珙桐的外植體選材及組織快繁啟動(dòng)

郭文久

（安康學(xué)院化學(xué)化工系/陜西省安康GAP工程技術(shù)研究中心，陜西安康725000）

珙桐的外植體選材及組織快繁啟動(dòng)

郭文久

（安康學(xué)院化學(xué)化工系/陜西省安康GAP工程技術(shù)研究中心，陜西安康725000）

珙桐(Davidia involucrata)是一種瀕危的孑遺植物，由于其花形優(yōu)美，在園林綠化中具有很大的應(yīng)用價(jià)值。但珙桐種子繁殖或扦插等繁殖方式都非常困難，無論從種質(zhì)保護(hù)還是經(jīng)濟(jì)應(yīng)用的需要，開展珙桐的快速繁殖組織培養(yǎng)技術(shù)研究都十分重要。本研究對(duì)珙桐組織培養(yǎng)的外植體選擇、消毒液升汞的不同濃度和基本培養(yǎng)基進(jìn)行了詳細(xì)研究。結(jié)果表明，選擇春季的鱗芽及半木質(zhì)化的帶芽枝條效果較好，75%的酒精消毒10 s及0.1%升汞消毒10 min基本能達(dá)到要求，而基本培養(yǎng)基以WPM培養(yǎng)基效果最好。研究結(jié)果構(gòu)建了珙桐的以芽繁芽技術(shù)體系，但組培苗的生根需要進(jìn)一步研究。

珙桐組織培養(yǎng)；外植體選擇；外植體消毒；WPM培養(yǎng)基

0 引言

珙桐(Davidia involucrate)是第三紀(jì)孑遺植物，同時(shí)其開花的時(shí)候，花色雪白、花形猶如展翅飛翔的鴿子，所以又叫鴿子樹[1-5]。但是現(xiàn)在這個(gè)物種面臨滅絕。對(duì)這個(gè)物種通過組織培養(yǎng)方法進(jìn)行快速繁殖是恢復(fù)其生態(tài)種群的重要途徑之一。同時(shí)各地綠化工程也在廣泛地將珙桐作為行道樹進(jìn)行栽培，需求量巨大。由于珙桐具有極高的園林綠化價(jià)值，對(duì)珙桐進(jìn)行組織快繁將產(chǎn)生巨大的經(jīng)濟(jì)效益[1,5-9]。

由于珙桐是一種高大的喬木，對(duì)大多數(shù)未經(jīng)馴化的木本植物的組培都還存在一定的技術(shù)難度。主要是外植體的選材、消毒、褐變等問題不能很好解決。就珙桐而言，目前處于瀕危狀態(tài)，種子構(gòu)造類似黑桃。最外層有一層果肉，果肉會(huì)自然干腐，但不會(huì)自行脫落，在果肉與種仁之間是一層厚厚的堅(jiān)硬外殼，種子內(nèi)部還有大量的敗育情況，去掉種子外殼后無種仁的情況至少有1/3，所以通過種子繁殖的時(shí)候出苗率極其低下。珙桐還具有二次休眠，休眠時(shí)間最長達(dá)3年之久。要大面積恢復(fù)珙桐的生態(tài)種群，完全靠自然的種子繁殖將會(huì)存在較大的問題。國內(nèi)外雖然有部分資料表明對(duì)珙桐進(jìn)行了組培快繁，但效果都極其有限[6,10-13]。所以對(duì)珙桐的組培快繁仍然處于嘗試階段。我們主要是針對(duì)外植體選材、消毒、抗褐變等進(jìn)行了初步研究，希望能建立一套高效的快速繁育體系。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)時(shí)間、地點(diǎn)

本研究僅進(jìn)行了室內(nèi)組織培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)研究工作。實(shí)驗(yàn)在安康學(xué)院化學(xué)化工系隸屬的陜西省安康GAP工程技術(shù)研究中心的藥用植物組織培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)室完成了所有研究工作。

1.2 試驗(yàn)材料

珙桐外植體選自2006年從陜西鎮(zhèn)坪移栽到安康學(xué)院校內(nèi)花園的植株及原安康市科技局家屬院花園的植株。取材時(shí)間2014年3—10月。

外植體分別選取大樹嫩枝、從大樹旁邊地上長出來的嫩枝、初春冬芽、秋季形成的冬芽做單因素消毒核繁殖啟動(dòng)試驗(yàn)。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì)對(duì)基本培養(yǎng)基進(jìn)行了單因素設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)，處理A為MS全量、處理B為1/2MS、處理C為WPM全量，其他成分均為添加2 mg/L 6-BA+0.1 mg/L NAA+40 g/L蔗糖+8 g/L瓊脂粉，區(qū)組重復(fù)3次，一次做完所有處理為一個(gè)區(qū)組，每個(gè)處理重復(fù)25個(gè)350 mL培養(yǎng)瓶，每個(gè)培養(yǎng)瓶內(nèi)含25 mL固體培養(yǎng)基。

對(duì)外植體的研究也是單因素室內(nèi)隨機(jī)區(qū)組試驗(yàn)，設(shè)置水平分別為大樹幼芽、從大樹旁邊地里長出的幼枝、初春冬芽和秋季形成芽。重復(fù)方式同上。

消毒方法試驗(yàn)一樣采用單因素隨機(jī)區(qū)組法，處理水平為升汞(HgCl2)濃度梯度為0.01%、0.05%、0.1%及0.15%處理。消毒程序均為自來水反復(fù)清洗，隨后75%酒精消毒10 s，然后進(jìn)行不同濃度的升汞消毒試驗(yàn)。升汞消毒時(shí)間均為10 min。重復(fù)方式同上。

培養(yǎng)基的配制方法參見文獻(xiàn)[14]。

啟動(dòng)的標(biāo)準(zhǔn)為培養(yǎng)1個(gè)月時(shí)觀察幼芽萌發(fā)超過1cm。污染率記為培養(yǎng)1個(gè)月時(shí)瓶子內(nèi)有雜菌菌落或者培養(yǎng)基表面有培養(yǎng)物之外的其他生物。

1.3.2 精密儀器和藥品規(guī)格研究所用組培設(shè)備都是常用設(shè)備。包括上海博迅實(shí)業(yè)有限公司生產(chǎn)的YXQLS-75SII型高壓滅菌鍋、BOXUN SPX-300IC型微電腦人工氣候箱和SW-CJ-2FD型潔凈等級(jí)100級(jí)的超凈工作臺(tái)。大龍興創(chuàng)實(shí)驗(yàn)儀器（北京）有限公司生產(chǎn)的1000～5000 μL和100～1000 μL DragonLAB移液槍。深圳市柯迪達(dá)電子有限公司生產(chǎn)的CT-6321型pH（筆式）酸度計(jì)。

國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司生產(chǎn)的α-萘乙酸(NAA)純度≥98%、6-芐氨基嘌呤(6-BA)純度≥99%、分析純K2SO4、MgSO4·7H2O、KH2PO4、NH4NO3、MnSO4· 4H2O、ZnSO4·7H2O、H3BO3、CuSO4·5H2O、Na2MoO4·2H2O、Ca(NO3)2·4H2O、FeSO4·7H2O、Na2EDTA、化學(xué)純肌醇、甘氨酸、VB1、VB6、VB5；廣東環(huán)凱微生物科技有限公司生產(chǎn)的技術(shù)瓊脂粉。

1.3.3 統(tǒng)計(jì)分析所有數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析都是采用的微軟的Excel電子表格和SPSS處理和計(jì)算。統(tǒng)計(jì)顯著水平均取5%。

2 結(jié)果與分析

2.1 外植體選擇試驗(yàn)

試驗(yàn)應(yīng)用多種方式進(jìn)行選材，試材主要有大樹嫩枝、從大樹旁邊地上長出來的嫩枝、初春冬芽和秋季形成的冬芽。試驗(yàn)結(jié)果參見圖1。

圖1 外植體啟動(dòng)試驗(yàn)結(jié)果

從圖1可以看出，大樹幼芽和秋季冬芽的萌發(fā)率低污染率高，不是理想的組織培養(yǎng)外植體。從大樹旁邊地上生長出來的幼芽和初春冬芽的萌發(fā)率高，而污染相對(duì)較少。而未啟動(dòng)的比率四者差異不是太大。主要問題還是集中在污染上。

2.2 消毒試驗(yàn)

外植體從田間采集下來之后，裝于黑色干凈的塑料袋中經(jīng)過小于2 km的運(yùn)輸帶回實(shí)驗(yàn)室。將外植體剪切成單芽的小段，斷頭在酒精燈上燒干封閉，以防止褐變。隨后用自來水進(jìn)行反復(fù)沖洗并用毛刷對(duì)表面及鱗芽附近角落進(jìn)行了反復(fù)刷洗。之后室溫晾干1～2 h。然后再進(jìn)入酒精消毒和升汞消毒程序。對(duì)升汞消毒程序進(jìn)行了優(yōu)化。優(yōu)化結(jié)果參見圖2。

圖2 不同升汞濃度消毒優(yōu)化試驗(yàn)結(jié)果

從圖2看出在0.01%和0.05%的低濃度升汞消毒結(jié)果中，幾乎沒有大的差異，污染率都很高。而在0.15%的高濃度處理中雖然沒有污染，但是材料也基本殺死了。所以最適宜升汞濃度為0.1%。

2.3 培養(yǎng)基及激素配比試驗(yàn)

珙桐是一種沒有馴化的瀕危野生木本植物。之所以瀕危是由于自身的繁殖力比較弱，生殖能力退化較為嚴(yán)重，推測可能對(duì)培養(yǎng)基的要求會(huì)比較特殊。所以有必要對(duì)培養(yǎng)基進(jìn)行優(yōu)化。

從圖3可以看出，MS培養(yǎng)基基本上不分化，而1/2MS培養(yǎng)基的分化比例也是相當(dāng)有限，只有約5%左右。而WPM培養(yǎng)基的狀況就大為改觀，分化率達(dá)到50%以上。

3 討論

對(duì)組織培養(yǎng)外植體的選擇與培養(yǎng)成功與否常常具有關(guān)鍵性的作用。不同季節(jié)、不同部位以及不同生長狀態(tài)的外植體對(duì)組培成功與否都有巨大的影響。在本研究中發(fā)現(xiàn)，木質(zhì)化程度較高的枝條消毒難度很大，無論怎么反復(fù)消毒，2～3天之后仍然會(huì)被污染，其原因可能就是污染病菌能夠在木質(zhì)部中存活，可以成功躲過消毒劑對(duì)病菌的傷害。相反，如果選用了木質(zhì)化程度很低的新芽，一般的消毒程序大多會(huì)殺死新芽，雖然沒有污染，但培養(yǎng)對(duì)象同時(shí)也被殺死了[9,15-22]。所以選擇半木質(zhì)化的外植體是繁殖成功的關(guān)鍵。

圖3 基本培養(yǎng)基實(shí)驗(yàn)結(jié)果

同時(shí)珙桐的鱗芽對(duì)消毒和繁殖具有巨大的影響。早春的鱗芽優(yōu)于秋季形成的鱗芽。據(jù)觀察，可能主要原因在于污染狀況的不同。早春的鱗芽因?yàn)榻?jīng)過了一個(gè)冬季之后，鱗芽中攜帶的病菌相對(duì)較少，所以容易啟動(dòng)，而秋季形成的、看起來很飽滿的鱗芽，由于沒有經(jīng)過冬季的低溫，所以鱗芽中包含大量的病菌，這些病菌由于鱗片的包裹而躲過了消毒劑的作用，最后還是會(huì)污染。在筆者的觀察中發(fā)現(xiàn)，形成于3、4、5月的鱗芽繁殖率很高，這個(gè)時(shí)間形成的鱗芽較小，看起來不飽滿，但很容易消毒，經(jīng)過培養(yǎng)也很容易啟動(dòng)。同時(shí)還觀察到，大的鱗芽由于鱗片的阻擋還會(huì)使啟動(dòng)后的新芽受到鱗片的機(jī)械阻擋而導(dǎo)致新芽生長夭折。

總的來說，對(duì)于珙桐外植體的選擇，最好是選自秋冬形成的鱗芽，2～5月來進(jìn)行培養(yǎng)，這段時(shí)間的鱗芽消毒較為容易、啟動(dòng)頻率較高，在培養(yǎng)瓶中的生長速度也比較快，與其他人研究結(jié)果類似[6,9,23-29]。

研究比較了升汞和二氯異氰尿酸鈉（有效成分為次氯酸鈉）多個(gè)濃度的消毒效果，發(fā)現(xiàn)升汞的效果要優(yōu)于二氯異氰尿酸鈉。但是升汞的毒性和消毒液的處理確實(shí)存在較大的麻煩。堅(jiān)持使用升汞作為消毒劑實(shí)屬無奈之舉。

在升汞的不同濃度的消毒效果比較中，發(fā)現(xiàn)0.1%和0.15%都是可行的，只要控制好消毒時(shí)間，都可以達(dá)到較為滿意的效果。濃度較高的時(shí)候，適度縮短消毒時(shí)間就可以了。

本研究中也比較了基本培養(yǎng)基對(duì)珙桐組培的影響。圖3展示的只是啟動(dòng)的情況。筆者發(fā)現(xiàn)，不論是全量MS或者是1/2MS培養(yǎng)基都存在問題，培養(yǎng)效果都不理想，只有WPM培養(yǎng)基具有較好的效果。全量MS培養(yǎng)基可能是由于總鹽濃度較高的原因，在初代培養(yǎng)或者轉(zhuǎn)接培養(yǎng)中幾乎都沒有反應(yīng)或者轉(zhuǎn)接物死亡，而WPM培養(yǎng)基就能順利的生長。這與國內(nèi)較早的研究認(rèn)為N6培養(yǎng)基較好不一致[10-12]，由于沒有比較過WPM與N6培養(yǎng)基，孰優(yōu)孰劣也未可知。與四川農(nóng)業(yè)大學(xué)的研究結(jié)果認(rèn)為最佳的是1/2MS培養(yǎng)基也不一致[9-13,30-32]，在筆者的實(shí)驗(yàn)中1/2MS效果很差。

4 結(jié)論

筆者對(duì)珙桐組織培養(yǎng)前后進(jìn)行了近1年的研究，也設(shè)計(jì)了多個(gè)試驗(yàn)，主要圍繞外植體選擇、消毒、基本培養(yǎng)基的選擇以及激素種類和配比的選擇。雖然有了一些初步的結(jié)果，但結(jié)果并不是非常滿意。珙桐的組織培養(yǎng)具有一定的難度，猜想主要可能是由于珙桐是一種瀕危植物，自身繁殖力比較弱，同時(shí)還由于目前使用的珙桐材料都是未經(jīng)馴化的野生物種，這種外植體對(duì)消毒劑、基本培養(yǎng)基總鹽濃度的耐受力等都比較弱[3,7-8,13,33]。同時(shí)，本研究雖然實(shí)施了多個(gè)試驗(yàn)計(jì)劃，但未能獲得生根植株，也是今后繼續(xù)進(jìn)行研究的動(dòng)力。

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致謝：本研究的部分工作有安康學(xué)院化學(xué)化工系化學(xué)工程與工藝專業(yè)2010級(jí)7名學(xué)生參與，這7名同學(xué)分別是馬祥祥、成云、潘雙全、王康軍、譚靜、張寧、張薇。作者在此對(duì)7名同學(xué)的工作表示真誠的感謝。

Explant Selection and Micro Propagation Start of Davidia involucrata

Guo Wenjiu
(Department of Chemistry&Chemical Engineering,Ankang University/ Ankang GAP Engineering Technology Centre of Shaanxi Province,Ankang 725000,Shaanxi,China)

Davidia involucrata is an endangered ancient relic species.As the flower shape of Davidia involucrata is graceful,it has great application value in gardening.But Davidia involucrata has obstacles in seed and shoot cutting propagation.Therefore,it is urgent to develop the technology of plant tissue culture for establishing a fast propagation system according to the needs of both germplasm conservation and economic application.In this research,explant selection,different concentrations of mercuric chloride disinfectant and basal culture media were explored.The results showed that spring bud and semi-lignified branches with bud were the best explants,and 75%alcohol disinfection for 10 s and followed by 0.1%HgCl2disinfection for 10 min could meet the need,and the WPM basal media had the best effect.The results built the bud proliferation technique system,but the rooting of cultured seedlings need to be further studied.

Davidia involucrata Tissue Culture;Explant Selection;Explant Disinfection;WPM Culture Media.

S688.2

A論文編號(hào)：cjas15030023

陜西省科學(xué)技術(shù)研究發(fā)展計(jì)劃項(xiàng)目“珍惜觀賞植物珙桐組織快繁關(guān)鍵技術(shù)研究”(2014K14-01-10)；陜西省教育廳省級(jí)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室科研計(jì)劃項(xiàng)目“組織培養(yǎng)法多倍體桑樹遺傳材料創(chuàng)新研究”(13JS002)；陜西省自然科學(xué)基礎(chǔ)研究計(jì)劃項(xiàng)目“瀕危藥用植物陰地蕨快速繁殖研究”(2013JM4017)。

郭文久，男，1964年出生，副教授，博士，研究方向?yàn)橐吧幉募熬G化植物資源開發(fā)與利用。通信地址：725000陜西省安康市育才路92號(hào)安康學(xué)院化學(xué)化工系，Tel：0915-3261915，E-mail：gwjdata@163.com。

2015-03-18，

2015-10-27。