復(fù)方蜥蜴散不同微粒組合劑對潰瘍性結(jié)腸炎大鼠血清IL-4和結(jié)腸組織COX-2的研究

張 薔，朱西杰,2*，孔 娟，葉景陽，安婷婷

(1.寧夏醫(yī)科大學(xué)，銀川 750004；2.寧夏醫(yī)科大學(xué)附屬回醫(yī)中醫(yī)院，銀川 750004)

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復(fù)方蜥蜴散不同微粒組合劑對潰瘍性結(jié)腸炎大鼠血清IL-4和結(jié)腸組織COX-2的研究

張 薔1，朱西杰1,2*，孔 娟1，葉景陽1，安婷婷1

(1.寧夏醫(yī)科大學(xué)，銀川 750004；2.寧夏醫(yī)科大學(xué)附屬回醫(yī)中醫(yī)院，銀川 750004)

目的 探討復(fù)方蜥蜴散不同微粒組合劑(XY)抑炎、修復(fù)、調(diào)節(jié)免疫的作用機(jī)理。方法 將84只SPF級雄性大鼠隨機(jī)分為空白組、模型組、復(fù)方蜥蜴散80目組、100目組、80目+100目混合組、柳氮磺胺吡啶組，除空白組外，其他組均采用2，4，6-三硝基苯磺酸(TNBS)-乙醇復(fù)合法誘導(dǎo)UC模型。造模成功后做相應(yīng)治療，光鏡觀察腸黏膜病理組織學(xué)變化,檢測血清IL-4的含量和結(jié)腸組織COX-2的表達(dá)水平。結(jié)果 各治療組與模型組比較，IL-4含量明顯升高，COX-2表達(dá)明顯降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。復(fù)方蜥蜴散80目+100目組與其他治療組比較，IL-4含量明顯升高，COX-2表達(dá)明顯降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)論 復(fù)方蜥蜴散不同微粒組合劑可能通過升高IL-4的含量，減少COX-2的合成而抑制炎性細(xì)胞，調(diào)節(jié)免疫，改善血液流變性和微循環(huán)，促進(jìn)結(jié)腸潰瘍的修復(fù)。

復(fù)方蜥蜴散；潰瘍性結(jié)腸炎；COX-2；IL-4

潰瘍性結(jié)腸炎(UC)是一種慢性非特異性結(jié)腸炎癥，是公認(rèn)的引起結(jié)腸癌的高危因素，可通過慢性炎癥-不典型增生-癌變模式最終發(fā)展為結(jié)腸癌[1]。研究[2]表明，UC患者最終發(fā)展為結(jié)腸癌的發(fā)病率約為3.7%,因此阻斷UC作為結(jié)腸癌的一個預(yù)防措施，受到了國內(nèi)外醫(yī)學(xué)界的關(guān)注。UC發(fā)病機(jī)制復(fù)雜,細(xì)胞因子和炎癥介質(zhì)以及二者相互影響形成的復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)占有核心地位,尤以細(xì)胞因子失衡和花生四烯酸代謝紊亂為主[3]。環(huán)氧合酶(COX)是體內(nèi)催化花生四烯酸轉(zhuǎn)化為前列腺素的關(guān)鍵酶，參與機(jī)體炎癥反應(yīng)，當(dāng)其被多種細(xì)胞因子和炎癥遞質(zhì)誘導(dǎo)時則明顯表達(dá)[4]，白細(xì)胞介素-4(IL-4)是來源于T細(xì)胞的細(xì)胞因子，具有抑制炎癥，維持腸道免疫的作用。筆者通過采用TNBS和乙醇混合液建立UC大鼠模型，探究復(fù)方蜥蜴散不同微粒組合劑治療后對IL-4和COX-2水平的影響，以期深入了解該方作用機(jī)制。

1 材料

1.1 動物 SPF級SD大鼠84只，4～6周齡，雄性，體質(zhì)量(200±20)g，批號：SCXK(寧)2011-0001，由寧夏醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心提供。1.2 藥品、試劑和儀器 復(fù)方蜥蜴散：寧夏密點麻蜥、半枝蓮、黃芪、黃芩、葛根、地榆、白及等組成，由寧夏醫(yī)科大學(xué)附屬回醫(yī)中醫(yī)院提供；柳氮磺胺吡啶腸溶片0.25 g×60片/盒，批號:H31020557，上海信誼天平藥業(yè)有限公司；TNBS，批號：X4947，成都格雷西亞化學(xué)有限公司；75%乙醇：500 mL/瓶，德州樂康消毒制品有限公司；0.9%氯化鈉溶液：250 mL/瓶，四川科倫藥業(yè)股份有限公司；IL-4ELISA試劑盒，北京普爾偉業(yè)生物科技有限公司；兔抗大鼠多克隆COX-2抗體，批號：BA0738，武漢博士德生物工程有限公司；PBS磷酸鹽緩沖液、SABC試劑盒和DAB顯色試劑盒均購于北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。YD5A-WS臺式離心機(jī):長沙湘儀離心儀器有限公司出品；550酶標(biāo)儀:美國Bio-Rad公司;TEC2800病理組織包埋機(jī)：常州郝思琳醫(yī)用儀器有限公司；漂烘片機(jī)YABO200，常州雅博電子設(shè)備有限公司；電熱恒溫培養(yǎng)箱DNP-9162:上海躍進(jìn)醫(yī)用光學(xué)儀器廠；VITLAB微量移液槍：德國生產(chǎn)；孵育盒：福州邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司；圖像采集系統(tǒng)顯微鏡BH2-RFCA：日本OLYMPUS公司，均由寧夏醫(yī)科大學(xué)總院腫瘤醫(yī)院病理科提供。

2 方法

2.1 動物分組 84只SPF級SD雄性大鼠，隨機(jī)分為空白組、模型組、復(fù)方蜥蜴散80目(XY80)組、100目(XY100)組、80目+100目等量混合(XY80+100)組、柳氮磺胺吡啶(SASP)組，共6組，編為A～F組，每組14只，相同條件下分籠飼養(yǎng)。

2.2 藥物配制 復(fù)方蜥蜴散混懸液：XY80、XY100、XY80+100等量混合物經(jīng)過粉碎、高溫滅菌、蒸2.5 h，晾干后，用雙蒸水分別配成0.14 g/mL混懸液。SASP混懸液：SASP研磨，用蒸餾水配成0.03 g/mL的混懸液保存?zhèn)溆谩?/p>

2.3 造模及給藥方法 大鼠購進(jìn)后適應(yīng)性喂養(yǎng)1周，除A組外，其余大鼠禁食24 h后，用10%水合氯醛(3 mL/kg)麻醉，根據(jù)文獻(xiàn)[5-6]造模，用石蠟油潤滑的橡膠軟管(外徑2 mm)，插入大鼠肛門上段8 cm結(jié)腸內(nèi)，用注射器將混合液(100 mg/kg TNBS+50%乙醇0.25 mL)緩慢注入橡膠軟管，再注入長約0.3 mL的空氣，提起大鼠尾部，持續(xù)倒置1 min，使造模劑充分進(jìn)入大鼠腸腔，待自然蘇醒后正常飼養(yǎng)。A組注入相應(yīng)體積的生理鹽水灌腸，造模第3天，從各組隨機(jī)抽取1只，取腸黏膜做HE染色檢測造模符合UC的病理診斷。A組和B組大鼠開始給予0.9%氯化鈉溶液，C、D、E組大鼠分別給予XY80、XY100、XY80+100等量混合混懸液，F(xiàn)組大鼠給予0.3 g/kg SASP每只均按10 mL/(kg ·d)灌胃，連續(xù)用藥14 d。

2.4 標(biāo)本采集及處理 治療第14天末,將各組大鼠禁食水24 h，麻醉腹主動脈取血后注入離心管，經(jīng)3 000 r/min，低溫離心10 min，取上清液于EP管放到-80 ℃冰箱保存，ELISA試劑盒檢測IL-4含量。分離出結(jié)腸，截取距肛門8 cm處的部分結(jié)腸沿腸系膜剪開后沖洗，用10%福爾馬林溶液固定24 h后，梯度脫水，石蠟包埋備用，常規(guī)HE染色做病檢，鄰近切片做免疫組化染色。免疫組化步驟按照試劑盒說明書進(jìn)行，COX-2抗體使用濃度為1∶500。采用Image-ProPlus 6.0圖像分析系統(tǒng)，每張切片選擇5個有代表性的陽性細(xì)胞表達(dá)最強(qiáng)染色部位，測定陽性區(qū)域平均光密度AOD。

2.5 觀察指標(biāo) 觀察各組大鼠的精神狀態(tài)、進(jìn)食量、體質(zhì)量、大便性狀、存活情況;疾病活動指數(shù)(DAI)評分:根據(jù)DAI評分標(biāo)準(zhǔn)[7]，將體質(zhì)量下降的百分比、大便性狀和便血情況進(jìn)行評分，取其平均數(shù)作為最后得分。

3 結(jié)果

3.1 造模后大鼠一般情況 造模成功率94%，A組大鼠飲食飲水及大便正常，精神狀態(tài)好，毛色光亮，反應(yīng)靈敏；其余各組大鼠造模后第1天開始精神萎靡，懶動，被毛干枯，食水量減少，體質(zhì)量減輕，大便稀溏甚則伴有膿血，尿黃，尿少；B組造模后癥狀無明顯自愈現(xiàn)象，在第3天DAI達(dá)到高峰；各治療組上述表現(xiàn)均不同程度好轉(zhuǎn)，平均8d后血便消失，腹瀉減輕，大便逐漸成形，以E組為最佳，進(jìn)食進(jìn)水量增加，毛色光亮，主動覓食，體質(zhì)量逐漸增加，大便呈顆粒狀，見表1。

表1 各組大鼠DAI評分

注:與A組比較，#P<0.05;與B組比較，△P<0.05;與E組比較，▲P<0.05

3.2 光鏡下結(jié)腸病理組織學(xué)觀察 A組:鏡下結(jié)腸結(jié)構(gòu)完整，腺體排列整齊，未見充血、水腫以及潰瘍的發(fā)生。B組：各層組織結(jié)構(gòu)消失，細(xì)胞間隙增寬，腺體破壞，杯狀細(xì)胞減少，黏膜層及黏膜下層有大量中性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞及漿細(xì)胞浸潤。各治療組與B組相比，病理結(jié)果均有不同程度的改善，而E組為最佳，各層結(jié)構(gòu)基本清晰，腺體排列整齊，可見散在炎性細(xì)胞。

3.3 免疫組織化學(xué)結(jié)果 COX-2主要在細(xì)胞漿內(nèi)表達(dá)，在A組表達(dá)較弱，在B組腸上皮細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞及其間質(zhì)細(xì)胞呈明顯棕色強(qiáng)表達(dá)，而在其他組中表達(dá)明顯減弱，呈散在分布染色結(jié)果，尤以E組表達(dá)最少，其他各組表達(dá)介于A組與B組之間。

3.4 統(tǒng)計結(jié)果 各組與A組比較，IL-4含量降低，AOD值升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，說明其他各組大鼠均有不同程度的炎癥性損傷；各治療組與B組比較，IL-4含量均升高，AOD值均降低(P<0.05)；E組與C、D、F組比較，IL-4含量明顯升高，AOD值明顯降低(P<0.05)；C組、D組和F組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。說明XY80+100等量混合組療效最佳，優(yōu)于單用XY80、XY100以及SASP，而XY80、XY100及SASP療效相差不明顯。見表2。

組 別劑量/(g/kg)nIL-4含量/(pg/mL)COX-2的AOD值空白組(A)—13154.79±5.27 0.2485±0.0226 模型組(B)—1155.11±4.97## 0.4608±0.0159## XY80組(C)1.411100.75±3.30##△ 0.3154±0.0140##△ XY100組(D)1.41198.56±2.88##△□0.3207±0.0137##△□XY80+100組(E)1.412126.36±4.92##△▲0.2735±0.0117##△▲SASP組(F)0.311101.96±2.30##△ 0.2982±0.0157##△

注:與A組比較,## P<0.01；與B組比較，△ P<0.05；與F組比較，▲ P<0.05;與E組比較，□ P<0.05

4 討論

IL-4[8]由T淋巴細(xì)胞產(chǎn)生，是B細(xì)胞生長因子，通過刺激B細(xì)胞和T細(xì)胞，在結(jié)腸中發(fā)揮免疫抑制效應(yīng)，對維持腸道免疫起重要作用，并且能抑制前列腺素和IL-8的產(chǎn)生，具有抗炎作用。COX-2[9]是體內(nèi)催化花生四烯酸轉(zhuǎn)化為前列腺素的酶，正常腸黏膜表達(dá)較少,當(dāng)受到炎性介質(zhì)、細(xì)胞因子、內(nèi)毒素等刺激時表達(dá)量迅速上調(diào),從而催化花生四烯酸合成多種過量的前列腺素類物質(zhì)，導(dǎo)致炎細(xì)胞浸潤、充血、水腫等，并可影響腸管運動和腸血流量，使炎癥反應(yīng)持久化。殷剛峰等[10]研究證明：當(dāng)IL-4升高時,COX-2下調(diào)；當(dāng)IL-4下調(diào)時，COX-2上升，據(jù)此推斷：IL-4可能通過抑制前列腺素合成關(guān)鍵酶COX-2的表達(dá)，導(dǎo)致前列腺素合成減少，從而使腸黏膜炎癥減輕，病情好轉(zhuǎn)。

本實驗表明，UC大鼠模型組IL-4含量明顯低于空白組，COX-2表達(dá)明顯高于空白組，提示，UC大鼠發(fā)病與IL-4低含量，COX-2高表達(dá)有關(guān)。經(jīng)復(fù)方蜥蜴散不同微粒組合劑治療后，IL-4含量上升，COX-2表達(dá)下調(diào)，并優(yōu)于其他組，推斷因機(jī)體對顆粒大小不同的藥物分解吸收時間不同而延長藥效，有效的干預(yù)UC進(jìn)一步發(fā)展。

導(dǎo)師認(rèn)為UC發(fā)病因濁毒內(nèi)蘊，阻滯脈絡(luò)，傷及腸道脂膜氣血，腐敗成膿，腸道傳導(dǎo)失司而形成，治以解毒排毒、祛瘀化濕、斂瘡生肌。方中以寧夏密點麻蜥為君藥，具有解毒、活血化瘀、修復(fù)、免疫抑制[11]；臣以半枝蓮和黃芩清熱燥濕、瀉火解毒，其提取物黃芩苷元可抑制COX-2的活性和蛋白表達(dá)[12]，配以焦山楂、焦烏梅消食化瘀，促進(jìn)腸蠕動，防止毒邪羈留損傷腸膜，黃芪、金銀花托毒生肌，促進(jìn)潰瘍愈合，葛根活血化瘀、收斂澀腸，地榆炭涼血止血、解毒斂瘡；佐以海螵蛸收斂止血、制酸斂瘡，能保護(hù)胃腸黏膜細(xì)胞的完整性和減少炎癥細(xì)胞的浸潤[13]，白及粉可消除局部炎癥水腫保護(hù)黏膜潰瘍面；使藥甘草在調(diào)和諸藥的同時，可增強(qiáng)半枝蓮清熱解毒之效。諸藥合用，臨床療效明顯、安全性好、毒副作用小，充分發(fā)揮中醫(yī)多靶點的優(yōu)勢。

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Different combinations of compound lizards powder on serum IL-4 and colonic COX-2 in rats with ulcerative colitis

ZHANG Qiang1,ZHU Xijie1,2*,KONG Juan1,YE Jingyang1,AN Tingting1

(1.Ningxia Medical University,Yinchuan 750004,China;2.Affiliated Hui Medicine Hospital of Ningxia Medical University,Yinchuan 750004,China)

Objective To explore the mechanism of different combinations of compound lizards powder (XY) anti inflammation,repair,regulation of immunity.Methods The 84 SPF male SD rats were randomly divided into blank group,model group,compound lizards powder 80 mesh group,100 mesh group,80 mesh + 100 mesh group,sulfasalazine group,except blank group,other groups were collected 2,4,6 trinitrobenzene sulfonic acid (TNBS)-ethanol compound method induced rat UC model.After success of model,rats were treated accordingly,light microscope was used to observe pathological,to detect content of serum IL-4 and expression level of COX-2 in colonic tissues of rats in each group.Results Compared with model group,IL-4 content was significantly increased,COX-2 expression was significantly lower,significant difference(P<0.05).Comparison of compound lizards powder 80 mesh+100 mesh group with other treatment groups,IL-4 content was significantly increased,COX-2 expression was significantly reduced,significant difference (P<0.05).Conclusion Different combinations of compound lizards powder may be by elevated IL-4 content,reduce synthesis of COX-2 and inhibition of inflammatory cells,immune regulation,improve blood rheology and microcirculation,promote repair of colonic ulcers.

compound lizards powder;ulcerative colitis;COX-2;IL-4

10.13463/j.cnki.cczyy.2016.06.008

國家自然科學(xué)基金“復(fù)方蜥蜴散不同微粒組合劑對胃癌前病變大鼠Stat3、Wnt、核因子κB通路的影響及療效評價研究”(81160482)。

張 薔(1991-)，女，碩士研究生，主要從事中醫(yī)藥治療消化系統(tǒng)疾病的研究。

R285.5

A

2095-6258(2016)06-1122-04

2016-16-02)

*通信作者：朱西杰，男，碩士研究生導(dǎo)師，電話-13007992491，電子信箱-zhuxijie2010@163.com