基于高通量測序的肉牛墊料養(yǎng)殖床中細菌群落分析

周德平 褚長彬 趙 崢 姜震方 吳淑杭*(上海市農(nóng)業(yè)科學院生態(tài)環(huán)境研究所 0403；上海東保農(nóng)業(yè)科技有限公司，上海市閔行區(qū) 006)

基于高通量測序的肉牛墊料養(yǎng)殖床中細菌群落分析

周德平1,2褚長彬1趙 崢1姜震方1吳淑杭1*(1上海市農(nóng)業(yè)科學院生態(tài)環(huán)境研究所 201403；2上海東保農(nóng)業(yè)科技有限公司，上海市閔行區(qū) 201106)

利用Roche 454GSFLX+高通量測序平臺分析了肉牛墊料養(yǎng)殖床中的細菌群落結(jié)構(gòu)，結(jié)果顯示，從發(fā)酵床樣品中共獲得17 772條有效序列，其中優(yōu)質(zhì)序列有13 301條，在97%相似水平上聚為1 603個OTU分類單元；目水平上，細菌優(yōu)勢種群集中在芽孢桿菌目（21.70%）、紅螺菌目（18.20%）、乳桿菌目（14.90%）、梭菌目（14.10%）、黃桿菌目（10.50%）、伯克氏菌目（5.50%）、黃單胞菌目（3.00%）、放線菌目（2.10%）和根瘤菌目（1.80%）；屬水平上，細菌的優(yōu)勢種群主要集中于醋酸桿菌屬（15.17%）、金黃桿菌屬（9.50%）、乳桿菌屬（6.90%）、芽孢桿菌屬（6.30%）、乳球菌屬（6.0%）、高溫放線菌屬（3.50%）、類芽孢桿菌屬（2.40%）、梭菌目（2.10%）、伯克氏菌屬（2.10%）和葡萄糖醋桿菌屬（1.80%）。

墊料養(yǎng)殖；肉牛；細菌種群結(jié)構(gòu)；高通量測序

有關(guān)研究表明，一頭泌乳牛日平均排泄糞便32.1 kg、尿20.2 kg，按此計算，一家千頭奶牛場的年均糞便產(chǎn)生量為11 717 t、尿7 373 t左右，由此對周邊環(huán)境造成了巨大壓力。目前，上海地區(qū)奶牛場配套的糞尿處理設(shè)施主要為沼氣發(fā)酵，但其本身作為一種能源工程，產(chǎn)生的沼渣、沼液也需進行合理的處置，而目前所面臨的現(xiàn)狀是海量的沼液無處可排，對周邊農(nóng)田生態(tài)系統(tǒng)和水環(huán)境產(chǎn)生了較大威脅。墊料養(yǎng)牛技術(shù)是利用牛棚中鋪設(shè)的墊料基質(zhì)中功能微生物群落對糞尿進行降解和消納，并利用翻耙設(shè)備定時將表面的糞尿與墊料混合，該技術(shù)不僅實現(xiàn)了糞尿的自然降解，還可改善養(yǎng)殖環(huán)境。

為明確肉牛墊料養(yǎng)殖中的細菌群落組成，以生產(chǎn)中穩(wěn)定運行2年的肉牛發(fā)酵床的墊料基質(zhì)為研究對象，利用Roche 454 GS FLX+高通量測序平臺，對發(fā)酵床基質(zhì)中細菌16s V1-V3 區(qū)全長進行了測序、分析，以探尋其中的細菌群落結(jié)構(gòu)組成，從而尋找出發(fā)揮功效的主要微生物種群。

1 材料與方法

1.1 樣品來源

試驗用的肉牛發(fā)酵床基質(zhì)來源于上海牛奶集團的躍一奶牛養(yǎng)殖場，在實際養(yǎng)殖過程中已穩(wěn)定運行2年，基本實現(xiàn)糞尿不外排。

1.2 目標序列、所用引物及分析用數(shù)據(jù)庫

細菌分析16s V1～V3 區(qū)全長，rDNA 通用引物序列為：

融合引物為：

細菌OUT聚類分析用Greengene數(shù)據(jù)庫信息。

2 結(jié)果與分析

圖1 細菌優(yōu)質(zhì)序列長度分布

圖2 肉牛發(fā)酵床中主要細菌優(yōu)勢種群分布（目水平）

2.1 序列數(shù)分析

經(jīng)454焦磷酸測序后，從樣品中共獲得細菌群落17 772條有效序列，其中優(yōu)質(zhì)序列有13 301條，優(yōu)質(zhì)序列的長度主要分布在440～540 bp的范圍間（見圖1），可滿足對細菌屬種水平分類信息的需求。

表1 肉牛發(fā)酵床中主要細菌優(yōu)勢種群比例分析（屬水平）

2.2 目水平上，肉牛發(fā)酵床中細菌優(yōu)勢種群分析

OTU（Operational Taxonomic Units 操作分類單元）是在系統(tǒng)發(fā)生學或群體遺傳學研究中，為了便于分析，人為給某一個分類單元（品系、屬、種、分組等）設(shè)置的同一標志。將序列按照一定的相似性歸為許多分類單元，1個單元就是1個OTU。本研究對優(yōu)質(zhì)序列按相似度0.97進行聚類，以每個類最長的序列為代表序列，在Greengene(Release 13.8 http://greengenes.secondgenome.com/)數(shù)據(jù)庫的基礎(chǔ)上，采用blast方法對序列進行比對分析，獲得每個OTU的分類信息。

對目標樣品中獲得的13 301條優(yōu)質(zhì)序列進行聚類，共獲得1 603個細菌OTU分類單元。在目水平上，細菌優(yōu)勢種群的分布（見圖2）。其中芽孢桿菌目（Bacillales）的比例最大，占細菌群落的21.70%，其次為紅螺菌目（Rhodospirillales），為18.20%，接下來依次為乳桿菌目（Lactobacillales）14.90%、梭菌目（Clostridiales）14.10%、黃桿菌目（Flavobacteriales）10.50%、伯克氏菌目（Burkholderiales）5.50%、黃單胞菌目（Xanthomonadales）3.00%、放線菌目（Actinomycetales）2.10%、根瘤菌目（Rhizobiales）1.80%等。

2.3 屬水平上，肉牛發(fā)酵床中細菌優(yōu)勢種群分析

在屬水平上，肉牛發(fā)酵床中細菌優(yōu)勢種群的分布（見表1）。其中種群比例最大的為醋酸桿菌屬（Acetobacter），占整個群落中的15.17%；其次為金黃桿菌屬，為9.50%；然后依次為乳桿菌屬6.90%、芽孢桿菌屬6.30%、乳球菌屬6.0%、高溫放線菌屬3.50%、類芽孢桿菌屬2.40%、梭菌目2.10%、伯克氏菌屬2.10%、葡萄糖醋桿菌屬1.80%等。

3 小 結(jié)

分析結(jié)果表明，對肉牛發(fā)酵床墊料基質(zhì)樣品進行高通量測序后共獲得13 301條優(yōu)質(zhì)序列，在97%相似水平上，所獲全部優(yōu)質(zhì)序列共聚為1 603個OTU分類單元。在細菌分類中，目水平上，肉牛發(fā)酵床墊料基質(zhì)中主要的細菌優(yōu)勢種群集中在芽孢桿菌目（21.70%）、紅螺菌目（18.20%）、乳桿菌目（14.90%）、梭菌目（14.10%）、黃桿菌目（10.50%）、伯克氏菌目（5.50%）、黃單胞菌目（3.00%）、放線菌目（2.10%）和根瘤菌目（1.80%）；屬水平上，肉牛發(fā)酵床墊料基質(zhì)中主要的細菌優(yōu)勢種群集中于醋酸桿菌屬（15.17%）、金黃桿菌屬（9.50%）、乳桿菌屬（6.90%）、芽孢桿菌屬（6.30%）、乳球菌屬（6.0%）、高溫放線菌屬（3.50%）、類芽孢桿菌屬（2.40%）、梭菌目（2.10%）、伯克氏菌屬（2.10%）和葡萄糖醋桿菌屬（1.80%）。

2016-05-27

崇明區(qū)科技攻關(guān)項目（編號：CK2014-11）。

*為通訊作者。