自發(fā)性糖尿病模型KKAy小鼠海馬的形態(tài)學(xué)改變及中藥益氣養(yǎng)陰散結(jié)復(fù)方對其影響

田文楊，龍泓竹，吳淑馨，孫宏峰，白 穎，楊曉暉

(北京中醫(yī)藥大學(xué)東方醫(yī)院，北京 100078)

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自發(fā)性糖尿病模型KKAy小鼠海馬的形態(tài)學(xué)改變及中藥益氣養(yǎng)陰散結(jié)復(fù)方對其影響

田文楊，龍泓竹，吳淑馨，孫宏峰，白 穎，楊曉暉*

(北京中醫(yī)藥大學(xué)東方醫(yī)院，北京 100078)

目的 觀察自發(fā)性糖尿病模型KKAy小鼠海馬的形態(tài)學(xué)改變及中藥復(fù)方對其的影響。方法 選取雄性11～12周齡KKAy小鼠，將其隨機(jī)分為模型組及中藥組，同周齡雄性C57BL/6J小鼠為正常組。中藥組灌服中藥復(fù)方，模型組及正常組灌服等量蒸餾水，分別于實(shí)驗(yàn)的第4、8、12周末處死各組小鼠，通過光鏡觀察海馬組織HE染色、計(jì)數(shù)海馬CA1區(qū)神經(jīng)元細(xì)胞數(shù)量。結(jié)果 第4、8、12周模型組與中藥組海馬CA1區(qū)海馬神經(jīng)元細(xì)胞數(shù)量與正常組相比，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。第8周末，海馬CA1區(qū)神經(jīng)元形態(tài)學(xué)發(fā)生變化，海馬神經(jīng)元數(shù)量減少。第12周末，模型組小鼠神經(jīng)元細(xì)胞出現(xiàn)明顯的形態(tài)異常，海馬細(xì)胞排列紊亂，CA1區(qū)、齒狀回部的多數(shù)神經(jīng)元胞體、胞核出現(xiàn)顯著病理性改變，海馬神經(jīng)元數(shù)量明顯減少。中藥治療組海馬組織的神經(jīng)元細(xì)胞排列較整齊，第4、8周末僅見少量神經(jīng)元細(xì)胞深染，第12周末部分神經(jīng)元細(xì)胞發(fā)生形態(tài)學(xué)改變，明顯輕于模型組，海馬神經(jīng)元細(xì)胞數(shù)量與模型組相比有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)論 18～20周齡的KKAy小鼠的海馬組織開始出現(xiàn)較明顯的神經(jīng)元細(xì)胞損傷及減少的形態(tài)學(xué)改變，22～24周齡時(shí)，這種改變更為顯著。該中藥復(fù)方可有效的調(diào)節(jié)KKAy的糖脂代謝紊亂，干預(yù)和延緩KKAy小鼠海馬組織的病理學(xué)改變。

糖尿病腦??；海馬組織；中藥復(fù)方；KKAy小鼠

目前，糖尿病發(fā)病率逐年升高[1]，其慢性并發(fā)癥給患者帶來的影響逐漸顯現(xiàn)[2-3]。糖尿病腦病作為糖尿病主要的并發(fā)癥之一，受到了越來越廣泛的關(guān)注。糖尿病腦病主以認(rèn)知功能下降為主要臨床特點(diǎn)，研究發(fā)現(xiàn)，隨著病程的延長，與認(rèn)知功能相關(guān)的海馬區(qū)神經(jīng)元細(xì)胞凋亡，繼而出現(xiàn)認(rèn)知下降[4-6]。本研究采用自發(fā)性2型糖尿病KKAy小鼠為模型，觀察不同時(shí)期KKAy小鼠海馬組織神經(jīng)元細(xì)胞的改變，探討KKAy小鼠出現(xiàn)糖尿病腦病的進(jìn)程，并觀察中藥復(fù)方對KKAy小鼠血糖、血脂的影響,以及對KKAy小鼠海馬組織病理學(xué)改變的作用，探討對糖尿病腦病的干預(yù)作用。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 均購自于中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所：雄性SPF級(jí)C57BL/6J小鼠(許可證號(hào)：SCXK京2009-0007),10～12 周齡，18只；雄性SPF級(jí)KKAy小鼠(許可證號(hào)：SCXK京2009-0004),11～12周齡，36只。實(shí)驗(yàn)期間，KKAy小鼠喂養(yǎng)高脂飼料(含量配比為10%豬油、10%蛋黃粉和10%葡萄糖)；C57BL/6J小鼠喂養(yǎng)普通小鼠生長維持顆粒飼料，均自由飲水。將小鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，斷尾取血測定空腹血糖，2次空腹血糖均在13.9 mmol/L以上則確定為糖尿病小鼠，納入實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的飼養(yǎng)過程均在東直門醫(yī)院動(dòng)物中心完成。

1.2 分組及給藥 小鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，隨機(jī)分組，C57BL/6J小鼠作為正常組，將18只C57BL/6J小鼠隨機(jī)分為4、8、12周組，各6只。KKAy小鼠隨機(jī)分為模型組和中藥組，各18只。模型組和中藥組再分別隨機(jī)分為3個(gè)小組，即4、8、12周組，各6只。實(shí)驗(yàn)所用中藥復(fù)方由北京中醫(yī)藥大學(xué)東方醫(yī)院中藥房提供。小鼠等效劑量的給藥量為臨床成人每公斤體質(zhì)量用藥量的10倍。中藥組予7.7g/(kg·d)灌服中藥益氣養(yǎng)陰散結(jié)復(fù)方，模型組及正常組予灌胃同體積的蒸餾水，分別灌胃4、8、12 周。

1.3 試劑與儀器 10%水合氯醛10 g，用雙蒸水稀釋至100 mL。穩(wěn)豪型血糖儀及原廠試紙：美國強(qiáng)生公司。低溫高速離心機(jī)：Heraeus sepatech biofuge 28RS。隔水式恒溫培養(yǎng)箱(國產(chǎn))：GNP-9080型。

1.4 標(biāo)本采集及處理 在給藥后第 4、8、12周末處死動(dòng)物稱取小鼠體質(zhì)量后，用10%水合氯醛按0.4 mg/100 g的劑量進(jìn)行腹腔注射，小鼠成功麻醉，腹主動(dòng)脈采血，12 000 r/min，離心15 min，靜置備用待測血糖、血脂，剪開顱骨，將整個(gè)大腦完整移至4%多聚甲醛中浸泡等待包埋,待做HE染色。

1.5 檢測指標(biāo)及方法 1)記錄小鼠一般情況、小鼠活動(dòng)狀態(tài)、毛色、精神狀態(tài)、飲食、二便等，每周測體質(zhì)量1次。2)血糖、血脂：處死前取血檢測血糖、血脂。3)大腦組織HE染色觀察海馬組織形態(tài)學(xué)改變。4)海馬CA1區(qū)神經(jīng)元細(xì)胞計(jì)數(shù)：400倍顯微鏡下，隨機(jī)選取海馬CA1區(qū)不重疊的3個(gè)視野，計(jì)數(shù)正常的細(xì)胞數(shù)量，取其平均值，每個(gè)標(biāo)本取3張連續(xù)切片，取其平均值。對結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析處理。

2 結(jié)果

2.1 各組小鼠的一般情況 正常組C57BL /6J進(jìn)食飲水正常，毛色亮澤，精神狀態(tài)良好，反應(yīng)靈敏，對抓取抵抗明顯；模型組KKAy小鼠形體肥胖，體質(zhì)量增長迅速，逐漸出現(xiàn)毛色干枯無光澤，活動(dòng)遲緩，反應(yīng)遲鈍。中藥組干預(yù)治療8周后小鼠一般狀況較模型組具有不同程度改善。

2.2 各組小鼠血糖測定情況 見表1。

mmol/L

注:與正常組比較，#P<0.05，##P<0.01;與模型組比較，△P<0.05

2.3 各組小鼠TG、TC測定情況 見表2,表3。

mmol/L

注:與正常組比較，##P<0.01;與模型組比較，△P<0.05

mmol/L

注:與正常組比較，##P<0.01；與模型組比較，△P<0.05

2.4 各組小鼠腦組織HE染色情況 光鏡下觀察各組小鼠海馬組織HE染色，正常組小鼠在第4、8、12周末均可見海馬CA1區(qū)、齒狀回部(DE區(qū))神經(jīng)元細(xì)胞排列整齊，結(jié)構(gòu)清晰，細(xì)胞圓，胞漿淡染，胞質(zhì)清晰可見，核仁清楚。模型組小鼠在第4周末時(shí)，海馬CA1區(qū)神經(jīng)元細(xì)胞排列較整齊，與第4周末的正常組小鼠相比，可見少許散在的神經(jīng)元細(xì)胞深染。模型組小鼠在第8周末時(shí)，海馬CA1區(qū)神經(jīng)元細(xì)胞排列松散，形態(tài)發(fā)生變化，部分神經(jīng)元細(xì)胞出現(xiàn)較明顯的細(xì)胞核固縮、細(xì)胞質(zhì)減少。在12周末，模型組小鼠神經(jīng)元細(xì)胞出現(xiàn)了非常明顯的形態(tài)異常，海馬細(xì)胞層次差，排列紊亂，數(shù)目減少，CA1區(qū)、齒狀回部的多數(shù)神經(jīng)元胞體深染、皺縮，胞核變小、固縮濃染或胞核消失，細(xì)胞變細(xì)、變長。中藥治療組海馬神經(jīng)元細(xì)胞排列較整齊，在第4、8周末僅可見少量神經(jīng)元細(xì)胞深染，未見明顯形態(tài)學(xué)改變，雖然在第12周末部分神經(jīng)元細(xì)胞發(fā)生了形態(tài)學(xué)改變，但與模型組相比，程度明顯輕于模型組。

2.5 各組小鼠腦組織海馬區(qū)計(jì)數(shù) 見表4。

個(gè)

注:與正常組比較，#P<0.05，##P<0.01；與模型組比較，△P<0.05

3 小結(jié)

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與正常小鼠相比，在第4、8、12周末，模型組小鼠的血糖和血脂水平均明顯高于正常組,但在第4周末，即14～16周齡的模型組KKAy小鼠海馬組織的形態(tài)學(xué)并沒有發(fā)生明顯變化,提示此時(shí)KKAy小鼠尚未出現(xiàn)明顯的神經(jīng)元細(xì)胞損傷。從第8周末后，模型組小鼠海馬組織存在了較明顯的改變，神經(jīng)元數(shù)目減少明顯，說明18～20周齡的KKAy小鼠已經(jīng)開始出現(xiàn)了神經(jīng)元損傷，但其臨床表現(xiàn)并不明顯。到了第12周末，長期處于高血糖、高血脂的狀態(tài)使模型組KKAy小鼠海馬組織CA1區(qū)、DE區(qū)神經(jīng)元細(xì)胞的胞體、胞核等出現(xiàn)顯著的病理學(xué)改變，神經(jīng)元數(shù)目減少較多，與此同時(shí)模型組小鼠反應(yīng)遲鈍，活動(dòng)遲緩，對抓取抵抗不明顯，提示22～24周齡KKAy小鼠存在明顯神經(jīng)元損傷，出現(xiàn)了糖尿病腦病的改變[7-11]。

本實(shí)驗(yàn)所用中藥復(fù)方具有益氣養(yǎng)陰，通絡(luò)散結(jié)的功效，以往研究[12]發(fā)現(xiàn)該復(fù)方可通過干擾腎素血管緊張素系統(tǒng)(RAS)激活，減少AngII蛋白過度表達(dá)，抑制心肌重構(gòu)從而保護(hù)心肌功能，延緩糖尿病心肌病的進(jìn)程；本中藥復(fù)方補(bǔ)氣陰以充髓海的同時(shí)，化痰活血通絡(luò)以除腦竅之結(jié)，早期干預(yù)以延緩糖尿病腦病發(fā)展。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)通過中藥復(fù)方干預(yù)，中藥組KKAy小鼠海馬形態(tài)學(xué)較模型組有較明顯的改善，中藥組小鼠在第4、8周末僅可見少量神經(jīng)元細(xì)胞深染,未見明顯的神經(jīng)元細(xì)胞形態(tài)學(xué)改變，直至第12周末才出現(xiàn)部分神經(jīng)元細(xì)胞發(fā)生了形態(tài)學(xué)改變，提示通過該中藥復(fù)方的干預(yù)，有效的延緩和阻止了糖尿病腦病的發(fā)生進(jìn)程。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，中藥復(fù)方可有效改善自發(fā)性KKAy糖尿病小鼠的糖脂代謝紊亂,這可能對預(yù)防和干預(yù)糖尿病小鼠海馬組織形態(tài)學(xué)改變有著重要意義。

綜上所述，KKAy小鼠作為自發(fā)性糖尿病動(dòng)物模型，在18～20周齡時(shí)，其海馬組織開始出現(xiàn)較明顯的神經(jīng)元細(xì)胞損傷及減少的形態(tài)學(xué)改變，22～24周齡時(shí)，這種改變更為顯著。益氣養(yǎng)陰散結(jié)復(fù)方可有效的干預(yù)和延緩KKAy小鼠海馬組織神經(jīng)元的損傷和減少，這種對神經(jīng)元的保護(hù)作用部分可能通過降低血糖、血脂而實(shí)現(xiàn)的，但其具體作用的環(huán)節(jié)和靶點(diǎn)，有待于進(jìn)一步研究。

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Morphological changes in hippocampus and effect of Yiqi Yangyin Sanjie prescription on KKAy mice with spontaneous type 2 diabetes

TIAN Wenyang,LONG Hongzhu,WU Shuxin,SUN Hongfeng,BAI Ying,YANG Xiaohui*

(Dongfang Hospital Affiliated to Beijing University of Chinese Medicine,Beijing 100078,China)

Objective To observe the morphological changes of the hippocampus of the KKAy mice and the effect of traditional Chinese medicine compound on the morphology of hippocampus.Methods The 12-week-old male KKAy mice were randomly divided into model group and TCM group,same age of male C57BL/6J mice were chose as the normal group.The mice of different groups were treated with relevant medicinal respectively by intragastrical method,as the TCM group were fed with Traditional Chinese medicine compound,the model group and normal group were fed with distilled water.The hippocampal pathological changes were observed under light microscope and counted the number of hippocampal neurons after mice were sacrificed respectively when the end of 4th,8th and 12th weeks.Results At the end of 4th,8th and 12th weeks,in the model group and TCM group,the number of hippocampal neurons have significantly statistical differences compared with the normal group (P<0.05).At 8 weeks,the morphology of neurons in CA1 area of hippocampus were changed.The cell nuclei of some neurons appear to shrink and cytoplasm increased,the neuronal loss decrease.At 12 week,in the model group,the morphology of the hippocampus of the KKAy were significant abnormality.In TCM group,the pathological changes of the hippocampus of KKAy mice were significantly less than that of the mod-el group,the number of hippocampal neurons have significantly statistical differences compared with the model group (P<0.05).Conclusion At 18-20 week of age,the morphology of hippocampus of KKAy mice began to appear obvious changes.At 22-24 week of age,the pathological changes were more significant.The Chinese medicine compound can effectively prevent and reduce the damage of neurons of the hippocampus of KKAy mice.

diabetic encephalopathy;hippocampus tissue;traditional Chinese medicine compound;KKAy mice

10.13463/j.cnki.cczyy.2016.06.010

教育部高等學(xué)校博士學(xué)科點(diǎn)專項(xiàng)科研基金(博導(dǎo)類)(20110013110004)。

田文楊(1990-)，女，碩士研究生，主要從事中醫(yī)藥防治糖尿病及并發(fā)癥研究。

R285.5

A

2095-6258(2016)06-1129-04

輯：張海洋

2016-04-06)

*通信作者：楊曉暉，男，教授，主任醫(yī)師，博士研究生導(dǎo)師，電子信箱-yxh0616@126.com