依達(dá)拉奉減輕毒死蜱誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞損傷

宋 英，壽麗蒙，陳曼婷

(浙江工業(yè)大學(xué) 藥學(xué)院，浙江 杭州 310014)

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依達(dá)拉奉減輕毒死蜱誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞損傷

宋 英，壽麗蒙，陳曼婷

(浙江工業(yè)大學(xué) 藥學(xué)院，浙江 杭州 310014)

驗證毒死蜱對神經(jīng)細(xì)胞的損傷作用，并探究依達(dá)拉奉對毒死蜱誘導(dǎo)PC12細(xì)胞損傷的保護(hù)作用及其機(jī)制.MTT法摸索毒死蜱最佳損傷濃度以及依達(dá)拉奉最佳保護(hù)濃度，設(shè)立正?？瞻讓φ战M、毒死蜱損傷模型組和依達(dá)拉奉保護(hù)毒死蜱損傷組，倒置顯微鏡下觀察PC12細(xì)胞形態(tài)，Hocehst33342染色，熒光顯微鏡下觀察各組細(xì)胞凋亡情況，western-blot檢測各組全細(xì)胞Nrf-2蛋白表達(dá)變化情況.結(jié)果表明：MTT法確定最佳毒死蜱損傷濃度為200 μmol/L，依達(dá)拉奉最佳保護(hù)濃度為25 μmol/L；光學(xué)顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)，依達(dá)拉奉可減輕毒死蜱誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞損傷；Hocehst33342染色顯示毒死蜱可誘導(dǎo)PC12凋亡，依達(dá)拉奉減輕了毒死蜱對PC12的損傷；western-blot結(jié)果顯示依達(dá)拉奉組全細(xì)胞Nrf-2蛋白表達(dá)明增加，多于正常組和毒死蜱損傷組，正常組和毒死蜱組表達(dá)量相近.毒死蜱對PC12細(xì)胞具有損傷作用，可誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡；依達(dá)拉奉具有減輕毒死蜱對PC12細(xì)胞損傷作用的功能，其保護(hù)機(jī)制可能是通過Nrf-2作用的.

依達(dá)拉奉；毒死蜱；大鼠嗜鉻細(xì)胞瘤細(xì)胞株；Nrf-2

有機(jī)磷農(nóng)藥(Organophosphates，OPs)在我國是使用范圍最廣、使用量最大的一種殺蟲劑，早期主要包括敵敵畏、甲拌磷、對硫磷和甲胺磷等，多為高毒品種，對人、畜毒性很強(qiáng)，環(huán)境污染嚴(yán)重.2008年1月底，我國徹底停止了甲胺磷、對硫磷、甲基對硫磷、久效磷和磷胺等5種高毒有機(jī)磷農(nóng)藥的生產(chǎn)、流通和使用.毒死蜱(Chlorpyrifos，CPF)作為一種替代高毒農(nóng)藥的高效、中毒殺蟲劑，已成為有機(jī)磷類殺蟲劑的主流產(chǎn)品，被廣泛應(yīng)用.隨著應(yīng)用范圍的擴(kuò)大及使用量的增加，人們逐漸意識到毒死蜱的潛在危險性，其對生態(tài)環(huán)境的污染以及對人類健康的危害日益引起國內(nèi)外學(xué)者的重視.Jeong Eun Lee等率先用人體神經(jīng)祖細(xì)胞(Human neural precursor cells，hNPCs)模型證明毒死蜱可降低細(xì)胞活力，增加乳酸脫氫酶的釋放，誘導(dǎo)活性氧ROS的產(chǎn)生，具有細(xì)胞毒性，數(shù)據(jù)顯示毒死蜱很可能具有影響神經(jīng)發(fā)育的作用[1].流行病學(xué)研究也發(fā)現(xiàn)有機(jī)磷農(nóng)藥暴露與帕金森病(Parkinson’s diesase，PD)的發(fā)生有一定關(guān)聯(lián).Slotkin等用分化的PC12細(xì)胞比較了毒死蜱、二嗪農(nóng)(diazinon)、狄氏劑(dieldrin)和二價鎳(Ni2+)對帕金森病相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄的影響，發(fā)現(xiàn)有機(jī)磷類農(nóng)藥毒死蜱和二嗪農(nóng)，雖然作用方式不同，但是都明顯地改變了帕金森病相關(guān)基因的表達(dá)，表明有機(jī)磷農(nóng)藥的暴露是帕金森發(fā)病的潛在危險因素[2].

大量研究結(jié)果顯示活性氧或自由基在神經(jīng)變性疾病的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮著重要作用.相對其他組織，大腦耗氧量高，抗氧化劑水平較低，且膜結(jié)構(gòu)中含有更多可氧化的不飽和脂肪酸，更容易受到氧化損傷.在發(fā)育階段的大腦為了滿足生長需求，代謝加劇，但抗氧化劑儲備量卻仍處于發(fā)育階段的較低水平，氧化應(yīng)激對其帶來的損傷作用遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于成熟大腦[3].依達(dá)拉奉(Edaravone)作為一種強(qiáng)力自由基清除劑，可抑制氧化應(yīng)激，延緩神經(jīng)變性疾病的發(fā)生發(fā)展，具有腦保護(hù)作用，可作為潛在的神經(jīng)變性疾病治療藥物.Xiong N等在魚藤酮誘導(dǎo)帕金森病大鼠模型中發(fā)現(xiàn)，依達(dá)拉奉可以抑制活性氧的產(chǎn)生、抑制促凋亡蛋白Bax的表達(dá)和上調(diào)囊泡單胺轉(zhuǎn)運(yùn)體的表達(dá)等作用，減輕魚藤酮導(dǎo)致的全身僵硬，抑制中腦線粒體損傷和多巴胺神經(jīng)元的退化，提示依達(dá)拉奉可能是帕金森病的潛在治療藥物[4].然而依達(dá)拉奉應(yīng)用于臨床的可行性和確切作用機(jī)制還需要進(jìn)一步的理論依據(jù).環(huán)境中殘留的不至于引起急性中毒癥狀的有機(jī)磷，不易被人體察覺，常常被忽視，因此長期暴露于低水平有機(jī)磷環(huán)境的危害必須得到證實并加以控制.基于這一研究目的，用PC12細(xì)胞建立有機(jī)磷農(nóng)藥毒死蜱損傷模型，研究依達(dá)拉奉對毒死蜱損傷的保護(hù)作用及其潛在機(jī)制，對長期暴露于低水平有機(jī)磷環(huán)境的危險性加以證明，并為依達(dá)拉奉的臨床廣泛應(yīng)用提供理論參考.

2 材料與方法

2.1 實驗材料

2.1.1 試劑

依達(dá)拉奉(先聲藥業(yè)，南京)；毒死蜱(CPF，浙江新農(nóng)化工股份有限公司)；二甲基亞砜DMSO(Sigma-aldrich，美國)；二苯基四氮唑溴鹽MTT(上海生物技術(shù)有限公司)；Hoechst33342(南京凱基生物科技發(fā)展有限公司)；DMEM高糖培養(yǎng)基(吉諾生物醫(yī)藥科技有限公司，杭州)；胎牛血清(四季青，杭州)；胰酶溶液-EDTA含酚紅(南京凱基生物科技發(fā)展有限公司)；PC 12 細(xì)胞(上海中科院細(xì)胞所).

2.1.2 儀器耗材

細(xì)胞培養(yǎng)瓶、96 孔板、離心管和培養(yǎng)皿(Nest，中國)；生物安全柜(ESCO，新加坡)；二氧化碳細(xì)胞培養(yǎng)箱(Thermo，美國)；電子天平(METTLER TOLEDO，美國)；倒置熒光顯微鏡(Nikon，日本)；酶標(biāo)儀(BioTek，美國)；臺式高速離心機(jī)(Thermo，德國)；臺式高速冷凍離心機(jī)(HERMLE，Z36HK，德國)；電泳儀(Bio-red，美國)；化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)(Bio-red，美國)；4 ℃冰箱(西門子，中國)；-20 ℃冰箱(中科美菱，中國)；-80 ℃冰箱(Thermo，美國).

2.2 毒死蜱對PC12細(xì)胞最佳損傷濃度摸索

將細(xì)胞以1×104的密度接種于96 孔板，每孔100 μL；6 h后加藥，棄去原培養(yǎng)液，毒死蜱溶解于DMSO，用培養(yǎng)液稀釋毒死蜱溶液，設(shè)立毒死蜱濃度梯度為50，100，150，200，250 μmol/L，DMSO終含量都為1%；作用24 h候之后，棄去含藥培養(yǎng)液，PBS清洗一遍，加入培養(yǎng)液100 μL，再加入MTT溶液10 μL(MTT質(zhì)量濃度為5 mg/mL)，細(xì)胞培養(yǎng)箱放置3 h；3 h后吸去每孔中溶液，加入DMSO各150 μL，充分溶解結(jié)晶后使用酶標(biāo)儀在490 nm波長下檢測吸光度，記錄OD值用于確定最佳損傷濃度.

2.3 依達(dá)拉奉對毒死蜱誘導(dǎo)PC12細(xì)胞損傷的最佳保護(hù)濃度摸索

以1×104的密度將細(xì)胞接種于96 孔板中，每孔100 μL.6 h候后加藥，用2.2節(jié)中確定的毒死蜱最佳損傷濃度建立損傷模型，設(shè)立空白組、毒死蜱損傷組和依達(dá)拉奉保護(hù)毒死蜱損傷組，其中依達(dá)拉奉保護(hù)損傷組設(shè)立依達(dá)拉奉濃度梯度為5，25，50，100，200 μmol/L，作用24 h候之后，棄去含藥培養(yǎng)液，PBS清洗一遍，加入培養(yǎng)液100 μL，再加入MTT溶液10 μL(MTT質(zhì)量濃度為5 mg/mL)，細(xì)胞培養(yǎng)箱放置3 h；3 h后棄去每孔中溶液，加入DMSO各150 μL，充分溶解結(jié)晶后使用酶標(biāo)儀在490 nm波長下檢測吸光度，記錄OD值用于確定依達(dá)拉奉最佳保護(hù)濃度.

2.4 倒置顯微鏡PC12細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察

將PC12細(xì)胞接種與6 孔板中，設(shè)立正常組、毒死蜱損傷組和依達(dá)拉奉保護(hù)毒死蜱損傷組，6 h后按照2.2節(jié)和2.3節(jié)中的最佳損傷濃度和最佳保護(hù)濃度給藥，給藥方式及操作步驟同2.3，作用24 h后，倒置顯微鏡下觀察各組PC12細(xì)胞形態(tài).

2.5 Hoechst33342細(xì)胞核染色

以1×104的密度將細(xì)胞接種于96 孔板中，每孔100 μL，設(shè)立正常組、毒死蜱損傷組和依達(dá)拉奉保護(hù)毒死蜱損傷組，加藥作用24 h后加入終質(zhì)量濃度為5 μg/mL的Hoechst33342進(jìn)行染色，每孔30 μL，避光靜置15 min后，吸去Hoechst33342液體，加入PBS清洗一遍后每孔加入不含酚紅的DMEM培養(yǎng)基100 μL，在熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞凋亡情況.

2.6 Western blot檢測Nrf-2蛋白表達(dá)情況

2.6.1 細(xì)胞培養(yǎng)

將PC12細(xì)胞培養(yǎng)與培養(yǎng)皿中，設(shè)立正常組、損傷組和保護(hù)組，正常組為空白細(xì)胞組，損傷組給予毒死蜱最佳損傷濃度處理24 h，保護(hù)組給予相同毒死蜱濃度以及依達(dá)拉奉最佳保護(hù)濃度處理24 h.

2.6.2 全細(xì)胞蛋白提取

藥物處理24 h后，棄去原培養(yǎng)液，各組加入適量PBS清洗2 次，洗去剩余培養(yǎng)液，用細(xì)胞刮刀收集細(xì)胞，每個皿加入200 μL細(xì)胞裂解液(含PMSF，終濃度為1 mmol/L)，用槍吹打數(shù)次，使所有細(xì)胞充分接觸裂解液(以上都在冰上操作)，充分裂解后，4 ℃，12 000 g離心4 min，取上清，-80 ℃保存用于后續(xù)實驗.

2.6.3 蛋白質(zhì)量濃度測定

一管蛋白標(biāo)準(zhǔn)品(20 mg BSA)中加入0.8 mL蛋白標(biāo)準(zhǔn)配制液，充分溶解后即為25 mg/mL的蛋白標(biāo)準(zhǔn)溶液；取適量上述25 mg/mL的蛋白標(biāo)準(zhǔn)溶液，使用PBS稀釋至0.5 mg/mL，即為最終標(biāo)準(zhǔn)品終質(zhì)量濃度；V(BCA試劑A)∶V(BCA試劑B)=50∶1，按此比列充分混勻，備用；96 孔板中，將標(biāo)準(zhǔn)品0，1，2，4，8，12，16，20 μL分別加入96 孔板中；取適量體積的樣品加入96 孔板中，加入PBS使上述每個標(biāo)準(zhǔn)品孔和樣品孔最終體積都為20 μL；各孔加入BCA工作液200 μL后，放96 孔板于37 ℃，20～30 min；使用酶標(biāo)儀在562 nm波長下測定吸光度，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品曲線計算出樣品的蛋白質(zhì)量濃度.

2.6.4 蛋白變性

由2.6.3節(jié)中檢測的各組蛋白質(zhì)量濃度，使用雙蒸水將各組蛋白定量成同一質(zhì)量濃度，取適量，分別加入SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液(5X)，體積比為V(蛋白樣品)∶V(上樣緩沖液)=4∶1，混勻后沸水中加熱3～5 min，充分變性蛋白，冷卻到室溫后，-80 ℃封口保存，用于后續(xù)實驗.

2.6.5 凝膠電泳

根據(jù)蛋白分子量配制10%分離膠和5%濃縮膠，制膠成功后，在加樣孔中上樣，同時加一組彩色預(yù)染蛋白作為之后蛋白分子量判斷條帶；100 V恒壓電泳，30 min后，調(diào)節(jié)電壓至150 V，直至溴酚蘭到達(dá)分離膠底部，停止電泳，取出整片膠，根據(jù)彩色預(yù)染蛋白條帶及Nrf-2蛋白分子量切膠.

2.6.6 轉(zhuǎn)膜

裁剪一張與凝膠大小形狀相符的硝酸纖維素膜，浸泡于轉(zhuǎn)移液中，轉(zhuǎn)移裝置中依次為正極板、海綿、濾紙、凝膠、硝酸纖維素膜、濾紙、海綿和負(fù)極板，鋪好之后使用玻璃棒滾壓，趕盡凝膠與硝酸纖維素膜之間的氣泡，放入轉(zhuǎn)膜儀器中，300 mA電流，持續(xù)冰浴，90 min左右.

2.6.7 抗體孵育

取出硝酸纖維素膜，放入封閉液中；搖床上封閉2 h后，取出硝酸纖維素膜放入一抗中，搖床上室溫孵育0.5 h后置于4 ℃冰箱孵育過夜；一抗孵育結(jié)束后，取出，使用TBST清洗3次，搖床，每次10 min；清洗結(jié)束后把膜浸沒于二抗中，室溫?fù)u床孵育2 h；二抗孵育結(jié)束后，使用TBST清洗3 次，搖床，每次10 min.

2.6.8 顯影

按V(A液)∶V(B液)=1∶1的比例配制ECL顯影液(使用前配制，盡量避光)，在化學(xué)發(fā)光成像儀樣品板上，事先鋪上一層保鮮膜，將2.6.7節(jié)中清洗結(jié)束的硝酸纖維素膜置于保鮮膜上，盡量確保膜在成像板正中間，在膜上以及膜的四周滴上適量剛配制的ECL顯影液，運(yùn)行儀器，顯影.

2.7 統(tǒng)計方法

數(shù)據(jù)通過 GraphPad Prism 軟件(One-way ANOVA)分析，用mean±SD表示，設(shè)置在p<0.05水平時有統(tǒng)計學(xué)意義.

3 實驗結(jié)果

3.1 毒死蜱對PC12細(xì)胞損傷作用

按照2.2節(jié)的實驗步驟，設(shè)立毒死蜱濃度梯度50，100，150，200，250 μmol/L，作用于PC12細(xì)胞24 h之后，酶標(biāo)儀490nm波長檢測吸光度記錄各組OD值.處理數(shù)據(jù)見圖1，圖1中，以空白對照組的MTT吸光度值為100%，用其余各組吸光度值與空白對照組的比例表示為細(xì)胞存活率，結(jié)果如圖1所示，隨著毒死蜱濃度的增加，細(xì)胞存活率下降，呈一定的負(fù)相關(guān)(R2=0.928 8)，表明毒死蜱對PC12細(xì)胞的損傷隨著濃度的增加損傷程度不斷增大.當(dāng)毒死蜱濃度為200 μmol/L時，細(xì)胞存活率為63%，據(jù)此選擇毒死蜱濃度200 μmol/L作為最佳損傷濃度，用于建立后續(xù)損傷實驗?zāi)Ｐ?

圖1 不同濃度毒死蜱對PC12細(xì)胞的作用Fig.1 The effects of CPF on PC12 cells

3.2 依達(dá)拉奉對毒死蜱誘導(dǎo)PC12細(xì)胞損傷的保護(hù)作用

選取3.1節(jié)中毒死蜱最佳損傷濃度200 μmol/L，作為之后實驗中依達(dá)拉奉保護(hù)的損傷模型濃度，建立空白對照組、毒死蜱損傷模型組和依達(dá)拉奉保護(hù)毒死蜱損傷組，設(shè)立依達(dá)拉奉濃度梯度5，25，50，100，150 μmol/L，作用24 h后同樣使用酶標(biāo)儀在490 nm波長下檢測吸光度值并記錄，處理數(shù)據(jù)得結(jié)果如圖2所示，以空白對照組的MTT吸光度值為100%，用其余各組吸光度值與空白對照組的比例表示為細(xì)胞存活率.依達(dá)拉奉對毒死蜱的損傷具有保護(hù)作用，圖2中所示當(dāng)依達(dá)拉奉濃度為25 μmol/L時，細(xì)胞存活率最高，最接近空白對照組，選擇此濃度作為依達(dá)拉奉最佳保護(hù)濃度.

圖2 不同濃度依達(dá)拉奉對毒死蜱損傷PC12細(xì)胞的作用Fig.2 The effects of Edaravone on PC12 cells injured by CPF

3.3 PC12細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察

6 孔板中，設(shè)立正常組、毒死蜱損傷組和依達(dá)拉奉保護(hù)毒死蜱損傷組，加藥作用24 h候，在倒置顯微鏡下觀察PC12細(xì)胞形態(tài).得各組細(xì)胞形態(tài)如圖3所示，圖3(a)為正常對照組細(xì)胞，細(xì)胞形態(tài)完整，突起生長正常；圖3(b)為毒死蜱損傷組，相較于正常組，細(xì)胞密度稀疏，細(xì)胞形態(tài)不完整，尤其是突起的生長，長度不及正常組，甚至消失；圖3(c)為依達(dá)拉奉保護(hù)毒死蜱損傷組，細(xì)胞形態(tài)接近正常組，突起生長狀況良好，較少見突起完全消失的細(xì)胞，細(xì)胞密度相比于損傷組有增加.可見，依達(dá)拉奉對毒死蜱誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞損傷具有一定的保護(hù)作用，可減輕PC12的損傷.

圖3 依達(dá)拉奉對CPF誘導(dǎo)PC12損傷細(xì)胞形態(tài)變化的影響Fig.3 Effect of Edaravone on PC12 cells morphological changes induced by CPF

3.4 Hoechst33342染色觀察細(xì)胞凋亡

Hocehst33342染料可進(jìn)入細(xì)胞膜，對細(xì)胞核進(jìn)行染色，根據(jù)細(xì)胞膜的通透性進(jìn)入多少最終顯示為細(xì)胞核染色熒光強(qiáng)弱不同，凋亡細(xì)胞細(xì)胞膜通透性強(qiáng)于正常細(xì)胞，所以進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)的Hoechst33342染料多于正常組，細(xì)胞核染色呈亮藍(lán)色，藍(lán)色熒光強(qiáng)度強(qiáng)于正常組，根據(jù)熒光強(qiáng)度區(qū)別凋亡細(xì)胞和正常細(xì)胞.將細(xì)胞接種于96 孔板中，設(shè)立正常組，毒死蜱損傷組，依達(dá)拉奉保護(hù)毒死蜱損傷組，加藥作用24 h進(jìn)行Hocehst33342染色，在熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞染色情況如圖4所示，圖4(a)為正常組，圖4(b)為毒死蜱損傷組，圖4(c)為依達(dá)拉奉保護(hù)組，比較之下，毒死蜱損傷組細(xì)胞核染色明顯呈亮藍(lán)色，細(xì)胞密度也與光學(xué)顯微鏡下觀察相符，較為稀疏，說明毒死蜱可損傷PC12細(xì)胞，誘導(dǎo)其凋亡；依達(dá)拉奉保護(hù)組染色與正常組相近，顯示依達(dá)拉奉在一定程度上減輕了毒死蜱對PC12的損傷作用.

圖4 Hocehst33342染色觀察各組細(xì)胞凋亡情況Fig.4 Cell apoptosis in different groups stained by Hocehst33342

3.5 Western blot檢測Nrf-2全細(xì)胞表達(dá)變化

設(shè)立正常組、毒死蜱損傷組和依達(dá)拉奉保護(hù)毒死蜱損傷組，提取蛋白后western-blot檢測蛋白表達(dá)情況.結(jié)果如圖5所示，依達(dá)拉奉組全細(xì)胞Nrf-2蛋白表達(dá)明顯多于正常組和毒死蜱組，而毒死蜱組該蛋白表達(dá)接近與正常組，結(jié)合與損傷組Nrf-2表達(dá)量的比較，推測依達(dá)拉奉減輕毒死蜱誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞損傷作用機(jī)制可能是通過Nrf-2實現(xiàn)的.

圖5 Western blot檢測全細(xì)胞Nrf-2表達(dá)情況Fig.5 Western blot analysis Nrf-2 expression in whole cell level

4 討 論

Slotkin等首先用SD大鼠乳鼠比較了毒死蜱和二嗪農(nóng)的神經(jīng)發(fā)育毒性作用，雖然二者作用不完全相同，但是數(shù)據(jù)證實兩者都具有神經(jīng)發(fā)育毒性，而兩者作用方式的不同也提示需要進(jìn)一步的實驗研究來揭示有機(jī)磷農(nóng)藥的作用機(jī)制[5-6].Roegge等研究發(fā)現(xiàn)新生鼠暴露于低濃度的毒死蜱和二嗪農(nóng)，都可導(dǎo)致行為學(xué)的變化[7].Timofeeva等證實低濃度對硫磷可導(dǎo)致持續(xù)的行為變化[8-9]，再一次為長期低濃度暴露有機(jī)磷的危險性加以證明，有機(jī)磷類農(nóng)藥作用機(jī)制急需明確.Slotkin等采用PC12細(xì)胞為體外模型，通過比較不同神經(jīng)發(fā)育毒性劑毒死蜱、二嗪農(nóng)和狄氏劑和二價鎳，試揭示這類膽堿酯酶依賴的神經(jīng)發(fā)育毒性劑的作用機(jī)制[10]，Slotkin的研究也發(fā)現(xiàn)有機(jī)磷農(nóng)藥毒死蜱可引起氧化應(yīng)激，細(xì)胞丟失，并可改變神經(jīng)分化[11-15].顧娟等通過小鼠及體外培養(yǎng)小鼠胚胎端腦細(xì)胞實驗發(fā)現(xiàn)低濃度毒死蜱可顯著引起端腦神經(jīng)細(xì)胞凋亡，并對小鼠的空間記憶能力具有一定影響[16].

相關(guān)文獻(xiàn)報道，毒死蜱可引起神經(jīng)細(xì)胞氧化應(yīng)激，進(jìn)而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，而Nrf2(NF-E2-related factor 2)是細(xì)胞氧化應(yīng)激反應(yīng)中的關(guān)鍵因子，正常條件下，Nrf-2以未活化狀態(tài)存在與細(xì)胞漿中，當(dāng)細(xì)胞發(fā)生氧化應(yīng)激時，Nrf-2活化進(jìn)入細(xì)胞核，與相關(guān)的抗氧化反應(yīng)元件ARE(Antioxidant response element)結(jié)合，啟動一系列抗氧化蛋白的轉(zhuǎn)錄表達(dá).本文實驗結(jié)果表明：毒死蜱對PC12細(xì)胞有損傷作用，顯微鏡下顯示毒死蜱損傷組的細(xì)胞，細(xì)胞扁平，整體形態(tài)不完整，尤其表現(xiàn)在對突起的影響，毒死蜱損傷后多數(shù)PC12的突起生長不完整，長度明顯比正常組細(xì)胞細(xì)短，甚至出現(xiàn)不少細(xì)胞突起消失；Hocehst33342染色也顯示毒死蜱損傷組細(xì)胞多數(shù)凋亡，結(jié)合western blot檢測Nrf-2蛋白表達(dá)結(jié)果，毒死蜱可損傷PC12細(xì)胞，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡；給予依達(dá)拉奉處理后，光鏡下細(xì)胞形態(tài)學(xué)的觀察、Hocehst33342染色凋亡情況及western-blot蛋白表達(dá)結(jié)果一致顯示，依達(dá)拉奉可減輕毒死蜱對PC12細(xì)胞的損傷作用，Nrf-2蛋白含量較損傷組明顯增多，一定程度上加速了抗氧化進(jìn)程，緩解了細(xì)胞氧化應(yīng)激，減少了毒死蜱引起的PC12細(xì)胞凋亡，其保護(hù)作用據(jù)實驗結(jié)果推測由上調(diào)Nrf-2蛋白表達(dá)量實現(xiàn)，而具體的機(jī)制，仍需進(jìn)一步實驗證明.

5 結(jié) 論

毒死蜱對PC12細(xì)胞具有損傷作用，可導(dǎo)致PC12細(xì)胞氧化應(yīng)激，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡；依達(dá)拉奉具有減輕毒死蜱誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞損傷作用，其保護(hù)機(jī)制與上調(diào)Nrf-2蛋白表達(dá)量有關(guān).

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(責(zé)任編輯：陳石平)

Edaravone protects PC12 cells from CPF-induced damage

SONG Ying, SHOU Limeng, CHEN Manting

(College of Pharmaceutical Science, Zhejiang University of Technology, Hangzhou 31014, China)

To evaluate both the damage of chlorpyrifos to PC12 cells and the effect of edaravone on protecting PC12 cells from chlorpyrifos-induced damage, as well as to uncover its possible protective mechanism, MTT method was used to determine the most appropriate concentration of CPF and to evaluate effects of different concentrations of protecting group, we perform a trial pilot study for the control group, the model group injured by CPF and the protecting group treated with CPF and edaravone, using a fluorescent inverted microscope to observe the cell mophology of all groups. Cell apoptosis in different groups were observed by Hocehst33342 stain and the western blot was used to detect the expressions of Nrf-2 in different groups. MTT find out that the most appropriate concentration of CPF is 200 μmol/L, and the most appropriate concentration of edaravone is 25 μmol/L. The cell mophology observation and the Hocehst33342 stain show that CPF can injury PC12 cells and lead to cell apoptosis, the administration of edaravone has a protective effect on the PC12 damage induced by CPF. The increasing expression of Nrf-2 in protecting group is more obviously than both control group and model group shown by western blot, while that of Nrf-2 in model group is similar to that in control group. CPF can cause PC12 injury and lead to cell apoptosis, edaravone can protect PC12 cells from damage induced by CPF, its proper mechanism maybe related to the expression of Nrf-2.

edaravone; chlorpyrifos; PC12; Nrf-2

2016-03-13

浙江省自然科學(xué)基金資助項目(LY17H090018)；全國臨床藥學(xué)研究基金資助項目(L2011079)

宋 英(1968—)，女，浙江紹興人，副教授，研究方向為神經(jīng)藥理學(xué)，E-mail： songying@zjut.edu.cn.

R965

A

1006-4303(2016)06-0654-06