase-3表達(dá)影響，為闡明Scu保護(hù)熱應(yīng)激引起細(xì)胞損傷的作用機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 材料

豬腎小管上皮細(xì)胞（Pig kidney proximal tubular，LLC-PK1，美國(guó)ATCC細(xì)胞庫(kù)第三代細(xì)胞）購(gòu)自上海復(fù)祥生物科技有限公司；燈盞花乙素（Scutellarin，Scu）購(gòu)自江西南昌制藥工程中心；高糖DMEM培養(yǎng)基和胰蛋白酶購(gòu)自美國(guó)GIBCO公司；胎牛血清購(gòu)自美國(guó)HyClone公司；RNA提取試劑盒和反轉(zhuǎn)錄試劑盒分別購(gòu)自原平皓生物有限公司和日本TaKaRa公司；LightCycler?480 SYBR GreenⅠMaster購(gòu)自美國(guó)Roche公司；抗Bcl-2（sc-492）、Bax（sc-526），HSP70（sc-1060）、細(xì)胞色素C（sc-8385）、pro-caspase-3（ab90437）、caspase-3（ab13847）和GAPDH（sc-48166）抗體均購(gòu)自美國(guó)Santa Cruze公司；兔抗羊、羊抗兔IgGHRP（二抗-辣根過(guò)氧化物酶）購(gòu)自美國(guó)Jackson Immuno Research公司；Western及IP細(xì)胞裂解液、一抗二抗去除液和ECL熒光底物試劑盒均購(gòu)自碧云天生物制品有限公司。

1.1.2 細(xì)胞培養(yǎng)及處理

LLC-PK1細(xì)胞在DMEM培養(yǎng)液中培養(yǎng)于37℃，含5%CO2培養(yǎng)箱中，DMEM培養(yǎng)液含5%胎牛血清并分別加入100 U·mL-1和100 μg·mL-1青、鏈霉素。將Scu溶解在DMSO中，使用時(shí)稀釋終濃度為0.1%DMSO完全培養(yǎng)基。將細(xì)胞培養(yǎng)24 h后42℃熱應(yīng)激1 h處理，37℃下恢復(fù)6 h，收獲細(xì)胞并作相應(yīng)試驗(yàn)。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 Scu最佳濃度篩選

將LLC-PK1細(xì)胞（5×103·孔-1）接種于96孔培養(yǎng)板并培養(yǎng)24 h，再用含不同濃度Scu（10-3～10-7mol·L-1）完全培養(yǎng)基孵育24 h，CCK-8試劑盒檢測(cè)細(xì)胞活力，具體操作方法參照試劑盒說(shuō)明書(shū)。測(cè)定A450nm波長(zhǎng)吸光度，取3次重復(fù)試驗(yàn)平均值。

1.2.2 siRNA干擾HSP70基因表達(dá)

將濃度為10 nm的HSP70干擾RNA（siRNAs，見(jiàn)表1）和QIAGEN轉(zhuǎn)染試劑混合后，按照說(shuō)明書(shū)操作程序轉(zhuǎn)染細(xì)胞，轉(zhuǎn)染細(xì)胞在37℃下培養(yǎng)12 h，42℃熱應(yīng)激1 h，然后在37℃下恢復(fù)6 h后收獲細(xì)胞，Western blot法檢測(cè)細(xì)胞HSP70表達(dá)水平，分析HSP70沉默效率，篩選最佳干擾RNA。

1.2.3 熒光定量PCR

按照RNA提取試劑盒說(shuō)明，提取Scu和熱應(yīng)激處理細(xì)胞總RNA，按照試劑盒（TaKaRa）說(shuō)明反轉(zhuǎn)錄，反應(yīng)體系（20 μL）為：總RNA 7 μL；Random hexamer引物（0.2 μg·μL-1）1 μL；DEPC處理水4 μL；5×Reaction Buffer 4 μL；RibolockTMRNase抑制劑1 μL；10 mmol·L-1dNTP Mix 2 μL；M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶1 μL。

將合成的cDNA產(chǎn)物作系列濃度梯度稀釋，Roche LightCycler 480Ⅱ熒光定量PCR儀作定量反應(yīng)，PCR反應(yīng)體系（10 μL）為：ddH2O 3.6 μL；SYBRGreen Real time PCR Master Mix 5 μL；上下游引物（上海生工生物技術(shù)有限公司合成，20 pmol·μL-1）各0.2 μL（見(jiàn)表2）；cDNA 1 μL。PCR反應(yīng)條件為：95℃10 min，95℃5 s，60℃30 s，72℃，30 s共45個(gè)循環(huán)。反應(yīng)結(jié)束后，各組細(xì)胞以β-actin作內(nèi)參基因，用2-ΔΔCt法定量分析[10]。

1.2.4 蛋白印跡分析

將細(xì)胞培養(yǎng)皿中培養(yǎng)液吸掉，加入2 mL PBS（0.01 moL·L-1，pH 7.2～7.3）清洗2次，去除PBS后將培養(yǎng)皿置于冰上，每培養(yǎng)皿細(xì)胞中加入0.5 mL終裂解液，吹打、混勻。裂解后將裂解液移至1.5 mL離心管中，4℃，14 000 r·min-1離心5 min。取離心后上清液用2×SDS樣品緩沖液1∶1稀釋，煮沸使蛋白變性。然后在5%濃縮膠、12%分離膠、電壓為110 V條件下SDSPAGE電泳2 h。將細(xì)胞樣品中蛋白質(zhì)經(jīng)電泳分離后，轉(zhuǎn)移至PVDF膜上（4℃，220 mA，2 h），在TBST緩沖液中漂洗3次，每次5 min，將膜置于10%牛血清白蛋白（BSA）中室溫封閉2 h，根據(jù)PVDF膜孔徑加一抗（1∶1000稀釋），4℃下孵育過(guò)夜，用TBST漂洗膜3次，每次5min；加入與一抗稀釋后相同量的二抗IgG-HRP，室溫反應(yīng)1 h，經(jīng)TBST漂洗3次，每次5 min，待ECL發(fā)光試劑顯色后拍照鑒定，用BandScan 5.0軟件灰度分析。

表1 試驗(yàn)中使用的siRNA核苷酸片段Table 1The primer sequences of siRNA used in the experiment

表2 熒光定量PCR引物Table 2The primer sequences used in real time PCR

1.2.5 統(tǒng)計(jì)分析

用SPSS 12.0軟件作方差分析，試驗(yàn)數(shù)據(jù)用-X± SD表示，t檢驗(yàn)做均數(shù)間比較，*表示差異顯著（P＜0.05），**表示差異極顯著（P＜0.01）。

2 結(jié)果與分析

2.1 Scu對(duì)細(xì)胞存活率影響

CCK-8法檢測(cè)Scu檢測(cè)處理后細(xì)胞活力，以確定Scu對(duì)LLC-PK1細(xì)胞毒副作用。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，當(dāng)Scu濃度為10-6～10-7mol·L-1時(shí)，對(duì)細(xì)胞存活率無(wú)顯著（P＞0.05）影響（見(jiàn)圖1），當(dāng)Scu濃度增加至10-3～10-5mol·L-1時(shí)，細(xì)胞活力顯著（P＜0.05）下降。

2.2 熱應(yīng)激對(duì)細(xì)胞凋亡相關(guān)因子表達(dá)影響

Western blot檢測(cè)結(jié)果表明，與對(duì)照組比，熱應(yīng)激使細(xì)胞Bax和Bcl-2蛋白表達(dá)顯著（P＜0.05）升高（見(jiàn)圖2），使Bcl-2/Bax蛋白比值顯著（P＜0.05）下降；此外，細(xì)胞受熱應(yīng)激后，cyt-c釋放量和pro-caspase-3裂解量均顯著（P＜0.05）高于對(duì)照組。

圖1 不同濃度Scu對(duì)LLC-PK1細(xì)胞活力影響Fig.1Effects of different concentration of Scu on LLC-PK1 cells viability

圖2 熱應(yīng)激對(duì)細(xì)胞Bcl-2、Bax、cyt-c、pro-caspase-3和caspase-3蛋白表達(dá)影響Fig.2Effects of heat stress on Bcl-2,Bax,cyt-c,pro-caspase-3 and caspase-3 protein expression

2.3 Scu對(duì)受熱應(yīng)激細(xì)胞Bcl-2、Bax及HSP70 mRNA表達(dá)影響

qRT-PCR檢測(cè)結(jié)果顯示，與熱應(yīng)激組比，Scu處理組（ScuM）細(xì)胞Bcl-2 mRNA表達(dá)顯著（P＜0.05）升高（見(jiàn)表3），而B(niǎo)ax mRNA表達(dá)則顯著（P＜0.05）降低（見(jiàn)表3），并且Bcl-2/Bax mRNA比值也顯著（P＜0.05）升高（見(jiàn)表3）；值得注意的是，Scu（ScuM，P＜0.01；ScuL，P＜0.05）處理，比熱應(yīng)激組顯著增加HSP70 mRNA表達(dá)，而當(dāng)Scu濃度增加（ScuH）時(shí)，表達(dá)差異不顯著（P＞0.05）（見(jiàn)表3）。

表3 Scu對(duì)熱應(yīng)激細(xì)胞Bcl-2、Bax及HSP70 mRNA表達(dá)水平影響Table 3Effects of Scu on Bcl-2,Bax and HSP70 mRNA expression

2.4 對(duì)熱應(yīng)激細(xì)胞Bcl-2、Bax及HSP70蛋白表達(dá)影響

Western blot檢測(cè)結(jié)果（見(jiàn)圖3）發(fā)現(xiàn)，與熱應(yīng)激組比較，Scu處理組（ScuM）細(xì)胞Bcl-2蛋白表達(dá)顯著（P＜0.05）升高，而B(niǎo)ax蛋白表達(dá)則顯著（P＜0.05）降低；Scu處理組（ScuM和ScuL）細(xì)胞Bcl-2/Bax蛋白比值以及HSP70蛋白和pro-caspase-3的表達(dá)量均顯著升高，而cyt-c含量和caspase-3表達(dá)量則顯著（P＜0.05）降低（見(jiàn)表4）。

2.5 siRNA對(duì)細(xì)胞熱應(yīng)激后HSP70表達(dá)抑制

Western blot檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，與熱應(yīng)激組比較，siRNA0、siRNA2、siRNA3和siRNA4組細(xì)胞HSP70蛋白表達(dá)均無(wú)顯著差異，僅siRNA1組細(xì)胞HSP70蛋白表達(dá)極顯著（P＜0.01）下降，抑制率為87.3%（見(jiàn)圖4）。

2.6 沉默HSP70對(duì)Scu抗細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)影響

Western blot檢測(cè)結(jié)果（見(jiàn)圖5）顯示，與單純熱應(yīng)激組相比，轉(zhuǎn)染siRNA組細(xì)胞cyt-c、procaspase-3和caspase-3蛋白表達(dá)均無(wú)顯著（P＞0.05）變化；而Scu（ScuM）可顯著（P＜0.05）抑制熱應(yīng)激誘導(dǎo)的cyt-c釋放及pro-caspase-3裂解，顯著（P＜0.05）降低caspase-3表達(dá)。沉默HSP70后，阻止Scu降低線粒體釋放cyt-c作用，細(xì)胞質(zhì)中cyt-c量顯著（P＜0.05）升高；pro-caspase-3裂解顯著（P＜0.05）升高；caspase-3表達(dá)顯著（P＜0.05）升高。

圖3 Scu對(duì)熱應(yīng)激細(xì)胞Bcl-2、Bax及HSP70蛋白表達(dá)影響Fig.3Effects of Scu on Bcl-2,Bax,cyt-c,pro-caspase-3, caspase-3 and HSP70 protein expression

表4 Scu對(duì)熱應(yīng)激細(xì)胞Bcl-2、Bax及HSP70蛋白表達(dá)的影響Table 4Effects of Scu on Bcl-2,Bax,cyt-c,pro-caspase-3,caspase-3 and HSP70 protein expression

圖4 不同siRNA片段對(duì)細(xì)胞熱應(yīng)激后HSP70蛋白表達(dá)影響Fig.4Effect of different siRNA on relative amount of HSP70 protein expression

圖5 沉默HSP70對(duì)Scu抗細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響Fig.5Silence HSP70 affect expression of apoptotic relative proteins

3 討論與結(jié)論

Bax和Bcl-2是重要細(xì)胞凋亡調(diào)節(jié)因子，其中Bcl-2是抗凋亡基因，Bax可抑制Bcl-2蛋白作用，其過(guò)度表達(dá)可促使細(xì)胞凋亡，Iwayama等研究認(rèn)為，Bax通過(guò)與Bcl-2形成異源二聚體頡頏Bcl-2保護(hù)效應(yīng)而促使細(xì)胞凋亡，Bcl-2和Bax蛋白比值決定細(xì)胞是否凋亡，Bcl-2/Bax值升高抑制細(xì)胞凋亡。因此，Bcl-2/Bax值是細(xì)胞凋亡閾值的關(guān)鍵因素[11]。本研究發(fā)現(xiàn)，熱應(yīng)激時(shí)Scu通過(guò)下調(diào)Bax并上調(diào)Bcl-2蛋白表達(dá)，提高Bcl-2/Bax值，表明Scu能緩解由熱應(yīng)激導(dǎo)致的細(xì)胞損傷，抑制LLC-PK1細(xì)胞凋亡。同時(shí)，熱應(yīng)激誘導(dǎo)LLC-PK1細(xì)胞釋放Cyt-c，進(jìn)一步激活caspase-9，使pro-caspase-3裂解成活化caspase-3，啟動(dòng)細(xì)胞凋亡。Caspase-3在細(xì)胞凋亡中發(fā)揮重要作用，是細(xì)胞凋亡主要效應(yīng)執(zhí)行者，一旦活化，凋亡不可逆轉(zhuǎn)。Pro-caspase-3裂解激活caspase-3依賴于從線粒體中釋放的cyt-c，激活的caspase-3可水解包括細(xì)胞調(diào)節(jié)、細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、DNA修復(fù)、細(xì)胞存活等環(huán)節(jié)重要蛋白，使細(xì)胞表現(xiàn)為凋亡特有的形態(tài)學(xué)及生物化學(xué)特征。劉萍等研究發(fā)現(xiàn)，Scu可增加H2O2誘導(dǎo)的PC12 Bcl-2 mRNA表達(dá)，減弱caspase-3酶活性，降低P12細(xì)胞凋亡率[12]。徐華等研究證實(shí)，燈盞花素對(duì)順鉑腎毒性的保護(hù)作用機(jī)制與Bcl-2/Bax值相關(guān)[13]。說(shuō)明Scu可通過(guò)提高Bcl-2表達(dá)，降低pro-caspase-3裂解水平發(fā)揮對(duì)細(xì)胞的保護(hù)作用。Hanqing C等研究發(fā)現(xiàn)，Scu對(duì)SAP大鼠腎小管細(xì)胞損傷具有明顯保護(hù)作用[14]。本研究發(fā)現(xiàn)，一定濃度Scu可抑制LLC-PK1細(xì)胞Cyt-c的釋放和caspase-3表達(dá)，原因是Scu改變細(xì)胞線粒體外膜通透性，抑制細(xì)胞色素C釋放。本試驗(yàn)結(jié)果證實(shí)，Scu預(yù)處理可減少熱應(yīng)激誘導(dǎo)的LLCPK1細(xì)胞凋亡。

HSP70是機(jī)體在應(yīng)激情況下迅速合成的蛋白質(zhì)，被視為熱應(yīng)激過(guò)程中保護(hù)細(xì)胞的主要分子之一。HSP70能保護(hù)細(xì)胞免受高溫?fù)p傷、提高細(xì)胞耐熱性，HSP70可抑制凋亡小體形成，抑制細(xì)胞凋亡，提高細(xì)胞存活率。此外，HSP70還能直接保護(hù)H2O2和順鉑誘導(dǎo)的LLC-PK1細(xì)胞損傷[15]。熱應(yīng)激能夠誘導(dǎo)LLC-PK1細(xì)胞高表達(dá)HSP70[16]。本研究發(fā)現(xiàn)，Scu能增加LLC-PK1細(xì)胞HSP70表達(dá)。這可能是Scu使細(xì)胞耐熱，因?yàn)镠SP70能修復(fù)應(yīng)激損傷并恢復(fù)錯(cuò)誤折疊蛋白[17]。本研究推測(cè)，Scu對(duì)細(xì)胞保護(hù)作用可能是由于：①Scu上調(diào)HSP70表達(dá)，修復(fù)細(xì)胞內(nèi)變性Bcl-2蛋白，防止其被降解[18]；另一方面，HSP70過(guò)表達(dá)有效促進(jìn)核仁素上調(diào)，穩(wěn)定Bcl-2 mRNA表達(dá)[19]，促進(jìn)Bcl-2表達(dá)，發(fā)揮凋亡抑制功能。②Scu上調(diào)HSP70表達(dá)，阻止Bax轉(zhuǎn)移至線粒體[20]，使線粒體膜電位趨于穩(wěn)定[21]，阻止cyt-c釋放，抑制pro-caspase-3裂解，發(fā)揮細(xì)胞保護(hù)作用。

為證實(shí)Scu是否通過(guò)上調(diào)細(xì)胞HSP70表達(dá)起保護(hù)作用，本文用RNA干擾方法沉默HSP70表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，單純熱應(yīng)激誘導(dǎo)的HSP70表達(dá)不影響細(xì)胞線粒體釋放Cyt-c及pro-caspase-3裂解，但沉默HSP70的表達(dá)可阻斷Scu對(duì)細(xì)胞保護(hù)作用。說(shuō)明Scu通過(guò)上調(diào)HSP70表達(dá)而對(duì)LLC-PK1細(xì)胞熱應(yīng)激損傷起保護(hù)作用。這可能是在氧化應(yīng)激條件下，HSP70通過(guò)上調(diào)Bcl-2/Bax值，抑制線粒體膜電位改變，阻止cyt-c釋放；此外，HSP70可與凋亡蛋白酶激活因子（Apaf-1）競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合，抑制cyt-c與Apaf-1結(jié)合，阻止下游caspase-9激活caspase-3，最終阻止細(xì)胞凋亡。Liang等研究表明，細(xì)胞內(nèi)鈣離子增加可激活鈣/鈣調(diào)蛋白（CaM）和鈣/鈣調(diào)蛋白依賴的蛋白激酶II（CaMKII）信號(hào)通路[22]，進(jìn)一步誘導(dǎo)HSP70表達(dá)[23-24]。增加細(xì)胞內(nèi)鈣離子水平可以誘導(dǎo)HSP70表達(dá)[25]。本研究發(fā)現(xiàn)，熱應(yīng)激時(shí)siRNA不能完全阻斷Scu降低Cyt-c釋放和procaspase-3裂解作用。然而，Scu可降低活性氧生成，抑制p38 MAPK活化[9]，防止Bax易位到線粒體及Cyt-c釋放[26]。因此推測(cè)，Scu對(duì)LLC-PK1細(xì)胞保護(hù)作用還可能通過(guò)p38 MAPK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，有效抑制熱應(yīng)激對(duì)LLC-PK1細(xì)胞的氧化及對(duì)細(xì)胞線粒體損傷實(shí)現(xiàn)，此亦有待深入研究的方向之一。

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Study on scutellarin attenuates heat stress-induced apoptosis in LLC-PK1 cells/

CONG Xia1,LI Huatao1,CHEN Jianwei1,ZHANG Dongjun2,CAO Rongfeng1,TIAN Wenru1(1.School of Animal Science and Veterinary Medicine,Qingdao Agricultural University, Qingdao Shandong 266109,China;2.Veterinary and Animal Husbandry Department Feicheng, Feicheng Shandong 271600,China)

Scutellarin(Scu)is known to abate fever in the clinical practice of Traditional Chinese Medicine.The primary cultured pig kidney proximal tubular(LLC-PK1)cells incubated with(or without) various concentrations of Scu were heat-stressed at 42℃for 1 h to make heat shock injury cellular model.RNAi technique was used to silence heat shock protein(HSP)70 mRNA expression.The HSP70,Bcl-2,Bax,cytochrome c(cyt-c)and pro-caspase-3 cleavage of the cells were all detected by using real-time PCR and Western blot aimed to examine the effects of Scu on heat-stressed LLC-PK1 cells and to explore its possible mechanism.The results showed that Scu significantly increased the levels of Bcl-2 and HSP70 protein,the ratio of Bcl-2 to Bax,and inhibited the release of cyt-c,procaspase-3 cleavage as well as caspase-3 expression.Interestingly,caspase-3 expression and release of cyt-c were dramatically increased in the cells with HSP70 RNA interference.These results demonstrate that Scu protects LLC-PK1 cells against heat stress,possibly by up-regulating HSP70 expression.

scutellarin;LLC-PK1;apoptosis;heat stress;HSP70

S853.72

A

1005-9369（2016）11-0059-07

時(shí)間2016-11-30 15:18:38[URL]http://www.cnki.net/kcms/detail/23.1391.S.20161130.1518.002.html

叢霞,李華濤,陳健偉,等.燈盞乙素抑制熱應(yīng)激誘導(dǎo)豬腎小管上皮細(xì)胞凋亡研究[J].東北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào),2016,47(11)：59-65

Cong Xia,Li Huatao,Chen Jianwei,et al.Study on scutellarin attenuates heat stress-induced apoptosis in LLC-PK1 cells [J].Journal of Northeast Agricultural University,2016,47(11)：59-65.(in Chinese with English abstract)

2016-09-16

國(guó)家自然科學(xué)基金（31572590，31502138）；山東省自然科學(xué)基金（BS2015NY001）；山東省高等學(xué)?？萍加?jì)劃項(xiàng)目（J15LF03）

叢霞（1962-），女，高級(jí)實(shí)驗(yàn)師，碩士，研究方向?yàn)閯?dòng)物生殖生理與生殖疾病。E-mail:780010688@qq.com

*通訊作者：田文儒，教授，博士生導(dǎo)師，研究方向?yàn)閯?dòng)物生殖生理與生殖疾病。E-mail:wrtian@126.com