HPLC-DAD法同時(shí)測定糖痹康中6種主要活性成分

魏 穎，王東超，高佳琪，秦靈靈，孫 文，張 巖，石浩霞，蘭 衛(wèi)，徐暾海*，劉銅華

(1.北京中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院，北京 100029；2.北京中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)養(yǎng)生學(xué)北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100029；3.北京中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)養(yǎng)生學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100029；4.新疆醫(yī)科大學(xué)中醫(yī)學(xué)院，烏魯木齊 830011)

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HPLC-DAD法同時(shí)測定糖痹康中6種主要活性成分

魏 穎1,2,3，王東超1,2,3，高佳琪1,2,3，秦靈靈2,3，孫 文2,3，張 巖2,3，石浩霞1,2,3，蘭 衛(wèi)4，徐暾海1,2,3*，劉銅華2,3

(1.北京中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院，北京 100029；2.北京中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)養(yǎng)生學(xué)北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100029；3.北京中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)養(yǎng)生學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100029；4.新疆醫(yī)科大學(xué)中醫(yī)學(xué)院，烏魯木齊 830011)

目的 研究糖痹康顆粒6種活性成分的含量同時(shí)測定的方法。方法 采用HPLC-DAD法測定糖痹康顆粒中6種活性成分的含量，C18色譜柱(150 mm,4．6 mm,5 μm),0．1%甲酸與水-0．1%甲酸與乙腈(18%～60%)梯度洗脫；檢測λ為多波長檢測分別是:196、201、202、204、276、228 nm；用標(biāo)準(zhǔn)曲線法測定。結(jié)果 6種活性成分在5 ～ 600 μg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，回歸方程分別為:芍藥苷：Y=227 988X+182，R2=0．999 1；毛蕊異黃酮葡萄糖苷：Y=417 929X-213，R2=0．999 7；特女貞苷：Y=199 569X-312，R2=0．998 3；迷迭香酸：Y=364 936X+152，R2=0．998 1；黃芩苷:Y=64 131X+362,R2=0．999 4；小檗堿：Y=87 882X+111，R2=0．999 5。6種活性成分的加樣回收率分別為：芍藥苷：101．44%(RSD=0．48%)；毛蕊異黃酮葡萄糖苷：99．99%(RSD=0．43%)；特女貞苷102．07%(RSD=0．57%)；迷迭香酸：98．38%(RSD=0．46%)；黃芩苷：102．71%(RSD=0．485%)；小檗堿：99．54%(RSD=0．77%)。結(jié)論 所建立含量測定方法簡便、快捷、可靠，可用于糖痹康顆粒的質(zhì)量控制。

糖痹康顆粒；活性成分；HPLC-DAD；含量測定

糖尿病(DM)是世界上發(fā)病率最高的疾病之一，以持續(xù)高血糖為基本生化特征的一種綜合性疾病，嚴(yán)重威脅人類生命[1-5]。糖尿病周圍神經(jīng)病變(DPN)是糖尿病常見并發(fā)癥之一，其發(fā)病機(jī)制十分復(fù)雜，并非單一因素所致。本課題組通過大量的前期研究[6-15]表明：糖痹康顆粒用于治療糖尿病周圍神經(jīng)病變具有很好的療效。課題組組長劉銅華教授經(jīng)過多年的臨床研究，認(rèn)為本病主要病機(jī)為“氣陰不足，毒瘀神絡(luò)”，并在國內(nèi)外首次提出“益氣養(yǎng)陰、解毒化瘀通絡(luò)”的新治療原則。中藥復(fù)方糖痹康是在這一治則指導(dǎo)下,在傳統(tǒng)經(jīng)方黃芪桂枝五物湯基礎(chǔ)上，結(jié)合現(xiàn)代研究成果和臨床經(jīng)驗(yàn)創(chuàng)制的，先后經(jīng)多年臨床驗(yàn)證，不斷優(yōu)化處方，其組方及制備工藝已成功申報(bào)發(fā)明專利(專利申請?zhí)?200810167551．1)。本實(shí)驗(yàn)通過對糖痹康中前期研究鎖定的6種主要活性成分的含量測定方法進(jìn)行研究,旨在有效的對復(fù)方中藥糖痹康顆粒進(jìn)行質(zhì)量評價(jià),實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，該方法可有效的控制糖痹康顆粒的質(zhì)量。

1 儀器與試藥

儀器：島津LC-15C高效液相色譜儀(四元泵，恒溫柱箱，DAD檢測器，LC solution工作站，島津公司，日本)；FY130型中藥粉碎機(jī)(天津市親斯特儀器有限公司)；Millipore-Q超純水制備儀(法國密理博公司)；KQ-250B型高功率超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；DF-101S集熱恒溫加熱磁力攪拌器(鄭州長城科工貿(mào)有限公司)；德國賽多利斯電子分析天平(R200D分析天平)。

材料與試劑：芍藥苷(LOT:B21148，購自上海源葉生物科技有限公司)、毛蕊異黃酮葡萄糖苷(LOT:PM0515SA13，購自上海源葉生物科技有限公司)、特女貞苷(LOT:Z21S3B1，購自上海源葉生物科技有限公司)、迷迭香酸(由中國藥品生物制品檢定所提供，批號為111871-201203)、黃芩苷(LOT:RM0523FA14，購自上海源葉生物科技有限公司)、小檗堿(LOT:Y11A6W1,購自上海源葉生物科技有限公司)，6種標(biāo)準(zhǔn)品含量均≥98%，符合含量測定要求；乙腈(色譜純)為美國Fisher Scientific公司產(chǎn)品；甲酸(色譜純)為美國Fisher公司產(chǎn)品；糖痹康顆粒北京中醫(yī)藥大學(xué)藥廠制備(由黃芪、女貞子、桂枝、赤芍、黃芩、黃連、水蛭等組成，每克顆粒劑相當(dāng)于3．61 g生藥)。

2 方法與結(jié)果

2．1 色譜條件 Thermo Syncronis C18色譜柱(150 mm×4．6 mm，5 μm)；流動相：0．1% 甲酸與水-0．1%甲酸與乙腈(18%～60%)30 min；柱溫38 ℃，流速1．0 mL/min，進(jìn)樣量20 μL，檢測λ為多波長檢測分別是：196、201、202、204、276、228 nm。

2．2 溶液的制備

2．2．1 對照品儲備液制備 分別精密稱取標(biāo)準(zhǔn)品芍藥苷、毛蕊異黃酮葡萄糖苷、特女貞苷、迷迭香酸、黃芩苷、小檗堿，1．023、1．521、1．302、1．125、1．146、1．002 mg，加甲醇配制成1 mg/mL標(biāo)準(zhǔn)品儲備液。冷藏，避光備用。

2．2．2 供試品溶液制備 精密稱取3．00 g糖痹康顆粒，置于具塞錐形瓶中，精密加入90%甲醇100 mL(超聲處理功率90 W，頻率59 Hz，30 min)，過濾，旋干，再加入20%甲醇100 mL(超聲處理功率90 W，頻率59 Hz，30 min)，加入至上述旋瓶中旋干，50%甲醇定容至15 mL，過濾，取續(xù)濾液。

2．3 系統(tǒng)適用性考察 分別吸取對照品溶液、供試品溶液、空白對照溶液各10 μL，注入液相色譜儀，在“2．1．1”條件下測定。芍藥苷：理論踏板數(shù)，分離度；毛蕊異黃酮葡萄糖苷理論踏板數(shù)，分離度；特女貞苷：理論踏板數(shù)，分離度；迷迭香酸：理論踏板數(shù)，分離度；黃芩苷：理論踏板數(shù)，分離度；小檗堿：理論踏板數(shù)，分離度均符合含量測定要求。

2．4 線性關(guān)系考察 將“2．1．2”項(xiàng)下對照品儲備液用20%甲醇逐級稀釋成不同濃度的對照品溶液，濃度依次為10、25、50、100、250、500 μg/mL，精密吸取對照品溶液各20 μL，在“2．1．1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測定，記錄峰面積，以對照品濃度(X)為橫坐標(biāo)，以峰面積(Y)為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到回歸方程分別為芍藥苷：Y=227 988X+182，R2=0．999 1；毛蕊異黃酮葡萄糖苷：Y= 417 929X-213，R2=0．999 7；特女貞苷：Y=199 569X-312，R2=0．998 3；迷迭香酸：Y=364 936X+152，R2=0．998 1；黃芩苷：Y=64 131X+362，R2=0．999 4；小檗堿：Y=87 882X+111，R2=0．999 5，線性范圍均為5～600 μ/mL。

2．5 精密度試驗(yàn) 精密吸取一定濃度混和對照品溶液，連續(xù)進(jìn)樣6次，RSD分別為，芍藥苷：0．91%；毛蕊異黃酮葡萄糖苷：1．86%；特女貞苷0．40%，迷迭香酸：1．53%；黃芩苷：1．24%；小檗堿：0．19%，均<2．0%，表明儀器精密度良好。

2．6 穩(wěn)定性試驗(yàn) 按“2．1．3”項(xiàng)操作制備供試品溶液，常溫放置，在“2．1．1”項(xiàng)色譜條件下測定，分別于0、2、4、12、24 h進(jìn)樣，每次20 μL，記錄峰面積，樣品中各成分不同時(shí)間測定的峰面積RSD分別為，芍藥苷：1．10%；毛蕊異黃酮葡萄糖苷：1．45%；特女貞苷：0．76%；迷迭香酸：1．83%；黃芩苷：1．44%；小檗堿：0．63%，均<2．0%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2．7 重現(xiàn)性試驗(yàn) 精密稱取糖痹康顆粒6份，分別按照“2．1．3”項(xiàng)操作制備供試品溶液，按“2．1．1”項(xiàng)色譜條件分別測定。計(jì)算樣品中待測成分的含量，結(jié)果 RSD分別為，芍藥苷：1．86 %；毛蕊異黃酮葡萄糖苷：2．08%；特女貞苷：1．94%，迷迭香酸：1．67 %；黃芩苷：1．58%；小檗堿：1．79%，證明重復(fù)性良好。

2．8 回收率試驗(yàn) 精密稱取已知含量同一批次供試品6份，每份取樣量為供試品取樣量的50%，約1．50 g。以當(dāng)前取樣含量的1∶1，分別精密加入芍藥苷、毛蕊異黃酮葡萄糖苷、特女貞苷、迷迭香酸、黃芩苷、小檗堿，按“2．1．3”項(xiàng)操作制備，按“2．1”項(xiàng)色譜條件測定。計(jì)算得平均回收率及RSD。見表1。

2．9 樣品含量測定 取樣品3批，按“2．2．2”和“2．2．3”項(xiàng)下的方法制成對照品溶液與供試品溶液，按“2．2．1”方法測定6種主要活性成分。結(jié)果表明，糖痹康顆粒中6種活性成分的平均含量：芍藥苷9 360.68 μg/g；毛蕊異黃酮葡萄糖苷3 070.71 μg/g；特女貞苷2 208.47 μg/g；迷迭香酸1 598.81 μg/g；黃芩苷27 267.82 μg/g；小檗堿量443.87 μg/g。

表1 6種活性成分加樣回收率實(shí)驗(yàn)(n=6)

續(xù)表1

成 分序號稱樣/g樣品中量/μg加入量/μg測的量/μg回收率/%平均回收率/%RSD/%黃芩苷11.502140958.984100083917.80104.78105.460.9321.521441485.254100084918.57105.9331.513641272.564100084740.74106.0241.513841278.024100085083.70106.8451.543242079.694100084774.52104.1361.565142676.864100085752.04105.06小檗堿11.5021666.746601319.0498.8399.071.5621.5214675.306601330.5099.2731.5136671.846601319.7298.1641.5138671.936601310.3596.7351.5432684.986601347.67100.4161.5651694.706601361.48101.03

3 小結(jié)

中藥復(fù)方糖痹康經(jīng)多年臨床證實(shí)對DPN具有良好療效，總有效率可達(dá)93．39%。HPLC中藥制劑分析法是質(zhì)量分析中最常用的方法[16]。中藥復(fù)方糖痹康顆粒為中醫(yī)理論指導(dǎo)下的治療胰島素抵抗的臨床經(jīng)驗(yàn)方，由黃芪、女貞子、桂枝、赤芍、黃芩、黃連、水蛭、雞血藤、延胡索(醋制)等中藥提取物組成。對于糖尿病周圍神經(jīng)病變有很好的療效,本課題組采用HPLC-DAD法對其6種主要活性成分芍藥苷、毛蕊異黃酮葡萄糖苷、特女貞苷、迷迭香酸、黃芩苷、小檗堿同時(shí)測定的含量測定方法進(jìn)行研究。該方法樣品處理簡單、可控。色譜條件簡單，在樣品得到較好分離的基礎(chǔ)上，盡量減少了分析所用的時(shí)間，有很好的實(shí)用性。該方法準(zhǔn)確可靠,可用于本品的內(nèi)在質(zhì)量控制。本實(shí)驗(yàn)建立了同時(shí)測定糖痹康顆粒中6種主要活性成分的HPLC-DAD的含量測定方法,可以快速、有效的對糖痹康顆粒進(jìn)行質(zhì)量控制。

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Simultaneous determination of 6 main active components in Tang-Bikang by HPLC-DAD

WEI Ying1,2,3,WANG Dongchao1,2,3,GAO Jiaqi1,2,3,QIN Lingling2,3,SUN Wen2,3,ZHANG Yan2,3,SHI Haoxia1,2,3,LAN Wei4,XU Tunhai1,2,3*,LIU Tonghua2,3

(1.College of Pharmacy Beijing University of Chinese Medicine,Beijing 100029,China;2.Health Cultivation Laboratory of the Ministry of Education,Beijing 100029,China;3.Health Cultivation Laboratory of Beijing,Beijing 100029,China;4.Traditional Chinese Medicine College of Xinjiang Medical University,Urumqi 830011,China)

Objective To study a method for simultaneous determination of 6 active components in Tang-Bikang granules.Methods Determination of 6 active ingredients of Tang-Bikang granules by HPLC-DAD method,C18column (150 mm,4.6 mm,5 m),0.1% formic acid and water-0.1% formic acid and acetonitrile (18%-60%) gradient elution;The detection wavelength is multi wavelength detection,they are:196,201,202,204,276,228 nm;Standard curve method was used.Results The 6 active ingredients in 5 μg·mL-600μg·mL shows a good linearity,and the regression equations respectively are:Peoniflorin:Y=227 988X+182,R2=0.999 1；Campanulin:Y=417 929X-213,R2=0.999 7;Specnuezhenide:Y=199 569X-312,R2=0.998 3;Rosmarinci acid:Y=364 936X+152,R2=0.998 1;Baicalin:Y=64 131X+362,R2=0.999 4;Berberine:Y=87 882X+111,R2=0.999 5.The recoveries of the 6 active components are:Peoniflorin:101.44%(RSD 0.48%);Campanulin:99.99%(RSD 0.43%);Specnuezhenide:102.07%(RSD 0.57%);Rosmarinci acid:98.38% (RSD 0.46%);Baicalin:102.71% (RSD 0.485);Berberine:99.54% (RSD 0.77%).Conclusion The establishment of the content determination method is simple,fast and reliable,and it can be used to control the quality of Tang-Bikang particles.

Tang-Bikang;ingredients;HPLC-DAD;content determination

10.13463/j.cnki.cczyy.2016.06.012

國家重大新藥創(chuàng)制 “治療糖尿病周圍神經(jīng)病變候選藥物糖痹康臨床前研究”(1000071320025)；2014年北京市教委共建成果轉(zhuǎn)化與產(chǎn)業(yè)項(xiàng)目“糖調(diào)節(jié)受損中藥保健食品產(chǎn)業(yè)化與社區(qū)干預(yù)療效安全性評價(jià)研究”。

魏 穎(1991-)，女，博士研究生，主要從事中藥降糖活性物質(zhì)基礎(chǔ)研究。

R284.2

A

2095-6258(2016)06-1135-04

2016-04-12)

*通信作者：徐暾海，男，博士，教授，博士研究生導(dǎo)師,電話-15300175337,電子信箱-Thxu@163.com