利用四唑染色圖像測(cè)定玉米種子活力*

常 飄，黃正仙，何麗萍**，孫 雁

(1.云南農(nóng)業(yè)大學(xué) 農(nóng)學(xué)與生物技術(shù)學(xué)院，云南 昆明 650201；2.云南省種子管理站，云南 昆明 650031)

玉米是世界上總產(chǎn)量最高的糧食和飼料作物[1]，在中國玉米的種植面積和產(chǎn)量均占主要糧食作物的30%以上[2]。種子的質(zhì)量優(yōu)劣直接影響了農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的成效，種子活力(seed vigor)是種子最重要的質(zhì)量指標(biāo)之一，高活力的種子具有明顯的生長優(yōu)勢(shì)和生產(chǎn)潛力，能確保田間快速整齊一致的出苗，能影響作物在田間整齊一致的生長發(fā)育，影響最終收獲的產(chǎn)量和質(zhì)量[3]，尤其是在機(jī)械單粒播種越來越普及的區(qū)域，種子活力已成為最重要的種子質(zhì)量指標(biāo)[4]。篩選出高質(zhì)量、高活力的種子滿足農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的需要，對(duì)企業(yè)或農(nóng)民都具有非常重要的意義。玉米種子活力測(cè)定大多采用種子發(fā)芽試驗(yàn)中的一些參數(shù)和指標(biāo)，采用低溫發(fā)芽試驗(yàn)和加速老化試驗(yàn)等實(shí)驗(yàn)室測(cè)定的方法，這些檢測(cè)和評(píng)價(jià)的方法多與種子生理發(fā)芽指標(biāo)和潛在的生理指標(biāo)有關(guān)，測(cè)定程序較為復(fù)雜且時(shí)間較長，至少需要7～10 d[5-6]。近年來，隨著光學(xué)技術(shù)的發(fā)展，高光譜成像作為一種無損、快速的種子質(zhì)量和安全性評(píng)估方法，廣泛應(yīng)用于檢測(cè)蘿卜[7]、青椒[8]、西瓜[9]和玉米[10]種子的活力水平，但目前尚無成熟可商用的種子活力光學(xué)檢測(cè)裝備，且光學(xué)檢測(cè)的技術(shù)成本較高。

種子生活力(seed viability)是指種胚潛在的發(fā)芽能力和種胚所具有的生命力，四唑染色法是其快速測(cè)定方法之一。四唑(2,3,5-三苯基氯化四氮唑，TTC 或TZ)可被種子中活細(xì)胞的脫氫酶還原生成穩(wěn)定的、不溶于水、不揮發(fā)的紅色甲臜類物質(zhì)，使活組織和細(xì)胞呈現(xiàn)紅色，而種子中的死細(xì)胞由于缺乏脫氫酶則不會(huì)被染色，而呈現(xiàn)白色，同時(shí)根據(jù)染成紅色的深淺程度表明種子生活力的高低。四唑法測(cè)定種子生活力由國際種子檢驗(yàn)協(xié)會(huì)(ISTA) 于1953 年列入國際種子檢驗(yàn)規(guī)程，是世界公認(rèn)的最有效的種子生活力的測(cè)定方法[11]，被廣泛應(yīng)用于各種農(nóng)作物、園藝和其他種子的生活力測(cè)定[12-15]。FRAN?A-NETO 等[15]提出種子四唑染色后，依據(jù)染成紅色的深淺程度以及種胚或組織染色結(jié)構(gòu)來區(qū)分種子活力水平，把種子分為A (活力高)、B (有活力但活力低)、C (無活力水平) 三級(jí)，并把大豆種子分為1～5 級(jí)有活力和6～8 級(jí)無活力。徐本美等[16]利用TTC 定量法測(cè)定不同作物種子的活力，并提取生成的紅色甲臜類物質(zhì)，利用分光光度計(jì)比色確定種子的活力，結(jié)果表明：在一般情況下TTC 染色法測(cè)定種子活力是準(zhǔn)確和可靠的；趙新子等[17]采用計(jì)算機(jī)圖像處理與識(shí)別測(cè)定種子活力，計(jì)算機(jī)檢測(cè)結(jié)果對(duì)四唑染色法人工測(cè)定結(jié)果準(zhǔn)確度達(dá)93.7%以上。PEREIRA 等[18]將光學(xué)和TTC 染色法結(jié)合，通過計(jì)算機(jī)采集TTC 染色后大豆種子的圖像特征，并建立了一套有效的大豆種子活力分類等級(jí)。本試驗(yàn)嘗試研究利用TTC 染色圖像測(cè)定和評(píng)價(jià)玉米種子活力水平的可能性，試圖找到一種準(zhǔn)確可靠、快速簡便、重復(fù)性高、成本低廉以及與田間出苗率相關(guān)的玉米種子活力測(cè)定方法，以供種業(yè)公司、種子質(zhì)量檢驗(yàn)站和其他人員在快速測(cè)定玉米種子活力時(shí)使用。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

玉米種子為正大619 雜交種子，由云南正大種子有限公司2013、2014 和2015 年生產(chǎn)，2016年夏季收到種子后于4 ℃冰箱貯藏，試驗(yàn)時(shí)間為2018 年3—9 月。

1.2 方法

1.2.1 玉米種子四唑染色

玉米種子室溫下預(yù)先浸濕16 h，沿胚縱切，留取其中一半，另一半舍去，保證留下的一半種子中包含種胚的各部分，且完整暴露出來。切好的種子置于小燒杯中，加入0.1% 的TTC 溶液(上海馨晟試化工科技有限公司生產(chǎn))浸沒，35 ℃避光染色6 h。染色結(jié)束后濾去溶液，清水清洗2 次備用。每處理100 粒種子，4 次重復(fù)。

1.2.2 數(shù)碼顯微鏡對(duì)四唑染色玉米種胚主要結(jié)構(gòu)圖像采集

開啟數(shù)碼顯微鏡Smart Zoom 5 (德國卡爾·蔡司股份有限公司)，將染色后的玉米種子放置到數(shù)碼顯微鏡的載物臺(tái)上，固定種子種胚使其切面朝上，將顯微鏡放大34 倍并拍下種胚的圖像，觀察鑒定種胚中各主要結(jié)構(gòu)的染色深淺，以RGB顏色模式為標(biāo)準(zhǔn)，劃分為染色深、染色淺和未染色3 個(gè)等級(jí)：當(dāng)種胚顏色為珊瑚色(R：255；G：127；B：80) 或深于珊瑚色時(shí)，判定種子染色深；當(dāng)種胚顏色淺于珊瑚色時(shí)，判定種子染色淺。

1.2.3 種胚結(jié)構(gòu)染色面積測(cè)定和染色面積劃分

利用Smart Zoom 5 的面積測(cè)量工具，分別測(cè)量種胚各結(jié)構(gòu)[胚芽、胚軸、胚根和盾片(子葉)]未染色的面積以及種胚的總面積，計(jì)算種胚染色面積的百分率。

依據(jù)玉米種胚染色區(qū)域的面積大小劃分為5 個(gè)區(qū)間，分別為 [0，25%)、[25%，50%)、[50%，75%)、[75%，100%)和100%。

1.2.4 玉米田間出苗率試驗(yàn)

每個(gè)年份設(shè)置4 個(gè)小區(qū)(重復(fù))，每個(gè)小區(qū)播種100 粒種子，3 個(gè)年份共計(jì)12 個(gè)小區(qū)。播種深度為3～4 cm，定期澆水和除草田間管理，第20 天記錄玉米出苗數(shù)，計(jì)算田間出苗率。

1.2.5 相關(guān)性分析

利用Microsoft Excel 2016 進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，用IBM SPSS Statistics 25.0 進(jìn)行分析比較，用Graphpad Prism 8 進(jìn)行作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 玉米種子種胚結(jié)構(gòu)四唑染色圖像

染色后的玉米種胚各主要結(jié)構(gòu)(胚芽、胚軸、胚根和盾片)均呈紅色(圖1)；根據(jù)染色顏色的深淺標(biāo)準(zhǔn)(圖2)分為染色顏色深、染色顏色淺和未染色3 類，并將試驗(yàn)中所獲得的玉米種子種胚染色顏色進(jìn)行區(qū)分和計(jì)數(shù)。其中，種胚部分未染色又包括盾片上部未染色、盾片中部未染色、盾片下部未染色、胚根未染色和胚軸未染色5 類(圖3)。

圖1 玉米種胚主要結(jié)構(gòu)四唑染色圖Fig.1 Tetrazolium staining imagination of maize seed embryo structure

圖2 玉米種胚四唑染色圖像分級(jí)Fig.2 Classification of tetrazolium staining imagination of maize seed embryo structure

圖3 玉米種胚結(jié)構(gòu)未染色圖示Fig.3 Unstaining imagination of maize seed embryo structures

2.2 不同年份玉米種子種胚四唑染色結(jié)果

2.2.1 玉米種胚主要結(jié)構(gòu)染色及顏色分級(jí)

由表1 可知：從玉米種子種胚染色情況來看，2015、2014 和2013 年的種胚中，盾片整體染色深的數(shù)量均低于胚芽、胚軸和胚根；盾片上部與下部染色淺的數(shù)量高于種胚其他結(jié)構(gòu)。2015和2013 年的玉米種胚各結(jié)構(gòu)的染色深淺均存在顯著性差異(P＜0.05)，說明隨著貯藏時(shí)間的延長，玉米種子的生活力逐漸降低。2015 與2014年的種胚中，胚芽、胚軸和盾片上部未染色均存在顯著性差異，其他種胚結(jié)構(gòu)和染色深淺間不存在顯著性差異，這說明在一定的貯藏時(shí)間內(nèi)，玉米種子的生活力差異不顯著。

表1 不同年份玉米種子種胚結(jié)構(gòu)染色深淺的比較Tab.1 Comparison of staining in embryo structure of different year maize seeds

2.2.2 不同年份玉米種胚染色面積比較

經(jīng)四唑染色后未染色和染色淺的種子是死種子或生活力低的種子，表明其已經(jīng)發(fā)生衰老劣變和死亡。由圖4 可知：在2015 與2014 年間，種胚染色面積為[50%，75%) 和100% 的玉米種子占比存在顯著性差異，而其他染色面積的種子占比無顯著性差異；2015 和2014 年種胚各染色面積的玉米種子占比均與2013 年存在顯著性差異；3 個(gè)年份中，染色面積達(dá)100% 的種子最多，分別為94.5%、88.5%和64%，且存在顯著性差異，表明隨著種子貯藏時(shí)間的延長，玉米種子活力逐漸降低。

圖4 不同年份的玉米種胚染色面積Fig.4 Stained area of maize embryo in different years

2.2.3 不同年份玉米種子染色深淺比較

由圖5 可知：2015 和2014 年的玉米種子種胚染色變化均無顯著性差異，其中種胚全部染色深的種子占比顯著高于 2013 年，種胚部分染色深、種胚染色淺和種胚未染色的種子占比顯著低于2013 年，表明隨著貯藏時(shí)間的延長，種子衰老增加，種子活力水平逐漸下降。

圖5 不同年份玉米種子種胚染色變化Fig.5 Staining variation of maize seeds embryo in different years

2.3 玉米種胚四唑染色與田間出苗率

2.3.1 玉米種胚染色面積與田間出苗率的相關(guān)性

當(dāng)玉米種子種胚部分染色，染色面積在[0，25%)、[25%，50%)、[50%，75%) 和[75%，100%)區(qū)間，即染色面積低于100%時(shí)，與玉米種子田間出苗率呈負(fù)相關(guān)關(guān)系，其相關(guān)系數(shù)(R)分別為-0.959、-1.000 (P＜0.05)、-0.875 和-0.998 (P＜0.05)，玉米種子田間均不能出苗，為無活力的種子；而當(dāng)玉米種胚全部染色，且染色面積為100%時(shí)，與田間出苗率呈正相關(guān)關(guān)系(R=0.986)，表明此時(shí)玉米種子能夠出苗，為具有活力的種子。

2.3.2 玉米種子染色分級(jí)與田間出苗率的相關(guān)性

玉米種子種胚全部染色而且顏色深時(shí)，與田間出苗率呈顯著正相關(guān)(R=1.000，P＜0.05)；玉米種子部分種胚染色深時(shí)，種子與田間出苗率呈顯著負(fù)相關(guān)(R=-1.000，P＜0.05)；全部種胚染色淺和全部未染色時(shí)，與田間出苗率均呈負(fù)相關(guān)(R=-0.921 和-0.905)。說明只有當(dāng)玉米全部種胚染色深時(shí)，玉米種子在田間才具備出苗能力，為有活力的種子；其他染色情況下，種子則不出苗，為無活力的玉米種子。

3 討論

3.1 評(píng)價(jià)種子活力與田間出苗狀況之間的關(guān)系

種子活力測(cè)定的目的是為種子提供準(zhǔn)確的潛在生理能力差異的信息，尤其是發(fā)芽率相似，但經(jīng)過貯藏?zé)o法斷定田間播種后是否具備較好出苗狀況的種子。而測(cè)定田間出苗狀況并非易事，種子活力代表的是種子較多綜合特性的總和。單一的活力指標(biāo)是否能準(zhǔn)確描述和表達(dá)真實(shí)的種子活力水平，一直是學(xué)者長期以來研究和追尋的目標(biāo)[19]。100 多年來，種子學(xué)家們提出的描述種子的活力和活力測(cè)定評(píng)價(jià)方法，可以說得上是一個(gè)世紀(jì)的編年史，直到20 世紀(jì)80 年代初，McDonald 提出種子活力的概念得到了國際種子檢驗(yàn)協(xié)會(huì)(ISTA)和美國官方種子分析家協(xié)會(huì)(AOSA)的認(rèn)可[20]，即指在廣泛的田間條件下，決定種子迅速整齊出苗和長成正常幼苗潛在能力的總稱[21]，也即表明有活力的種子在廣泛的田間條件能快速整齊出苗，而無活力的種子在田間條件下不能夠出苗。因此，在實(shí)驗(yàn)室測(cè)定種子活力水平的方法，應(yīng)最終與田間出苗率也即田間表現(xiàn)相關(guān)。

3.2 四唑染色法測(cè)定玉米種子活力的優(yōu)勢(shì)

種子活力測(cè)定的方法可以分為基于發(fā)芽試驗(yàn)方法的生理測(cè)定和生化測(cè)定，而理想的種子活力測(cè)定方法，需要滿足結(jié)果準(zhǔn)確、簡單易行、快速省時(shí)、重復(fù)性好、成本低廉和與田間出苗率相關(guān)的要求[22]。周雷[23]曾做過探索測(cè)定玉米種子活力的最佳方法的研究，將常用的種子活力測(cè)定方法如標(biāo)準(zhǔn)發(fā)芽試驗(yàn)、低溫測(cè)定、鹽度測(cè)定、四唑染色和電導(dǎo)率測(cè)定等方法測(cè)出的結(jié)果與田間出苗率進(jìn)行相關(guān)分析，其中低溫測(cè)定法與田間出苗率的相關(guān)系數(shù)最高(0.979)，即該方法為最佳測(cè)定方法；張守潤[24]曾做過玉米種子活力測(cè)定及其與田間出苗率的關(guān)系指出：對(duì)于鑒別早播條件下種子批的田間出苗能力，遇冷試驗(yàn)及活力指數(shù)均為有效的方法，與田間出苗率的相關(guān)系數(shù)分別為0.71 和0.77，而電導(dǎo)率測(cè)定結(jié)果與田間出苗率的相關(guān)系數(shù)最高，達(dá)到了0.85，為最佳測(cè)定方法。本試驗(yàn)采用四唑染色測(cè)定玉米種子活力，種胚全部染色且染色深時(shí)與田間出苗率的相關(guān)系數(shù)達(dá)到了1.000，即在測(cè)定時(shí)只需觀察玉米種胚是否全部100%染色以及是否染色顏色深就可以確定種子是否具備出苗能力，全部染色且顏色深的種子是有活力的種子，其他情況下種子都不具有活力，測(cè)定的方法更為簡便和準(zhǔn)確。本試驗(yàn)從預(yù)先濕潤玉米種子開始到試驗(yàn)結(jié)束只需1 d (24 h)，而低溫測(cè)定最少需要7 d，因此，四唑染色圖像法大大縮短了檢測(cè)時(shí)間。

目前，中國玉米種子活力測(cè)定的方法并未列入農(nóng)作物種子檢驗(yàn)規(guī)程，玉米種子活力測(cè)定在企業(yè)中并不普及，主要是因?yàn)榇蟛糠制髽I(yè)沒有掌握種子活力測(cè)定的技術(shù)方法。本試驗(yàn)根據(jù)四唑染色法染色后的種胚是否完全染色而且染色顏色深，利用肉眼或者放大鏡就能判定種子是否具有種子活力和田間出苗能力。該技術(shù)方法簡化了玉米種子活力測(cè)定方法，在當(dāng)前單粒機(jī)械播種區(qū)域越來越廣、對(duì)整齊一致的出苗率要求越來越高的情況下，對(duì)保障高效和簡化的農(nóng)業(yè)生產(chǎn)和用種安全具有非常重要的意義。

4 結(jié)論

玉米種子經(jīng)四唑染色后，只有種胚結(jié)構(gòu)全部染色且染色深的種子才能夠在田間出苗，可判定為有活力的種子；而種胚部分結(jié)構(gòu)染色或者全部染色但染色淺的種子在田間不能出苗，即為無活力的種子。這一結(jié)論可為快速測(cè)定玉米種子活力提供新的技術(shù)方法和指標(biāo)，為玉米種子質(zhì)量檢驗(yàn)提供一種準(zhǔn)確、實(shí)用、方便和廉價(jià)的測(cè)定方法，可供種子檢驗(yàn)機(jī)構(gòu)和種業(yè)公司采用。