銅綠假單胞菌質(zhì)粒介導的喹諾酮耐藥機制研究

李梅 王文香 潘發(fā)憤 沈躍飛

銅綠假單胞菌質(zhì)粒介導的喹諾酮耐藥機制研究

李梅 王文香 潘發(fā)憤 沈躍飛

目的 探討銅綠假單胞菌對質(zhì)粒介導喹諾酮類耐藥（PMQR）機制，為控制其耐藥性傳播提供依據(jù)。方法 篩選住院患者對環(huán)丙沙星耐藥的69株銅綠假單胞菌，PCR篩選質(zhì)粒介導的喹諾酮類耐藥基因[qnr，aac（6'）-Ib-cr]，陽性產(chǎn)物進行DNA測序，接合轉(zhuǎn)移試驗驗證PMQR基因。結(jié)果 69株受試株中，12株aac（6'）-Ib-cr基因陽性，經(jīng)DNA測序、BLAST比對，3株攜帶aac（6'）-Ib-cr基因（含有Trp-102→Arg和Asp-179→Tyr突變），另有3株為aac（6'）-Ib野生型；質(zhì)粒接合轉(zhuǎn)移試驗結(jié)果陰性；未檢出qnr基因。結(jié)論 銅綠假單胞菌PMQR基因以aac（6'）-Ib-cr基因為主，未檢出qnr基因，aac（6'）-Ib-cr基因介導低水平耐藥。

銅綠假單胞菌 質(zhì)粒介導喹諾酮耐藥 環(huán)丙沙星

銅綠假單胞菌是臨床最常見的非發(fā)酵革蘭陰性桿菌，近年來其對喹諾酮類藥物的耐藥性越來越強，這對臨床治療構(gòu)成嚴峻挑戰(zhàn)。研究發(fā)現(xiàn)，質(zhì)粒qnr基因介導細菌對喹諾酮類耐藥[1]，氨基糖苷乙酰轉(zhuǎn)移酶的變異基因aac（6′）-Ib-cr[2]以及喹諾酮類藥物特異性外排系統(tǒng)qepA和oqxAB[3]，均為質(zhì)粒介導喹諾酮類耐藥（PMQR）。國內(nèi)外關(guān)于PMQR的研究集中在腸桿菌科細菌，而在非發(fā)酵菌銅綠假單胞菌中報道較少。因此，筆者對我院69株對環(huán)丙沙星耐藥的銅綠假單胞菌進行PMQR（qepA和oqxAB除外）檢測，探討其耐藥機制，為臨床合理使用抗生素提供依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 菌株來源 篩選我院2012年1月至2014年12月住院患者對環(huán)丙沙星耐藥的69株銅綠假單胞菌（同一例患者同一部位重復分離株除外）。質(zhì)控菌株銅綠假單胞菌ATCC27853和大腸埃希菌ATCC25922購自衛(wèi)生部臨檢中心；疊氮化鈉耐藥大腸埃希菌J53及aac（6′）-Ib-cr、qnrA、qnrB、qnrS陽性菌株由浙江大學附屬邵逸夫醫(yī)院俞云松教授惠贈；qnrC、qnrD陽性菌株由復旦大學附屬華山醫(yī)院王明貴教授惠贈。

1.2 儀器及試劑 VITEK60全自動微生物分析儀、比濁儀（法國生物梅里埃公司），PCR擴增儀（德國Eppendorf公司），DYY-5型穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀（北京市六一儀器廠），WP-200A型紫外透射反射分析儀和UV-8000全自動凝膠成像分析系統(tǒng)（溫州奧利生物醫(yī)學儀器廠）。哥倫比亞瓊脂、MH瓊脂、胰蛋白胨（英國Oxoid公司），PCR試劑、引物（上海生物工程有限公司），環(huán)丙沙星標準品（中國衛(wèi)生部生物制品藥品檢定所）。

1.3 方法

1.3.1 基因組DNA提取 采用煮沸法提取細菌基因組DNA制備模板。

1.3.2 DNA電泳定量 制備0.8%的瓊脂糖凝膠，將1μl的DNA稀釋5倍后與1μl 6×上樣緩沖液混勻，加樣，電泳后在紫外燈下觀察并估約DNA的濃度，-20℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.3 引物 引物由上海生物工程公司合成，詳見表1。

表1PCR所用引物

表1 PCR所用引物

1.3.4 PCR檢測PMQR基因 初篩PMQR基因用25μl反應體系見表2，陽性菌株測序用50μl反應體系見表3，PCR反應循環(huán)參數(shù)：先94℃預變性3min，再按變性94℃30s→退火47℃30s→延伸72℃1min，循環(huán)35個周期，最后72℃延伸10min。

表2 PCR初篩體系

表3 PCR測序體系

1.3.5 PCR產(chǎn)物電泳檢測 PCR產(chǎn)物在含溴化乙啶1%的瓊脂糖中電泳后，用全自動凝膠成像分析系統(tǒng)觀察結(jié)果。

1.3.6 陽性PCR產(chǎn)物DNA測序 由北京華大基因公司進行正反雙向測序，測序結(jié)果先在本地數(shù)據(jù)庫比對，然后在NCBI中用BLAST比對分析。

1.3.7 質(zhì)粒接合轉(zhuǎn)移實驗 參照王明貴等[7]方法，以大腸埃希菌J53AZR（對疊氮化鈉耐藥）為接合實驗受體菌，攜帶aac（6′）-Ib-cr的銅綠假單胞菌為供體菌。取對數(shù)生長期的供體菌及受體菌到LB液體培養(yǎng)基中過夜培養(yǎng)，用胰蛋白胨大豆瓊脂平板[內(nèi)含疊氮化鈉（300μg/ml）及頭孢曲松（2μg/ml），為TSA平板]篩選接合子，提取接合子DNA進行PCR擴增。接合轉(zhuǎn)移實驗判斷標準見表4。

表4 接合轉(zhuǎn)移實驗判斷標準

2 結(jié)果

2.1 aac（6′）-Ib-cr基因 69株受試株中檢出aac（6′）-Ib陽性菌株12株，陽性率17.4%，經(jīng)DNA測序、BLAST比對，3株攜帶aac（6′）-Ib-cr基因（含有Trp-102→Arg和Asp-179→Tyr突變），陽性率25%；另有3株為aac（6′）-Ib野生型。部分菌株的PCR擴增產(chǎn)物電泳結(jié)果見圖1，aac（6′）-Ib-cr部分測序結(jié)果見圖2。

圖1 部分aac（6′）-Ib基因PCR電泳結(jié)果[1、2為aac（6′）-Ib基因陽性菌株，3為aac（6′）-Ib基因陰性菌株，M為分子量標準]

圖2 部分aac（6′）-Ib-cr測序結(jié)果

2.2 aac（6′）-Ib-cr基因的接合轉(zhuǎn)移實驗 在TSA篩選平板上無菌落生長，提示體外接合實驗陰性。

2.3 qnr基因檢測 69株受試株未檢出qnr基因，即未檢出qnrA、qnrB、qnrC、qnrD、qnrS基因。

3 討論

喹諾酮類藥物是一類重要的廣譜抗生素，抗菌作用強，可大量人工合成。隨著其廣泛應用，耐藥性問題也日益突出，既往研究集中在藥物靶位DNA旋轉(zhuǎn)酶（gyrA和gyrB）和拓撲異構(gòu)酶Ⅳ（parC和parE）基因突變，此染色體介導的突變僅能將耐藥性垂直傳播給下一代。qnr基因由1998年在多重耐藥的肺炎克雷伯菌質(zhì)粒上發(fā)現(xiàn)[1]，隨后PMQR機制成為研究熱點，質(zhì)粒水平傳播的特點，使PMQR基因的耐藥性在不同菌種間快速傳播，給臨床抗感染治療帶來威脅。

PMQR在各地報道檢出率從1%到40%～50%不等，與菌種有關(guān)，而大部分檢出菌株為腸桿菌科細菌，對非發(fā)酵菌報道較少，本研究探討PMQR在臨床銅綠假單胞菌中的分布。我院銅綠假單胞菌PMQR以aac（6′）-Ib-cr為主，aac（6′）-Ib-cr是氨基糖苷乙酰轉(zhuǎn)移酶aac（6′）-Ib的變異基因，僅由aac（6′）-Ib突變2個氨基酸后形成，可乙?；坞x氨基的喹諾酮類[8]，說明耐藥基因的變異對耐藥性有重要作用。

本實驗對aac（6′）-Ib的研究改變了以往通過酶切首先定位是否有aac（6′）-Ib-cr，然后再對變異菌株測序確證的方法[9-10]，而是直接對aac（6′）-Ib陽性的菌株進行DNA測序，研究aac（6′）-Ib-cr基因是否存在。本研究共檢出3株銅綠假單胞菌攜帶aac（6′）-Ib-cr基因（含有Trp-102→Arg和Asp-179→Tyr突變），占 aac（6′）-Ib陽性菌株的17.4%，低于在MDRPA中的檢出率[9]。Trp102→Arg和Asp179→Tyr兩次突變賦予了aac（6′）-Ib-cr修飾喹諾酮類的能力，可使細菌對環(huán)丙沙星及諾氟沙星的MIC值上升4倍，機制為此基因編碼的滅活酶可使環(huán)丙沙星及諾氟沙星中的氨基氮“-NH”乙?；?，從而使其抗菌活性下降[8]。我院aac（6′）-Ib-cr基因在2012年中即有檢出，但3年檢出率不高，提示aac（6′）-Ib-cr介導低水平耐藥。本研究中aac（6′）-Ib-cr基因的接合轉(zhuǎn)移實驗陰性，這可能與供體菌數(shù)量較少有關(guān)，目前國內(nèi)關(guān)于非發(fā)酵菌的此類轉(zhuǎn)移性報道也較少。

本研究69株銅綠假單胞菌中未檢出qnr基因，說明目前此基因未在我院流行。qnr家族的檢出率非常低，Ogbolu等[11]曾在134株臨床菌株中僅發(fā)現(xiàn)l株銅綠假單胞菌攜帶qnrD。

雖然PMQR耐藥基因只引起低水平耐藥，但此耐藥性可使細菌數(shù)量達到突變濃度，從而出現(xiàn)高水平耐藥[12]，導致醫(yī)院內(nèi)甚至更大范圍流行，且aac（6′）-Ib-cr所介導喹諾酮類耐藥機制比qnr更為常見，本研究對本地區(qū)菌株流行、院感控制提供了第一手資料，應加強對耐藥菌株監(jiān)測，合理選用抗生素，從而控制aac（6′）-Ibcr基因在醫(yī)院的傳播。

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Identification of multidrug resistance genes in quinolone-resistance Pseudomonas aeruginosa with plasmid conjugation method

LI Mei, WANG Wenxiang,PAN Fafen,et al.Department of Infectious Diseases,the First Xiaoshan People's Hospital,Hangzhou 311200, China

Objective To identify multidrug resistance genes in quinolones resistance-Pseudomonas aeruginosa(PMQR). Methods Sixty nine clinical isolated of ciprofloxacin-resistant Pseudomonas aeruginosa were collected.Quinolone resistance genes[qnr,aac (6')-Ib-cr]were screened with PCR plasmid-mediated method,positive products were DNA sequenced,and PMQR genes were verified with plasmid conjugation method. Results Among 69 strains tested,12 were aac (6')-Ib-cr gene positive shown by DNA sequencing,BLAST comparison,including 3 contained mutated aac (6')-Ib-cr gene (Trp-102→Arg and Asp-179→Tyr),and another 3 carried wild type aac(6')-Ib;while plasmid conjugation test was negative and qnr gene was not detected. Conclusion The clinical isolates of Pseudomonas aeruginosa are aac (6')-Ib-cr-based low-level resistance PMQR,and qnr gene is not detected.

Pseudomonas aeruginosa Plasmid-mediated quinolone resistance Ciprofloxacin

2015-08-27）

（本文編輯：嚴瑋雯）

311200 杭州市蕭山區(qū)第一人民醫(yī)院感染科（李梅、王文香、沈躍飛）；溫州醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院感染科（潘發(fā)憤）

李梅，E-mail：limei.china@163.com