黔產(chǎn)小葉黃楊中環(huán)維黃楊星D的鑒別及不同部位含量測定

楊娟艷, 王 芳, 郭 婷, 吳琳琳, 黃紅梅, 許乾麗, 茅向軍*

1.貴陽中醫(yī)學(xué)院, 貴陽 550002;2.貴州省食品藥品檢驗所, 貴陽 550004;3.遵義醫(yī)學(xué)院, 貴州 遵義 563003;4.貴州醫(yī)科大學(xué), 貴陽 550004

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黔產(chǎn)小葉黃楊中環(huán)維黃楊星D的鑒別及不同部位含量測定

楊娟艷1,2, 王 芳3, 郭 婷4, 吳琳琳4, 黃紅梅1, 許乾麗2, 茅向軍2*

1.貴陽中醫(yī)學(xué)院, 貴陽 550002;2.貴州省食品藥品檢驗所, 貴陽 550004;3.遵義醫(yī)學(xué)院, 貴州 遵義 563003;4.貴州醫(yī)科大學(xué), 貴陽 550004

對黔產(chǎn)小葉黃楊中環(huán)維黃楊星D進行薄層色譜研究，并比較了小葉黃楊不同部位環(huán)維黃楊星D的含量，為合理開發(fā)小葉黃楊的藥用資源提供科學(xué)依據(jù)。采用薄層色譜法對小葉黃楊中環(huán)維黃楊星D進行薄層色譜研究，采用高效液相色譜電噴霧檢測器法對小葉黃楊不同部位環(huán)維黃楊星D進行含量測定。結(jié)果顯示：薄層色譜中環(huán)維黃楊星D斑點清晰；高效液相色譜中小葉黃楊不同部位環(huán)維黃楊星D的含量差異很大，粗莖含量最高，葉子含量最低。該方法可用于小葉黃楊的薄層鑒別和含量測定，為了合理開發(fā)和利用黔產(chǎn)小葉黃楊，其藥用部位以粗莖最好。

小葉黃楊；薄層色譜；不同部位；環(huán)維黃楊星D

小葉黃楊 (Buxussinica) 屬黃楊科(Buxaceae)黃楊屬(Buxus)植物，主要用于風(fēng)濕痹痛、胸腹氣脹、牙痛、胸痹心痛等治療。小葉黃楊中主要含有生物堿類、黃酮類、苷類、羽扇豆烷醇、β-谷甾醇、木脂素、有機酸類等成分[1～5]，其中環(huán)維黃楊星D是小葉黃楊及同屬植物提取精制所得的甾體生物堿[6]，對心衰及心肌細胞受損都具有保護作用[7,8]，可用于心絞痛、心律失常、冠心病等治療[9]。目前，以環(huán)維黃楊星D和小葉黃楊為主要原料的制劑分別有黃楊寧片、寧心滴丸和心腦寧膠囊，該類制劑對心腦血管疾病具有很好的治療效果[10～12]?！吨袊幍洹?2015年版)中對環(huán)維黃楊星D提取物采用非水滴定法測定[13]，該方法測總生物堿靈敏度較低。由于環(huán)維黃楊星D紫外吸收弱，普通的檢測器很難檢測，相關(guān)文獻報道[14,15]對樣品先衍生化，再用HPLC/UV或者HPLC/MS測定，但操作較為繁瑣。

為了合理開發(fā)利用小葉黃楊資源，以及為相關(guān)藥品生產(chǎn)企業(yè)有效藥用的使用提供參考，本文對小葉黃楊中環(huán)維黃楊星D建立了薄層鑒別方法，同時建立了高效液相色譜電噴霧檢測器 (HPLC-CAD) 法測定黔產(chǎn)小葉黃楊不同部位環(huán)維黃楊星D的含量。該法操作簡單、結(jié)果準(zhǔn)確，可用于小葉黃楊的定性研究，為弱紫外吸收的環(huán)維黃楊星D提供了新的檢測方法，同時為小葉黃楊藥用部位的選擇和質(zhì)量控制提供了科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 儀器

UltiMate 3000高效液相色譜儀(美國戴安公司)；Corona電子噴霧檢測器(美國戴安公司)；FE20 pH計和XS205電子天平(瑞士METTLER TOLEDO公司)；DZKW-4電子恒溫水浴鍋(南昌市恒順化驗設(shè)備制備有限公司)；高效硅膠G(青島海洋化工廠)；0.45 μm的微孔濾膜。

1.2 試劑與標(biāo)準(zhǔn)品

環(huán)維黃楊星D (100%，批號：110888-200503，中國食品藥品檢定研究院)；乙腈為色譜純；試劑均為分析純；水為超純水。

1.3 小葉黃楊藥材

小葉黃楊藥材于2012-2015年在貴州扎佐、貴定、六屯等地采集，經(jīng)貴州省食品藥品檢驗所中藥標(biāo)本館李楊館長鑒定為黃楊科黃楊屬植物小葉黃楊[Buxussinica(Rehd. etWils)Cheng]。采集的藥材陰干打粉后，置干燥器中儲存。

1.4 試驗方法

1.4.1 薄層色譜 取小葉黃楊粗粉約4.0 g，置100 mL錐形瓶中，加濃氨水5 mL，拌勻，靜置10 min。加入氯仿25 mL，超聲1 h，放冷，濾過，濾液揮發(fā)至約2 mL。稱取干燥至恒重的環(huán)維黃楊星D對照品適量，用氯仿制成濃度為0.02 mg/mL的對照品溶液。

分別吸取薄層色譜對照品溶液和薄層色譜供試品溶液各5 μL，點于同一高效硅膠G薄層板上，以乙酸乙酯-甲醇-水-氨水(10∶1∶0.05∶0.5)作為展開劑，飽和20 min，上行展開1～2 cm后，晾干，再用石油醚(60～90℃)-氯仿-丙酮-甲醇-二乙胺(5.5∶4∶1.4∶0.2∶0.2)二次展開至約7.5 cm，取出，晾干，先后噴以稀碘化鉍鉀溶液和亞硝酸鈉乙醇溶液，揮干薄層板上的殘留溶劑后，置日光燈下檢視。

1.4.2 高效液相色譜 取小葉黃楊粗粉(細枝)約2.0 g，精密稱定，置150 mL錐形瓶中，加氨水5 mL，搖勻，浸潤30 min。加入氯仿40 mL，水浴回流3 h，放冷，過濾，用5 mL三氯甲烷將錐形瓶和濾紙上的殘渣少量多次一并洗入濾紙內(nèi)過濾，濾液水浴蒸干。殘渣用10 mL 0.5%醋酸超聲使其溶解，稀氨水調(diào)節(jié)pH至7.0，分別用氯仿10 mL、醋酸乙酯10 mL萃取，分離并收集水相，水浴蒸干[16]，殘渣用0.05%TFA 溶液溶解后轉(zhuǎn)移至10 mL量瓶中，并稀釋至刻度，搖勻，0.45 μm微孔濾膜濾過。

精密稱取環(huán)維黃楊星D對照品0.012 74 g，置50 mL量瓶中，加適量甲醇溶解后，用0.05% TFA 稀釋至刻度，搖勻，即得對照品儲備溶液(0.254 6 mg/mL)。分別精密量取對照品儲備溶液0.1 mL、1.0 mL、2.0 mL、3.0 mL、4.0 mL置5 mL量瓶中，用0.05% TFA稀釋至刻度，搖勻，作為線性對照品溶液。再取對照品儲備溶液適量，加0.05%三氟乙酸(0.05% TFA) 溶液制成0.020 mg/mL的對照品溶液，按以下條件測定。

測定條件：色譜柱為 Waters Xbridge? C18色譜柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)；流動相為乙腈(A)和0.05%TFA(B)；梯度洗脫，0～3 min，12% ～15% A；3～8 min，15%～19% A；8～12 min，19%～24% A；15～18 min，12% A；電噴霧霧化溫度30℃，氣壓35.0 psi；流速1.0 mL/min；進樣量20 μL；柱溫35℃。

2 結(jié)果與分析

2.1 薄層色譜鑒別

薄層色譜結(jié)果見圖1(彩圖見封三圖版)，供試品色譜圖中，在與對照品色譜(條帶3)相應(yīng)的位置上，顯現(xiàn)相同顏色的橘黃色斑點，分離度良好且斑點清晰，說明薄層色譜適于鑒別環(huán)維黃楊星D。

圖1 小葉黃楊薄層色譜圖Fig.1 The TLC results of Buxus sinica.注：1，2，4，5為小葉黃楊供試品；3為環(huán)維黃楊星D對照品。 (彩圖見封三圖版)

2.2 不同部位含量測定

2.2.1 高效液相色譜測定不同部位的環(huán)維黃楊星D含量 用高效液相色譜法測定小葉黃楊不同部位的環(huán)維黃楊星D含量結(jié)果見圖2，環(huán)維黃楊星D峰形對稱，與相鄰的色譜峰分離度良好。

2.2.2 線性關(guān)系考察 按照1.5.2的方法記錄色譜圖，以峰面積為縱坐標(biāo)(Y)，對照品濃度為橫坐標(biāo)(X)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(圖3)，得環(huán)維黃楊星D的回歸方程和相關(guān)系數(shù)為：Y=44.39X+0.1009，r=0.999 5，結(jié)果表明，環(huán)維黃楊星D在0.005 092～0.203 7 mg/mL范圍內(nèi)與峰面積呈良好的線性關(guān)系。

2.2.3 精密度試驗 精密量取環(huán)維黃楊星D對照品溶液(0.020 mg/mL)適量，按1.5.2的條件連續(xù)進樣6次，計算環(huán)維黃楊星D峰面積的RSD為0.87%，結(jié)果表明，儀器精密度良好。

2.2.4 穩(wěn)定性試驗 分別于供試品溶液制備后0 h、2 h、4 h、8 h、12 h、24 h按1.5.2的條件測定，計算環(huán)維黃楊星D平均含量為0.078 mg/g，RSD為1.40%，結(jié)果說明，供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

圖2 環(huán)維黃楊星D對照及小葉黃楊各部位供試品的HPLC圖譜Fig.2 HPLC chromatograms of cyclovirobuxine D in different parts of Buxus sinica. A.對照品；B.小葉黃楊葉；C.小葉黃楊細枝；D.小葉黃楊粗莖

圖3 環(huán)維黃楊星D標(biāo)準(zhǔn)曲線圖Fig.3 The standard curve of cyclovirobuxine D.

2.2.5 重復(fù)性試驗 精密稱取同一樣品6份，按1.4.2項下的方法制備成供試品溶液并測定，計算環(huán)維黃楊星D平均含量為0.070 mg/g，RSD為0.99%，結(jié)果表明該方法重復(fù)性良好。

2.2.6 加樣回收率試驗 精密稱取已知含量的小葉黃楊粗粉共6份，每份1.0 g，分別加入環(huán)維黃楊星D對照品溶液(精密吸取對照品儲備液3.0 mL置于25 mL量瓶中，用0.05% TFA稀釋至刻度)2.3 mL，混勻，按1.4.2項下的方法制備成供試品溶液并測定，計算環(huán)維黃楊星D平均回收率為102.9%，RSD 為3.6%，結(jié)果表明，該方法準(zhǔn)確性良好(表1)。

2.2.7 樣品含量測定 將采集到的11批小葉黃楊藥材分為粗莖、細枝和葉3個部位，按1.4.2項下的方法分別制備供試品溶液，每份平行3次，精密吸取對照品溶液和供試品溶液各20 μL，注入高效液相色譜儀，測定結(jié)果見表2。由表2中數(shù)據(jù)可知，粗莖中環(huán)維黃楊星D含量明顯高于細枝和葉，因此，環(huán)維黃楊星D的提取以粗莖為最好。

表1 小葉黃楊中環(huán)維黃楊星D的加樣回收率試驗 (n=6)

Table 1 Result of sample recovery rate of cyclovirobuxine D inBuxussinica(n=6).

編號稱樣量(g)原含量(mg)加入量(mg)測得量(mg)回收率(%)平均回收率(%)RSD(%)11.00370.07020.07030.1448106.121.00280.07020.07030.1442105.331.00590.07040.07030.1458107.341.00430.07030.07030.140099.151.00560.07040.07030.140399.461.00120.07010.07030.1405100.1102.93.6

表2 小葉黃楊不同部位環(huán)維黃楊星D含量測定結(jié)果 (n=3)

Table 2 The cyclovirobuxine D content in different parts ofBuxussinica(n=3).

編號產(chǎn)地及生長年限采集時間粗莖含量(mg/g)RSD(%)細枝含量(mg/g)RSD(%)葉含量(mg/g)RSD(%)1云南大理2012年4月0.1010.610.0631.20.0471.72貴州六屯2014年10月0.1300.260.0860.890.0381.73貴州扎佐2014年12月0.1411.90.0590.230.0231.14貴州六屯2015年8月0.1000.510.0641.10.0382.15云南2015年8月0.3100.890.1341.80.0700.496貴州六屯1年生2015年9月0.2390.500.0721.20.0063.57貴州六屯3年生2015年9月0.1920.830.0541.10.0211.38貴州六屯5年生2015年9月0.4291.50.1291.30.0450.439貴州貴定種植2015年12月0.1610.400.0701.10.0121.110貴州貴定野生2015年12月0.0780.440.0121.50.0143.111貴州六屯2015年12月0.0940.470.0881.30.0520.50

3 討論

薄層色譜條件中，曾采用藥典中環(huán)維黃楊星D檢查項下的展開劑[三氯甲烷-丙酮-二乙胺(5∶4∶0.4)]以及相關(guān)文獻[17]的方法進行研究，色譜效果都不理想，當(dāng)用極性較大的展開劑[乙酸乙酯-甲醇-氨水-水(10∶1∶0.5∶0.05)]進行一次展開后，再用極性較小的展開劑[石油醚(60～90℃)-氯仿-丙酮-甲醇-二乙胺(5.5∶4∶1.4∶0.2∶0.2)]進行二次展開時，樣品中環(huán)維黃楊星D與鄰近的斑點能較好的分離，且 Rf 值適宜。

本試驗對黔產(chǎn)小葉黃楊粗莖、細枝和葉中環(huán)維黃楊星D含量進行測定，不同部位含量差異較大：粗莖>細枝>葉。小葉黃楊中環(huán)維黃楊星D含量最高的是粗莖，且粗莖比細枝中環(huán)維黃楊星D的含量高1～6倍左右，葉的含量最低。本研究得出的結(jié)論與報道的一致[18]，而《貴州省中藥材、民族藥材質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)》(2003年版)中記載小葉黃楊藥用部位為枝葉，與本文結(jié)果有偏差。在試驗過程中，采集了云南的2批藥材與貴州產(chǎn)小葉黃楊作了對比，結(jié)果表明，黔產(chǎn)小葉黃楊與云南產(chǎn)小葉黃楊中環(huán)維黃楊星D的含量無太大差異。

由表2可知，不同生長年限(1年生、3年生和5年生)的小葉黃楊中環(huán)維黃楊星D的含量有差異，生長年限越長，環(huán)維黃楊星D的含量越高，但1年生和3年生含量差異較小，可能是生長年限在較小的范圍內(nèi)，小葉黃楊中環(huán)維黃楊星D的含量變化不大。

由于環(huán)維黃楊星D在200 nm處有最大吸收，謝昀等[16]采用反相離子對色譜法測定了黃楊木中環(huán)維黃楊星D的含量，本文在試驗過程中也采用紫外檢測器進行測定，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，用紫外檢測器測定、響應(yīng)小、基線漂移，在測定葉的含量時，由于含量較低，無法準(zhǔn)確測定，而用高效液相色譜電噴霧檢測器測定時，響應(yīng)大、基線平穩(wěn)、定量準(zhǔn)確。所以本實驗最終采用HPLC-CAD法測定小葉黃楊中環(huán)維黃楊星D的含量。

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The TLC Identification and the Cyclovirobuxine D Content Determination in Different Parts ofBuxussinicafrom Guizhou

YANG Juan-yan1,2, WANG Fang3, GUO Ting4, WU Lin-lin4, HUANG Hong-mei1, XU Qian-li2, MAO Xiang-jun2*

1.GuiyangCollegeofTraditionalChineseMedicine,Guiyang550002,China;2.GuizhouProvincialofFoodandDrugInspectionInstitute,Guiyang550004,China;3.GuizhouZunyiMedicalCollege,GuiZhouZunyi563003,China;4.GuizhouMedicalUniversity,Guiyang550004,China

The paper studied the cyclovirobuxine D content of GuizhouBuxussinicawith thin-layer chromatography(TLC) profile, and compared the cyclovirobuxine D content in different parts of GuizhouBuxussinica, which was expected to provide scientific basis for the development ofBuxussinicaresources. The TLC was used to study cyclovirobuxine D profile inBuxussinica; a HPLC-CAD method was used to measure cyclovirobuxine D content in different parts ofBuxussinica. Results showed that cyclovirobuxine D spots were clear in the TLC; the main stem had the largest cyclovirobuxine D content but the lowest content in leaves. These methods could be used in thin-layer identification and content determination of theBuxussinica. In order to reasonable develop and utilize GuizhouBuxussinica, the best medicinal part is coarse stem.

Buxussinica; TLC; different parts; cyclovirobuxine D

2016-05-27; 接受日期：2016-07-06

貴州省科學(xué)技術(shù)基金(黔科合J字[2013]2032號)資助。

楊娟艷，碩士研究生，研究方向為中藥及民族藥質(zhì)量控制與新藥研究。E-mail:1274191418@qq.com。*通信作者：茅向軍，主任藥師，研究方向為藥品質(zhì)量研究。Tel:0851-86808857；E-mail:1074459931@qq.com

10.3969/j.issn.2095-2341.2016.05.06