針刺對應(yīng)激性高血壓前期大鼠腎臟基因表達(dá)的影響

郭騏影，孫啟勝，賈文睿，郭秋蕾，楊芳媛，戰(zhàn) 和，王 赫，劉清國

(北京中醫(yī)藥大學(xué)針灸推拿學(xué)院，北京 100029)

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·實驗研究·

針刺對應(yīng)激性高血壓前期大鼠腎臟基因表達(dá)的影響

郭騏影，孫啟勝，賈文睿，郭秋蕾，楊芳媛，戰(zhàn) 和，王 赫，劉清國*

(北京中醫(yī)藥大學(xué)針灸推拿學(xué)院，北京 100029)

目的 以應(yīng)激性高血壓前期大鼠為模型，運(yùn)用基因芯片技術(shù)和生物信息學(xué)分析技術(shù)，研究針刺對其腎臟基因表達(dá)的影響。方法 將9 周齡雄性 Wistar 大鼠，隨機(jī)分為空白組、模型組、針刺組。模型組和針刺組運(yùn)用噪聲結(jié)合足底電擊刺激的造摸方式，造模同時，針刺組針刺曲池穴、太沖穴進(jìn)行干預(yù)，模型組和空白組每天只做與針刺組相同的抓取刺激。記錄在造模前1天、第 3、5、7、9、11天大鼠的血壓變化，11 d后取大鼠左腎。運(yùn)用Gene Chip Rat Gene 2.0 ST芯片對應(yīng)激性高血壓前期模型大鼠腎組織進(jìn)行基因表達(dá)譜的檢測，分別找出空白組與模型組之間及模型組與針刺組之間的差異表達(dá)基因。運(yùn)用GO數(shù)據(jù)庫對各組間差異表達(dá)基因進(jìn)行基因功能富集分析。結(jié)果 造模開始后，空白組血壓基本穩(wěn)定;第 3 天開始模型組血壓開始上升，與正常組比較有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)，并出現(xiàn)行為改變。針刺干預(yù)第 5 天開始，針刺組血壓低于模型組(P<0.05)。芯片分析顯示:與空白組相比，模型組共篩選出的差異表達(dá)基因有46個上調(diào)，有48個下調(diào)；與模型組相比，針刺治療后差異表達(dá)基因有11個上調(diào)，有45個下調(diào);基因功能富集分析顯示差異基因與生物調(diào)節(jié),刺激反應(yīng),多細(xì)胞生物體過程,代謝過程,免疫系統(tǒng)進(jìn)程,受體活性,調(diào)節(jié)酶,轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白活性等功能有關(guān)。結(jié)論 針刺太沖、曲池穴對于應(yīng)激性高血壓前期大鼠具有一定的降壓效應(yīng)，并可能通過下調(diào)Cntn4,Spta1,Mir10,Fbxo15基因來調(diào)節(jié)血壓并對其早期腎臟損害有一定的保護(hù)作用。

應(yīng)激性高血壓;高血壓前期；針灸療法；基因芯片;腎臟

高血壓一種以動脈血壓持續(xù)升高為主要表現(xiàn)的慢性疾病，是嚴(yán)重危害人類健康的重大疾病之一[1]，研究[2]表明強(qiáng)烈的焦慮、緊張、憤怒、抑郁等負(fù)性情緒常引起的應(yīng)激反應(yīng)是現(xiàn)代社會快節(jié)奏生活導(dǎo)致高血壓病的重要原因。在環(huán)境應(yīng)激導(dǎo)致的血壓升高過程中，自身血壓高于正常血壓值，但是并未達(dá)到高血壓的診斷標(biāo)準(zhǔn)，稱之為高血壓前期?！吨袊哐獕悍乐沃改?010》明確指出[1]，收縮壓120～139 mmHg和(或)舒張壓80～89 mmHg的人群，為正常高值血壓，等同為高血壓前期。目前高血壓已成為造成終末期腎臟病(KSRD)的主要原因之一[3]。腎臟損害的增加，會反過來升高血壓，形成惡性循環(huán)。針剌療法[4]干預(yù)高血壓前期以中醫(yī)理論為指導(dǎo)，具有操作簡便、不良反應(yīng)少、效果平穩(wěn)等優(yōu)勢，而針刺干預(yù)高血壓前期機(jī)制值得進(jìn)一步研究[5-6]。本實驗運(yùn)用基因芯片技術(shù)和生物信息學(xué)分析技術(shù)，通過分析針刺對腎臟基因表達(dá)的影響，從基因?qū)用骊U釋針刺降壓和腎臟保護(hù)的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 SPF級，雄性Wistar大鼠，9周齡，體質(zhì)量(220±30)g，購買于北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司，許可證號:SCXK(京)200223。整個研究過程中，控制室溫在(20±1)℃，濕度50%，12 h明暗循環(huán)，自由進(jìn)食及飲水。實驗過程中的所有程序均遵循WHO頒布的生物醫(yī)學(xué)研究中的動物實驗國際倫理準(zhǔn)則，并已得到北京中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物倫理委員會批準(zhǔn)。

1.2 分組 根據(jù)隨機(jī)數(shù)字表將36只實驗用大鼠隨機(jī)分成3組：空白組、模型組和針刺+模型組，每組12只。

1.3 模型制備 通過足底電擊結(jié)合噪聲刺激制備應(yīng)激性高血壓大鼠模型。將模型組和針刺+模型組大鼠放入MG-2 型迷宮刺激器(中國安徽淮北正華生物儀器有限公司生產(chǎn))，迷宮刺激器籠子為(22 cm×22 cm×26 cm)的規(guī)格，籠子底部由細(xì)的銅柵構(gòu)成，銅柵間隙為1.2 cm。銅柵上通以間斷性交流電，給予動物足底電脈沖刺激；刺激脈沖每2～25 s之間隨機(jī)發(fā)生1次，每次通電的間隔由計算機(jī)程序控制，刺激脈沖電壓為30 V，每次持續(xù)時間為5 s，電流的輸出無規(guī)律可循，從而增強(qiáng)了應(yīng)激強(qiáng)度，使之產(chǎn)生高度精神及情緒上的緊張。電刺激的同時,由蜂鳴器發(fā)出噪聲，80～100 db，時程50 ms。每天上午8∶00—10∶00和下午14∶00—16∶00進(jìn)行造模，在同一時間段內(nèi)將空白組置于相同的鼠籠，沒有足底電擊和噪聲刺激。造模共持續(xù)11 d。1.4 干預(yù) 3組大鼠均寬松地置于暴露四肢的特制限制器中。于后肢足背1、2趾骨凹陷處取太沖穴；肘橫紋外側(cè)端，屈肘，當(dāng)尺澤穴與肱骨外上髁連線中點取曲池穴。模型加針刺組：將針灸針(0.32 mm×25 mm，中國蘇州針灸用品有限公司生產(chǎn))分別直刺大鼠雙側(cè)太沖穴、曲池穴1.5～2.0 mm、4 mm。留針20 min。從造模第1天開始每天1次，一直持續(xù)到第11天造模結(jié)束?？瞻捉M和模型組大鼠固定在相同限制器內(nèi)20 min，不接受針刺干預(yù)。所有干預(yù)均有同1人完成。

1.5 血壓測量 在造模前1天以及造模第3、5、7、9、11天上午進(jìn)行應(yīng)激刺激前進(jìn)行血壓測量。在溫控(22±2)℃環(huán)境中測量大鼠尾動脈收縮壓。將大鼠放于36 ℃的預(yù)熱箱中預(yù)熱15 min后，在大鼠安靜、清醒的狀態(tài)下用無創(chuàng)血壓儀測量大鼠收縮壓。每只大鼠測量3次，取平均血壓值。

1.6 取材 在11 d造模結(jié)束后的第2天上午8∶00，對所有大鼠進(jìn)行腹膜內(nèi)注射100 g/L水合氯醛(500 mg/kg)(中國北京博朗生科技有限公司提供)予以麻醉。大鼠死亡后，取腎臟放于冰塊上迅速剝離包膜，用經(jīng)4 ℃生理鹽水清洗，干燥后放于凍存管中，再經(jīng)液氮固定后于-80 ℃冰箱保存。

1.7 樣品制備和微陣列芯片圖像分析 使用mirVanamiRNA分離試劑盒(P/N AM1552，USA)，從獨立樣本中分別提取出總RNA。使用NanoDropND-1000(USA)檢測總RNA質(zhì)量，用Agilent 2100 bioanalysis(廠商信息)評估總RNA完整性。運(yùn)用Gene Chip Rat Gene 2.0 ST Array(USA)(包括610 400個不同探針,相當(dāng)于16 771個良好注釋的基因)對各組的生物學(xué)樣本進(jìn)行微陣列分析,并重復(fù)3次。按照以下步驟對每個樣本的總RNA進(jìn)行標(biāo)記、雜交:1)制備Poly-A RNA質(zhì)控；2)合成第一鏈cDNA；3)合成第二鏈cDNA；4)合成cRNA的體外逆轉(zhuǎn)錄；5)合成第二輪單鏈cDNA；6)使用RNase H水解RNA；7)片段化和標(biāo)記單鏈cDNA；8)使用Affymetrix GeneChip 645系統(tǒng)進(jìn)行芯片雜交；9)使用Affymetrix GeneChip 450系統(tǒng)進(jìn)行芯片洗染。使用Affymetrix GeneChip 7G微陣列掃描儀(Affymetrix,USA)掃描芯片。以上標(biāo)記和雜交步驟均依據(jù)Affymetrix協(xié)議(GeneChip WT PLUS Reagent Kit，P/N 902280，Affymetrix，USA)執(zhí)行。

1.8 數(shù)據(jù)分析 將掃描圖輸入到Affymetrix Expression console software中，對齊網(wǎng)格后對芯片圖像進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。使用Affymetrix Expression console software中的Robust Multichip Average(RMA+SKETCH)算法對基因表達(dá)的數(shù)據(jù)進(jìn)行歸一化的處理與分析。歸一化的數(shù)據(jù)將以CHP格式存放，并轉(zhuǎn)化成fold-change值表示差異表達(dá)基因的倍數(shù)變化，再將其輸入到Transcriptome Analysis console作進(jìn)一步分析。差異表達(dá)基因的篩選標(biāo)準(zhǔn)為P<0.05,fold-change閾值為1.5,基因fold-change值大于或等于1.5都視為差異表達(dá)基因。模型組與空白組、模型+針刺組分別對照。

1.9 基因功能分析 運(yùn)用Affymetrix Gene Chip Gene 2.0 ST芯片篩選組間差異表達(dá)基因，并校正各組所有基因的背景值。運(yùn)用GO數(shù)據(jù)庫從生物過程、細(xì)胞成分和分子功能3個層面對組間差異表達(dá)基因進(jìn)行基因功能富集分析。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠血壓值變化 見表1。

mmHg

注:與正常組比較，##P<0.01;與模型組比較，△P<0.05

2.2 基因芯片結(jié)果 與空白組相比，模型組共簡選出差異表達(dá)基因46個上調(diào)，48個下調(diào)；與模型組相比，電針治療后有11個上調(diào)，45個下調(diào)。經(jīng)統(tǒng)計共有3個基因在2組中的表達(dá)差異均大于1.5倍,說明有3個基因在模型制備后及電針治療均發(fā)生顯著的表達(dá)差異(fold change>1.5；P<0.05)，見表2。

表2 差異基因

2.3 GO功能富集分析 基因組注釋(Genome annotation)是利用生物信息學(xué)方法和工具，對基因組所有基因的生物學(xué)功能進(jìn)行高通量注釋。Gene Ontology(GO)是基因本體論聯(lián)合會(Gene Ontology Consortium)所建立的數(shù)據(jù)庫，本研究利用該數(shù)據(jù)庫將實驗3組間所得到的差異表達(dá)基因在GO(http://www.gene.ontology.org)登陸,從分子功能、細(xì)胞成分、生物學(xué)途徑3個層面查詢并進(jìn)行基因功能富集分析，發(fā)現(xiàn)差異基因與生物調(diào)節(jié)，刺激反應(yīng)，多細(xì)胞生物體過程，代謝過程，免疫系統(tǒng)進(jìn)程，受體活性，調(diào)節(jié)酶，轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白活性等功能有關(guān)。

3 討論

本研究采用脅迫擁擠加噪聲結(jié)合足底電擊的應(yīng)激性刺激，將心理軀體2種方式相結(jié)合，以更好的模擬人類的接受應(yīng)激刺激所造成的疾病的過程。研究[7-8]表明此動物模型在15 d時血壓達(dá)到最高值，在刺激不變的情況下15～28 d內(nèi)血壓保持穩(wěn)定。由此可以認(rèn)為1～15 d是應(yīng)激性動物高血壓前期，15～28 d是應(yīng)激性高血壓的穩(wěn)定期。根據(jù)應(yīng)激性血壓的升高規(guī)律，本實驗在大鼠接受應(yīng)激刺激后的第11天即高血壓前期階段，通過基因芯片技術(shù)檢測出針刺干預(yù)后基因表達(dá)有顯著差異的基因并查找相關(guān)的生物學(xué)功能。結(jié)果顯示，應(yīng)激刺激使模型組大鼠血壓明顯升高，并在高血壓前期階段就表現(xiàn)出基因的差異表達(dá)，經(jīng)篩查，高血壓及腎臟保護(hù)作用密切相關(guān)基因有Cntn4，Mir10，F(xiàn)BXO15基因。

Cntn4基因即神經(jīng)細(xì)胞黏附蛋白。強(qiáng)關(guān)聯(lián)的血清尿酸濃度的調(diào)節(jié)與CNTN4等基因的3p26區(qū)域相關(guān)[9]。石慧婧[10]發(fā)現(xiàn)血尿酸升高亦可增加高血壓的發(fā)病風(fēng)險并和早期腎功能損傷正相關(guān)；尿酸升高的早期CKD大鼠血管內(nèi)皮細(xì)胞存在明顯損傷，出現(xiàn)功能紊亂，且損傷程度與血尿酸水平成正相關(guān)[11-12]。

Mir10基因是小分子 RNA(Mirna)，通過影響穩(wěn)定性和翻譯的基因，參與在多細(xì)胞生物的基因表達(dá)的轉(zhuǎn)錄調(diào)控。內(nèi)皮功能紊亂參與動脈粥樣硬化的形成，被認(rèn)為是心血管疾病發(fā)生的重要預(yù)測因子[13]。在治療血管損傷性疾病過程中，損傷血管內(nèi)膜再內(nèi)皮化及缺血部位血管新生均起到了重要作用，內(nèi)皮祖細(xì)胞具有定向參與以上2個過程的作用[14-15]。研究[17-18]表明尿 miR-10a代表新的無創(chuàng)、敏感、特異、潛在的高吞吐量方法可檢測早期腎功能損傷。FBXO15 的調(diào)節(jié)通過泛素-蛋白酶體途徑表達(dá)。研究[17]表明，泛素-蛋白酶體系統(tǒng)參與調(diào)節(jié)平滑肌細(xì)胞的凋亡、增殖和分化起著關(guān)鍵性作用。泛素連接酶基因可降低動脈血管心肌素的蛋白水平和血管平滑肌細(xì)胞標(biāo)志基因的表達(dá)，調(diào)節(jié)主動脈血管收縮性。

綜上，針刺干預(yù)高血壓前期，可以通過調(diào)節(jié)Cntn4，Mir10，F(xiàn)BXO15等基因，調(diào)節(jié)血管內(nèi)皮功能，血管平滑肌細(xì)胞的凋亡，血清尿酸濃度等來降低高血壓的發(fā)病風(fēng)險并防治早期腎功能損傷。

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Acupuncture treating gene expression in kidney of stress-induced pre-hypertension rats

GUO Qiying,SUN Qisheng,JIA Wenrui,GUO Qiulei,YANG Fangyuan,ZHAN He,WANG He,LIU Qingguo*

(School of Acupuncture and Massage,Beijing University of Chinese Medicine,Beijing 100029,China)

Objective To use gene chip technology and bioinformatics technologies,study the effects of acupuncture on gene expression in kidney of stress-induced pre-hypertension rat.Methods The 9-week-old male Wistar rats were randomly divided into blank group,model group,and acupuncture group.Model group and acupuncture group using noise combined with foot shock to stimulate touch,at the same time,the acupuncture group was applied to bilateral “Taichong”(LR3) and Quchi(LI11) for 20 min.The model control and blank control group rats were grabbed in the same restrainers for 20min without any other intervene.Recorded in model 1 day before,3 th 5 th 7 th 9 th 11th day rats blood pressure changes,after 11 days,draw left kidney materials of rats and use Gene Chip Rat Gene 2.0 ST chips analysed the differentially expressed genes between the blank group and model group,model group and acupuncture group.Using the differentially expressed genes between groups for enrichment of gene function analysis by GO database.Results The model began,the blank group blood pressure remain stable;3rd day of model group blood pressure begins to rise,significant differences compared with the normal group (P<0.01),and behavioural change.5th day the acupuncture group blood pressure lower than the model group (P<0.05).Microarray analysis showed that compared with the blank group,model group of the differentially expressed genes screened out 46 increases 48 reduced,after acupuncture treatment there are 11 increase and 45 down of differentially expressed genes;Enrichment of gene function analysis revealed differences in biological regulation,response to stimulus,genetic and biological regulation,multicellular organismal process,metabolic process,immune system process,enzyme regulator activity,transporter activity and other function.Conclusion Acupuncture at Taichong and Quchi can lower the SBP of stress-induced pre-hypertension rats and possibly through down the genes Cntn4,Spta1,Mir10a,Fbxo15 to regulation blood pressure and protect kidney.

stress-induced hypertension;pre-hypertension;acupuncture;gene chip;kidney

10.13463/j.cnki.cczyy.2016.06.005

國家自然科學(xué)基金“基于系統(tǒng)生物學(xué)的針刺對應(yīng)激性前期高血壓的調(diào)控機(jī)制與干預(yù)靶點的研究” (81373727)。

郭騏影(1990-)，女，碩士研究生，主要從事針灸臨床及機(jī)理研究。

R245

A

2095-6258(2016)06-1112-04

2016-08-10)

*通信作者：劉清國，男，教授，電話-13691517881，電子信箱-liuqingguo999@vip.sina.cn