銅綠假單胞菌中新型的β內(nèi)酰胺酶介導(dǎo)的羧芐青霉素抗性

董萌萌,梁清清,張會(huì)群,郭子晟,陳 林

(西北大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院/西部資源及現(xiàn)代生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,陜西 西安 710069)

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·化學(xué)與化學(xué)工程·

銅綠假單胞菌中新型的β內(nèi)酰胺酶介導(dǎo)的羧芐青霉素抗性

董萌萌,梁清清,張會(huì)群,郭子晟,陳 林

(西北大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院/西部資源及現(xiàn)代生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,陜西 西安 710069)

為了探究銅綠假單胞菌抗羧芐青霉素的機(jī)制,通過基因敲除以及克拉維酸鉀和羧芐青霉素協(xié)同實(shí)驗(yàn)對(duì)羧芐青霉素抗性菌株進(jìn)行研究。在對(duì)羧芐青霉素具有抗性的轉(zhuǎn)座突變體基礎(chǔ)上敲除ampC后,其對(duì)羧芐青霉素抗性沒有變化;8株羧芐青霉素抗性轉(zhuǎn)座突變體菌株克拉維酸鉀協(xié)同實(shí)驗(yàn)呈陽性。基因組中預(yù)測(cè)為β內(nèi)酰胺酶的PA5514基因的敲除突變菌株及過表達(dá)菌株對(duì)氨芐青霉素以及羧芐青霉素的敏感性也沒有變化。結(jié)果說明ampC及PA5514表達(dá)升高并不是羧芐青霉素抗性轉(zhuǎn)座突變體抗性產(chǎn)生的原因,基因組中存在新的受克拉維酸鉀抑制的β內(nèi)酰胺酶可能是銅綠假單胞菌抗羧芐青霉素的一種新機(jī)制。同時(shí)，克拉維酸鉀與羧芐青霉素聯(lián)合使用能夠提高羧芐青霉素對(duì)銅綠假單胞菌抗性菌株的治療效果。

銅綠假單胞菌;羧芐青霉素;β內(nèi)酰胺酶;克拉維酸鉀

銅綠假單胞菌(Pseudomonasaeruginosa, PAO1)是一種重要的機(jī)會(huì)致病菌,主要感染免疫力低下或者大面積燒傷病人,一旦感染,臨床治療十分困難[1]?？股厥桥R床治療病原菌感染的常用藥物,其中β內(nèi)酰胺類抗生素由于其較強(qiáng)及較廣的抗菌能力曾是治療PAO1感染的有效物質(zhì)[2]。近年來,由于抗菌藥物的濫用和病原菌的交叉感染,PAO1對(duì)β內(nèi)酰胺類抗生素的耐藥性越來越強(qiáng)[3]。

銅綠假單胞菌對(duì)β內(nèi)酰胺類抗生素耐藥機(jī)制相當(dāng)復(fù)雜,基因水平轉(zhuǎn)移[4]、β內(nèi)酰胺酶的產(chǎn)生[5]、功能蛋白空間構(gòu)象改變及種間和種內(nèi)傳播[6]等都能導(dǎo)致銅綠假單胞菌耐藥性的產(chǎn)生。例如外膜蛋白表達(dá)降低或構(gòu)象改變引起細(xì)胞膜通透性降低[3],基因突變導(dǎo)致抗生素靶點(diǎn)改變[6],主動(dòng)外排[3]以及質(zhì)?；蛘献咏閷?dǎo)的耐藥基因的傳播[7]等,都會(huì)使PAO1耐藥性升高,進(jìn)而獲得生存優(yōu)勢(shì)。除此之外,當(dāng)環(huán)境中持續(xù)存在誘發(fā)因子時(shí),能夠誘導(dǎo)PAO1中抗生素水解酶和鈍化酶等的表達(dá),這些誘發(fā)因子包括抗生素[5]、氧氣[8]以及群體反應(yīng)引起的生物被膜[9]和叢動(dòng)[6]等。

β內(nèi)酰胺酶是PAO1產(chǎn)生耐藥的主要原因,PAO1在抗生素壓力下可以激活體內(nèi)多種β內(nèi)酰胺酶基因的表達(dá)[5]。β內(nèi)酰胺酶主要分為A, B, C, D 4類,其中B類以金屬鋅離子為活性位點(diǎn),A, C, D類以絲氨酸為活性位點(diǎn)[10]。β內(nèi)酰胺酶的主要功能是水解β內(nèi)酰胺類抗生素,使其失活,無法對(duì)菌體造成破壞[11]?？死S酸作為β內(nèi)酰胺酶抑制劑,不可逆的與β內(nèi)酰胺酶結(jié)合,使得β內(nèi)酰胺酶失活,β內(nèi)酰胺類抗生素能夠發(fā)揮其功能,但是克拉維酸幾乎沒有抑菌能力?？死S酸與β內(nèi)酰胺類抗生素聯(lián)合使用對(duì)致病菌治療效果十分明顯已經(jīng)在臨床中得到了證實(shí)[12]?？死S酸鉀同樣具有抑制β內(nèi)酰胺酶的功能[13]。

實(shí)驗(yàn)室前期通過構(gòu)建轉(zhuǎn)座突變體庫獲得45個(gè)與耐藥性相關(guān)的基因,其中10個(gè)基因突變后菌株對(duì)羧芐青霉素抗性明顯增強(qiáng),13個(gè)基因突變后菌株對(duì)羧芐青霉素抗性減弱[14],因此與羧芐青霉素抗性增加相關(guān)的菌株達(dá)到了突變體庫的22% 以上;對(duì)另外一個(gè)轉(zhuǎn)座突變體庫的15株菌檢驗(yàn)發(fā)現(xiàn),其中5個(gè)菌株表現(xiàn)為羧芐青霉素抗性。由此可以看到羧芐青霉素抗性變化在轉(zhuǎn)座突變體中占有很大的比例。為了檢測(cè)突變體中羧芐青霉素抗性增強(qiáng)與哪些因素有關(guān),構(gòu)建了ampC與PA5514的突變體以及PA5514過表達(dá)菌株,并進(jìn)行濾紙片實(shí)驗(yàn)檢測(cè)羧芐青霉素抗性變化。另外我們對(duì)轉(zhuǎn)座突變體中8株羧芐青霉素抗性菌株以及10株羧芐青霉素敏感菌株進(jìn)行克拉維酸鉀與羧芐青霉素協(xié)同實(shí)驗(yàn),結(jié)果發(fā)現(xiàn)ampC及PA5514表達(dá)升高并不是羧芐青霉素抗性轉(zhuǎn)座突變體抗性產(chǎn)生的原因,基因組中存在新的條件誘導(dǎo)且受克拉維酸鉀抑制的β內(nèi)酰胺酶可能是銅綠假單胞菌抗羧芐青霉素的一種機(jī)制。因此,克拉維酸鉀與羧芐青霉素聯(lián)合使用能夠?qū)剐跃暧泻芎玫闹委熜Ч?/p>

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 培養(yǎng)基 LB培養(yǎng)基:10 g/L胰蛋白胨,5 g/L酵母粉,10 g/L氯化鈉,pH 7.0;假單胞菌分離瓊脂培養(yǎng)基:44.4 g/L假單胞分離瓊脂,2%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))甘油。

1.1.2 試劑與儀器 主要試劑:酵母粉、瓊脂、胰蛋白胨(OXOID);質(zhì)粒微量提取試劑盒及DNA產(chǎn)物純化試劑盒(北京博大泰克);慶大霉素(Gm)、羧芐青霉素(Cb)、克拉維酸鉀(Cla)等(Amresco);Taq酶和dNTP (Takara);其他有機(jī)試劑均為國產(chǎn)分析純。

主要儀器:恒溫培養(yǎng)箱(上海實(shí)驗(yàn)儀器廠有限公司);恒溫培養(yǎng)搖床ZHWY-100B(上海智誠分析儀器制造有限公司);立式高壓蒸汽滅菌器(HIRAYAMA);凝膠成像系統(tǒng)(SYNGENE);電泳儀(Bio-RAD)。

1.1.3 菌株、質(zhì)粒與引物 菌株、質(zhì)粒與引物見表1。

1.2 銅綠假單胞菌敲除突變體的構(gòu)建

以PA5514突變體的構(gòu)建為例。根據(jù)銅綠假單胞菌PA5514的基因序列設(shè)計(jì)引物(引物序列見表1),以PAO1基因組為模板擴(kuò)增PA5514上下游兩個(gè)片段,與pEX18Tc連接后得到質(zhì)粒載體pEX18Tc-PA5514;通過三親株雜交的方式進(jìn)行突變體構(gòu)建,其中供體菌為含有構(gòu)建質(zhì)粒pEX18Tc-PA5514的E.coli DH10B,受體菌為PAO1,介導(dǎo)菌是E.coli (pRK2013)。突變體構(gòu)建的原理是基因同源重組。挑取在含有鏈霉素(500 μg/mL)的PIA平板上生長的單克隆,通過PCR擴(kuò)增驗(yàn)證PA5514基因是否被破壞。

表 1 本研究所用菌株、質(zhì)粒與引物

Tab.1 Barcterial strains, plasmids and primers used in this study

StrainsRelevantcharacteristicsSourcePAO1WildtypeP．a(chǎn)eruginosaPAO1ThislabΔ5514PA5514knockoutmutantofPAO1ThisstudyPA0496TampCampCknockoutmutantoftransponsonmutantPA0496ThisstudyPAO1(pUCP26)ControlstraincontainingplasmidpUCP26inPAO1；TcRThisstudyPAO1(pUCP5514)PA5514overexpressionstrain；containingplasmidpUCP5514inPAO1；TcRThisstudyPA0714T(pUCP26)ControlstraincontainingplasmidpUCP26inPA0714；TcRThisstudyPA0714T(pUCP5514)PA5514overexpressionstrain；containingplasmidpUCP5514inPA0714transposonmutant；TcRThisstudyE．coliDH10BF-mcrAΔ(mrr?hsdRMS?mcrBC)φ80dlacZΔM15ΔlacX74recA1endA1ar?aD139Δ(araleu)7697galUgalKλ-rpsLnupGInvitrogenPA0496TTransposonmutantCbR．[15]PA0646TTransposonmutantCbR．[15]PA0714TTransposonmutantCbR．[15]PA0716?17TTransposonmutantCbR．[15]PA2699TTransposonmutantCbR．[15]PA2940TTransposonmutantCbR．[15]PA4554TTransposonmutantCbR．[15]PA4556TTransposonmutantCbR．[15]PA4456TTransposonmutantasacontrol．[15]PA5514mutantprimersUP?1：TCGGAATTCTCGTCGCCAAGTCAGTG(EcoRI)DOWN?1：AGTTCTAGAGGCTGTCGTTCCATTCGC(XbaI)UP?2：TACTCTAGAAACTCGGCTGGTGGGTGG(XbaI)DOWN?2：CATAAGCTTCGGCAATACCGTCCACC(HindIII)ThisstudyPA5514complementPrimersP?1：AGAGAATTCGGACGGGACAAGGACATC(EcoRI)P?2：CATAAGCTTGCATAGCGCCGAGGTGAT(HindIII)ThisstudyPlasmidspEX18TcoriT+sacB+genereplacementvectorwithmultiple?cloningsitefrompUC18，TcRThislabpRK2013Broad?host?rangehelpervector；Tra1，KanR[15]pUCP26MulticopyE．coli?P．a(chǎn)enrginosashuttlevectorwithanMCSwithinthelacZfragment；TcRThislabpUCP5514Complementationplasmid，pUCP26withaPCRfragmentcoveringtheentirePA5514gene；TcRThisstudy

TcR:四環(huán)素抗性; KanR:卡那霉素抗性;CbR:羧芐青霉素抗性;CbS:羧芐青霉素敏感;

1.3 銅綠假單胞菌過表達(dá)菌株的構(gòu)建

以PA5514過表達(dá)菌株構(gòu)建為例。根據(jù)銅綠假單胞菌PA5514的基因序列設(shè)計(jì)引物(引物序列見表1),以PAO1基因組為模板擴(kuò)增PA5514完整基因,與pUCP26連接后得到質(zhì)粒載體pUCP5514,將質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)入到E.coliDH10B中,純化后轉(zhuǎn)入PAO1菌株中,涂布培養(yǎng)后,挑取在含有Tc的PIA平板上生長的單克隆,提取質(zhì)粒進(jìn)行PCR驗(yàn)證,確定PA5514基因是否連接在質(zhì)粒上。

1.4 濾紙片協(xié)同實(shí)驗(yàn)

挑取待測(cè)菌株單克隆接入到5 mL LB液體中,37 ℃, 200r/min搖床中過夜培養(yǎng),將菌液濃度OD600調(diào)整一致后,取20 μL菌液加入到20 mL固體LB中,混勻凝固后,在濾紙片上點(diǎn)10 μL Cb (50mg/mL)以及5 μL Cla (12 mg/mL),37℃培養(yǎng)14～16 h后觀察抑菌圈大小。(注:由于敏感菌株及PA4456的抑菌圈過大影響觀察,因此Cb濃度調(diào)整為5 mg/mL)

2 結(jié) 果

2.1 抗性轉(zhuǎn)座突變體對(duì)Cb的抗性與AmpC的表達(dá)無關(guān)

實(shí)驗(yàn)室前期對(duì)篩選出的抗生素抗性相關(guān)菌株研究時(shí)發(fā)現(xiàn),許多轉(zhuǎn)座突變體都對(duì)羧芐青霉素表現(xiàn)出明顯的抗性;且我們檢測(cè)另外一個(gè)轉(zhuǎn)座突變體庫中已經(jīng)鑒定轉(zhuǎn)座子插入位點(diǎn)的突變體發(fā)現(xiàn),羧芐青霉素抗性菌株的比例為5/15(其中PA4937,PA2645,PA1015,PA5332以及PA5375轉(zhuǎn)座突變體表現(xiàn)出羧芐青霉素抗性),因此可以看出基因突變引起羧芐青霉素抗性的菌株在突變體中所占的比例很高。推測(cè)抗性產(chǎn)生的原因可能與突變體中β內(nèi)酰胺酶的表達(dá)升高有關(guān)。因此為了排除AmpC的影響,我們?cè)谄渲幸恢贽D(zhuǎn)座突變體PA0496的基礎(chǔ)上構(gòu)建了ampC的突變,檢測(cè)發(fā)現(xiàn)雙突變菌株對(duì)于Cb的抗性沒有發(fā)生明顯變化(如圖1)。

注:(1): 野生型PAO1;(2): PA4456轉(zhuǎn)座突變體;(3): PA0496 ampC;濾紙片上抗生素從左到右分別為Cb,Cb,Cla圖1 羧芐青霉素與克拉維酸鉀協(xié)同實(shí)驗(yàn)Fig.1 The synergistic effect of Cb and Cla

2.2 PA5514不影響PAO1對(duì)羧芐青霉素的抗性

銅綠假單胞菌基因組數(shù)據(jù)庫(http://www.pseudomonas.com/)中預(yù)測(cè)可能的β內(nèi)酰胺酶共有5個(gè)基因,其中4個(gè)是已知功能的ampC，ampD，sdsA1和PA5542(Pseudomonas imipenem beta-lactamase PIB-1)。PA5514功能預(yù)測(cè)為β內(nèi)酰胺水解酶,為了驗(yàn)證轉(zhuǎn)座突變體羧芐青霉素抗性的增強(qiáng)是否與該基因的高表達(dá)有關(guān),我們將pUCP5514質(zhì)粒轉(zhuǎn)入野生型PAO1和轉(zhuǎn)座突變體PA0714中,并且進(jìn)行抗生素敏感性實(shí)驗(yàn)。結(jié)果表明PA5514基因的過表達(dá)后,PAO1與轉(zhuǎn)座突變體PA0714對(duì)Cb和Amp兩種抗生素的敏感性沒有變化(如圖2),說明轉(zhuǎn)座突變體羧芐青霉素抗性的增強(qiáng)與PA5514的高表達(dá)無關(guān)。

注:(1)為PAO1 (pUCP26),(2)為PAO1 (pUCP5514),(3)為PA0714 (pUCP26),(4)為PA0714 (pUCP5514),抗生素添加位置左為Cb,右為Amp。圖2 濾紙片實(shí)驗(yàn)Fig.2 Antibiotics susceptibility test

為了進(jìn)一步確定基因PA5514的功能是否與轉(zhuǎn)座突變體抗生素敏感性的變化有關(guān),我們構(gòu)建了PA5514缺失突變體(如圖4)并對(duì)缺失突變體Δ5514和野生菌株進(jìn)行了Cb和Amp抗生素敏感性實(shí)驗(yàn),結(jié)果發(fā)現(xiàn)突變體Δ5514與野生菌株的抑菌圈并無明顯差異(如圖4)。因此,結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)PA5514與PAO1的羧芐青霉素抗性無直接關(guān)系。

注:培養(yǎng)平板上抗生素的添加位置左為Cb,右為Amp圖3 PAO1與Δ5514濾紙片實(shí)驗(yàn)Fig.3 The antibiotics susceptibility test in PAO1 and Δ5514

2.3 克拉維酸鉀可增加銅綠假單胞菌對(duì)羧芐青霉素的敏感性

克拉維酸鉀是β內(nèi)酰胺酶抑制劑,能夠不可逆的結(jié)合β內(nèi)酰胺酶使其失活,克拉維酸鉀與Cb協(xié)同實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)8株羧芐青霉素抗性增強(qiáng)的菌株Cb敏感性增強(qiáng)(如圖4)。為了確定轉(zhuǎn)座突變體中轉(zhuǎn)座子pBT20是否與這個(gè)現(xiàn)象有關(guān),我們隨機(jī)選取了1株與β內(nèi)酰胺類抗生素抗性無關(guān)的轉(zhuǎn)座突變體PA4456T,在相同條件下進(jìn)行協(xié)同實(shí)驗(yàn),結(jié)果為陰性(如圖1)。同時(shí),檢測(cè)了10株羧芐青霉素敏感菌株的協(xié)同作用情況,結(jié)果表明羧芐青霉素敏感菌株協(xié)同實(shí)驗(yàn)呈現(xiàn)陰性(數(shù)據(jù)未列),結(jié)果說明羧芐青霉素抗性菌株抗生素敏感性的變化與轉(zhuǎn)座子無關(guān)。

注:圖中從左到右分別為羧芐青霉素抗性轉(zhuǎn)座突變體PA4556T，PA2699T，PA0496T，PA0646T，PA2940T，PA4554T，PA0717T，PA0714T,其中Cb為羧芐青霉素,Cla為克拉維酸鉀圖4 羧芐青霉素抗性轉(zhuǎn)座突變體協(xié)同實(shí)驗(yàn)Fig.4 The synergistic effect of Cb and Cla in the resistance of transponson-insert mutants to Cb

3 討 論

銅綠假單胞菌對(duì)β內(nèi)酰胺類抗生素的耐藥形勢(shì)越來越嚴(yán)峻,研究表明,銅綠假單胞菌對(duì)β內(nèi)酰胺類抗生素的耐藥往往是多種耐藥機(jī)制共同作用的結(jié)果[2],其中β內(nèi)酰胺酶在耐藥機(jī)制中占有重要作用[16]。在對(duì)羧芐青霉素抗性的轉(zhuǎn)座突變體進(jìn)行研究時(shí),我們發(fā)現(xiàn)突變轉(zhuǎn)座體庫中羧芐青霉素抗性菌株所占比例在30%左右,因此為了探究如此高比例的抗性產(chǎn)生的原因。我們檢測(cè)了抗性菌株P(guān)A0496中外排泵MexAB的表達(dá),發(fā)現(xiàn)其表達(dá)幾乎與野生型中一致(數(shù)據(jù)未附),排除了外排泵表達(dá)變化所引起的抗性變化這一因素。因此我們推測(cè)可能是突變菌體中β內(nèi)酰胺酶表達(dá)升高引起的。Choi SH等報(bào)道Enterobacterspp.,Serratiamarcescens,Citrobacterfreundii以及Morganellamorganii等細(xì)菌在β內(nèi)酰胺類抗生素的誘導(dǎo)下,編碼β內(nèi)酰胺酶的基因ampC表達(dá)升高,并導(dǎo)致藥物治療的失敗,同樣PAO1在抗生素誘導(dǎo)下也可以產(chǎn)生各種β內(nèi)酰胺酶包括AmpC,水解β內(nèi)酰胺類抗生素,從而產(chǎn)生抗性[18]。為了排除AmpC的影響,我們?cè)谵D(zhuǎn)座突變體PA0496基礎(chǔ)上敲除ampC基因后,雙突變菌株的Cb抗性并沒有發(fā)生明顯變化,說明ampC并不影響銅綠假單胞菌的Cb抗性。通過銅綠假單胞菌基因數(shù)據(jù)庫比對(duì)發(fā)現(xiàn),編碼β內(nèi)酰胺酶的基因?yàn)镻A0740,ampC,ampD, PA5514, PA5542,其中PA0740編碼金屬β內(nèi)酰胺酶;ampC編碼β內(nèi)酰胺酶,ampD為ampC的調(diào)節(jié)基因,編碼的AmpD蛋白阻遏ampC的表達(dá);PA5542編碼亞胺培南水解酶;PA5514可能編碼β內(nèi)酰胺酶[17]。因此,我們?cè)谝吧蚉AO1與轉(zhuǎn)座突變體中過表達(dá)PA5514后并構(gòu)建了基因PA5514缺失突變體,濾紙片實(shí)驗(yàn)表明PA5514的表達(dá)升高并不會(huì)導(dǎo)致菌體Cb抗性增加。

突變體抗性的增加是否是由于其他未知β內(nèi)酰胺酶的表達(dá)升高引起的?為了論證這個(gè)猜測(cè)我們進(jìn)行了克拉維酸鉀與Cb的協(xié)同實(shí)驗(yàn)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)羧芐青霉素抗性菌株協(xié)同實(shí)驗(yàn)呈現(xiàn)陽性(圖4)?？死S酸鉀的主要功能是抑制β內(nèi)酰胺酶的作用[13],因此抗性菌株的出現(xiàn)依然可能是基因組中存在新的條件誘導(dǎo)且受克拉維酸鉀抑制的β內(nèi)酰胺酶。

銅綠假單胞菌在抗生素等壓力條件下不斷進(jìn)化,可能通過激活某種低表達(dá)的鈍化酶或者多種耐藥機(jī)制來更好地適應(yīng)環(huán)境,獲得生存優(yōu)勢(shì)[10]。本研究發(fā)現(xiàn)克拉維酸鉀與羧芐青霉素的聯(lián)合使用對(duì)于治療銅綠假單胞菌抗性菌株有十分明顯的效果,因此對(duì)羧芐青霉素抗性菌株的研究讓我們對(duì)銅綠假單胞菌的耐藥機(jī)制有更深入的認(rèn)識(shí),為治療銅綠假單胞菌感染提供新的思路。

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(編 輯 陳鐿文)

Carbenicillin Resistance Conferred by Uncharacterizedβ>Lactamase inPseudomonasaeruginosa

Dong Mengmeng, LIANG Qingqing, ZHANG Huiqun, GUO Zisheng, CHEN Lin

(Molecular Microbiology Laboratory, College of Life Sciences, Northwest University, Xi′an 710069， China)

To characterize the mechanism of carbenicillin resistance inPseudomonasaeruginosatransponson mutants. The mutant lackingampCon PA0496T background caused no change to carbenicillin susceptibility. Eight transposon mutants showed a reduced susceptibility when carbenicillin was combined with theβ-lactamase inhibitor clavulanate. Overexpression or deletion of a putativeβ-lactamase gene PA5514 also had no effect on the susceptibility to carbenicillin inPseudomonasaeruginosa. The results showed that a new uncharacterizedβ-lactamase inPsedumonasgenome might contribute to carbenicillin resistance. Carbenicillin combined with cavulanate exhibited inhibitor activity and could potentially be used to treat patients with currently pseudomonas infection.

Pseudomonasaeruginosa; carbenillin; beta lactamase; clavulanate potassium

2016-02-29

國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(31570131);教育部創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)支持基金資助項(xiàng)目(IRT-15R55);陜西省教育廳專項(xiàng)科研計(jì)劃基金資助項(xiàng)目(14JK1739)

董萌萌,女,陜西禮泉人，從事微生物相關(guān)研究。

R364.5

A

10.16152/j.cnki.xdxbzr.2016-06-010