鐵棒錘不定根誘導及培養(yǎng)的初步研究

陳紅剛，杜弢，何佳研，張鑫，楊曉霞

1.甘肅省高校中（藏）藥化學質(zhì)量研究省級重點實驗室，甘肅 蘭州 730000；2.甘肅中醫(yī)藥大學藥用植物遺傳育種研究所，甘肅 蘭州 730000

鐵棒錘不定根誘導及培養(yǎng)的初步研究

陳紅剛1，2，杜弢1，2，何佳研1，張鑫1，楊曉霞1

1.甘肅省高校中（藏）藥化學質(zhì)量研究省級重點實驗室，甘肅 蘭州 730000；2.甘肅中醫(yī)藥大學藥用植物遺傳育種研究所，甘肅 蘭州 730000

目的 建立鐵棒錘不定根的誘導及增殖培養(yǎng)體系。方法 通過組織培養(yǎng)的方法，考察外植體類型及植物生長物質(zhì)對鐵棒錘不定根的誘導及增殖情況的影響。結(jié)果 不定根誘導能力依次為根＞莖＞葉，2.5 mg/L吲哚丁酸有利于鐵棒錘不定根的誘導及增殖。結(jié)論 本研究初步建立了鐵棒錘不定根的誘導及增殖培養(yǎng)體系，為鐵棒錘深層次的資源開發(fā)及利用提供了一種新途徑。

鐵棒錘；不定根；誘導；增殖

鐵棒錘為毛茛科植物鐵棒錘Aconitum pendulum Busch的干燥根，別名鐵牛七（陜西）、斷腸草、兩頭尖、磨三轉(zhuǎn)（甘肅）、烏藥（青海）、一枝箭、三轉(zhuǎn)半（四川）、一枝蒿（寧夏）等，其性熱，味辛、苦，有大毒，歸心、腎、脾經(jīng)，具有活血祛瘀、祛風除濕、止痛消腫的功效[1]，為陜、甘、寧、青等地應用較廣的一種民間草藥[2]。隨著鐵棒錘藥用價值的挖掘及藥理學研究的深入，其用途愈顯廣泛，鐵棒錘不僅可以作為鎮(zhèn)痛劑，還具有作為植物殺蟲劑和殺鼠劑等多種用途[3]，市場需求量日益增大，而無節(jié)制的采挖對鐵棒錘野生資源破壞非常嚴重，一些地區(qū)野生資源已瀕臨枯竭。為了保護鐵棒錘野生資源，滿足社會用藥需求，尋找新的藥材來源已經(jīng)迫在眉睫。

利用不定根培養(yǎng)生產(chǎn)次生產(chǎn)物具有生長周期短、條件可控、來源單一、遺傳背景一致、經(jīng)濟方便、重復性強、效率高和可周年試驗或生長等優(yōu)點[4]，并已在人參[5]、丹參[6]、三七[7]、蒼術(shù)[8]、太子參[9]等多種藥材中得以實現(xiàn)。本試驗旨在通過建立鐵棒錘不定根培養(yǎng)體系，為進一步大規(guī)模生產(chǎn)鐵棒錘次生代謝產(chǎn)物的研究提供技術(shù)參考，同時也為鐵棒錘深層次的資源開發(fā)及利用提供一種新途徑。

1 儀器與試藥

GTOP-500Y型智能光照培養(yǎng)箱，浙江托普儀器有限公司；I Ka Ks4000i型恒溫搖床，德國IKA公司；XB224型分析天平，上海精科天美科學儀器有限公司。

赤霉素、MS培養(yǎng)基各組分、聚乙烯吡咯烷酮（PVP）、吲哚丁酸（IBA）、6-芐基腺嘌呤（6-BA）等均為分析純。鐵棒錘種子采自甘肅省臨夏州積石山縣黃草坪，經(jīng)甘肅中醫(yī)藥大學杜弢教授鑒定為毛茛科植物鐵棒錘Aconitum pendulum Busch。

2 方法

2.1 鐵棒錘無菌苗的獲得

取鐵棒錘種子搓去種皮，用400 mg/L赤霉素浸泡12 h，然后用0.1%升汞（HgCl2）浸泡10 min滅菌，再用無菌水沖洗4 次，最后用75%酒精滅菌5 s，無菌水沖洗4次，吸干材料表面水分后，將種子（切去部分胚乳）接種在MS固體培養(yǎng)基上[10]，共處理20瓶，每瓶10粒種子。培養(yǎng)基均添加蔗糖30 g/L、PVP 1.0 g/L＋活性炭1.2 g/L、瓊脂7.0 g/L，pH＝5.8，培養(yǎng)溫度（20±1）℃，光照12 h/d、強度2 500～3 000 lx。

2.2 鐵棒錘不定根的誘導

切取“2.1”項下培養(yǎng)的鐵棒錘無菌苗的根、莖段（1 cm左右）和真葉（0.25 cm2左右，橫向切去尖端部分背緊貼培養(yǎng)基中）為外植體，分別平放到含有不同濃度IBA（0、0.5、1、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5 mg/L）的MS固體培養(yǎng)基上，每個處理6個外植體（2根段、2莖段、2葉片），5次重復。培養(yǎng)基均添加蔗糖30 g/L、瓊脂7.0 g/L、PVP 1.0 g/L＋活性炭1.2 g/L，pH＝5.8，培養(yǎng)溫度（20±1）℃，暗培養(yǎng)。

2.3 鐵棒錘不定根的增殖培養(yǎng)

將“2.2”誘導出的不定根切割成1 cm左右的段，接種在含有不同濃度IBA（1.5、2.5 mg/L）及6-BA（0、0.1、0.5 mg/L）的MS培養(yǎng)基中，培養(yǎng)基設(shè)固體、液體2個處理，每個處理設(shè)5個重復。固體培養(yǎng)基添加蔗糖30 g/L、瓊脂7.0 g/L、PVP 1.0 g/L，pH＝5.8，培養(yǎng)溫度（20±1）℃，暗培養(yǎng)。液體培養(yǎng)基添加蔗糖30 g/L、PVP 1.0 g/L，pH＝5.8，轉(zhuǎn)速100 r/min，培養(yǎng)溫度（20±1）℃，暗培養(yǎng)。

2.4 數(shù)據(jù)計算及分析

接種量（g）＝接種后培養(yǎng)基總質(zhì)量（g）－接種前培養(yǎng)基總質(zhì)量（g）。收獲量（g）：將培養(yǎng)得到的不定根取出，洗去表面的培養(yǎng)基并用濾紙吸干水分，置于天平進行稱量。增殖倍數(shù)＝（收獲量－接種量）÷接種量。采用SPSS17.0統(tǒng)計軟件對數(shù)據(jù)進行分析。

3 結(jié)果

3.1 鐵棒錘無菌苗生長情況

培養(yǎng)3～5 d鐵棒錘種胚開始萌動，第6日開始發(fā)芽，第32日發(fā)芽率達到最高，平均株高6～8 cm，根長1～3 cm，每株含2～3片真葉，見圖1。

3.2 外植體與外源性激素對鐵棒錘不定根誘導的影響

根段培養(yǎng)至第6日表面開始出現(xiàn)少量愈傷化，第8日開始出現(xiàn)不定根（帶有大量淡黃色及白色根毛），以后愈傷組織量逐漸增多，第15日達到最大，不定根數(shù)目也逐漸增多，在第17－21日達到最大，隨后增長緩慢，在第27日不定根數(shù)目停止增長。莖段培養(yǎng)至第9日表面開始愈傷化，以后則少量愈傷化而直接產(chǎn)生不定根，在第17－26日大量增長，第27日不定根數(shù)目停止增長。葉片始終沒有誘導產(chǎn)生愈傷組織及不定根，葉片顏色由深綠變?yōu)榘稻G最后變?yōu)楹谏劳?。根段、莖段、葉片誘導不定根情況見圖2。

圖1 鐵棒錘無菌苗

圖2 鐵棒錘誘導不定根

第30日統(tǒng)計不同類型外植體在不同濃度外源性激素條件下的不定根誘導情況，結(jié)果見表1。可以看出，3種外植體在不同IBA濃度下不定根誘導能力明顯不同，根段在所有IBA濃度下均可誘導產(chǎn)生不定根且誘導率較高，莖段在大多數(shù)IBA濃度下可誘導產(chǎn)生不定根但誘導率偏低，葉片則無論在何種IBA濃度下均不能誘導產(chǎn)生不定根，說明根段是鐵棒錘不定根誘導的最好材料，莖次之，葉片最差，表現(xiàn)出明顯的異質(zhì)性。

隨著IBA濃度的增加，外植體不定根誘導能力明顯提高。其中根段在IBA濃度1.5 mg/L時誘導效果最好，達到100%，但在IBA濃度為2.5 mg/L時生根條數(shù)最多。莖段在IBA濃度為2.5 mg/L時誘導效果最好，達到60%，生根條數(shù)也最多。而隨著IBA濃度的進一步增加，不論是根段還是莖段其不定根誘導能力及生根條數(shù)均有所下降。綜合考慮，2.5 mg/L的IBA更有利于鐵棒錘不定根的誘導。

表1 不同IBA濃度與外植體對鐵棒錘不定根誘導的影響

3.3 培養(yǎng)基類型與外源性激素對不定根增殖的影響

暗培養(yǎng)至第8日，根段表面開始出現(xiàn)白色突起，以后根段逐漸膨大，但生長緩慢，在第27日開始長出新不定根（帶有大量淡黃色及白色根毛），見圖3。

第40日統(tǒng)計不定根增殖情況，結(jié)果見表2。可以看出，各處理間不定根的增殖倍數(shù)差異較大。從培養(yǎng)基類型分析，固體培養(yǎng)基的平均增殖倍數(shù)高于液體培養(yǎng)基；從激素濃度來看，較高濃度的IBA更有利于不定根的增殖，不論是固體培養(yǎng)基還是液體培養(yǎng)基，均在IBA濃度為2.5 mg/L時增殖倍數(shù)達到最大，其中固體培養(yǎng)基最大增殖倍數(shù)達到5.97倍，而液體培養(yǎng)基最大增殖倍數(shù)達到3.93倍。

圖3 增殖培養(yǎng)的鐵棒錘不定根

表2 培養(yǎng)基類型與外源性激素對鐵棒錘不定根增殖的影響

4 討論

鐵棒錘無菌苗不定根誘導能力為根＞莖＞葉。在IBA濃度較低時，根段、莖段均可直接誘導產(chǎn)生不定根，但不定根的誘導率偏低且平均根條數(shù)較少。隨著IBA濃度的升高，根段愈傷化程度逐漸增強，產(chǎn)生大量愈傷組織，再通過愈傷組織的分化間接誘導產(chǎn)生不定根，而莖段則基本不發(fā)生愈傷化，而是直接誘導產(chǎn)生不定根，推測不同類型的外植體誘導生根的機制可能存在差異。

本研究初步建立了鐵棒錘不定根誘導及增殖培養(yǎng)體系，即以根段為誘導材料，MS＋IBA 2.5 mg/L＋PVP 1.0 g/L＋活性炭1.2 g/L＋蔗糖30 g/L＋瓊脂7.0 g/L為誘導培養(yǎng)基，MS＋IBA 2.5 mg/L＋6-BA 0.5 mg/L＋PVP 1.0 g/L＋蔗糖30 g/L＋瓊脂7.0 g/L為增殖培養(yǎng)基，pH＝5.8，培養(yǎng)溫度（20±1）℃，暗培養(yǎng)。但培養(yǎng)體系中不定根增殖倍數(shù)相對偏低，還需進一步優(yōu)化試驗方案，擴大增殖倍數(shù)，提高不定根產(chǎn)量。

與傳統(tǒng)的大田栽培植物相比，利用組織培養(yǎng)方法獲得有用的次生代謝產(chǎn)物具有不受時間、地點限制，可以提供均一產(chǎn)物等優(yōu)點。而不定根由于沒有外源基因，在藥品的開發(fā)方面更具有優(yōu)勢，將不定根培養(yǎng)技術(shù)應用于鐵棒錘有效成分生產(chǎn)，快速大量地獲得鐵棒錘不定根及次生代謝產(chǎn)物，可以有效解決鐵棒錘野生資源不足及大田生產(chǎn)周期長、有效成分不穩(wěn)定的問題，為進一步大規(guī)模生產(chǎn)其有效成分和研究鐵棒錘有效成分的代謝途徑提供物質(zhì)材料，從而為保護鐵棒錘野生資源及現(xiàn)有資源的開發(fā)利用提供一條可行的新途徑。

[1] 楊智鋒,劉建峰,張紅,等.鐵棒錘藥材質(zhì)量標準研究[J].中國中藥雜志,2005,30(22)：1771-1773.

[2] 陜西省革命委員會衛(wèi)生局商業(yè)局.陜西中草藥[M].北京：科學出版社, 1971：505.

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[4] 尹雙雙,高文遠,王娟,等.藥用植物不定根培養(yǎng)的影響因素[J].中國中藥雜志,2012,37(24)：3691-3694.

[5] 黃滔,高文遠,王娟,等.離體培養(yǎng)條件對人參不定根生長及其活性成分合成的影響[J].中國中藥雜志,2010,35(1)：13-17.

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Preliminary Study on Adventitious Root Induction and Culturing of Aconitum Pendulum

Busch

CHEN Hong-gang1,2, DU Tao1,2, HE Jia-yan1, ZHANG Xin1, YANG Xiao-xia1(1. Key Laboratory of

Chemistry and Quality for TCM and Tibetan Medicine in Universities of Gansu Province, Lanzhou 730000, China; 2. Institute of Medicinal Plant Genetics and Breeding of Gansu University of Chinese Medicine, Lanzhou 730000, China)

Objective To establish the adventitious root induction and culture system of Aconitum pendulum Busch. Methods The influence of different explants and plant growth substances on adventitious induction proliferation of Aconitum pendulum Busch were investigated through tissue culturing. Results Explants induction ability was: root>stem>leaf. 2.5 mg/L IBA was in favor of induction and multiplication adventitious root of Aconitum pendulum Busch. Conclusion The culture system of induction and proliferation adventitious roots of Aconitum pendulum Busch was preliminary established, which provides a new way for resource exploitation and utilization of Aconitum pendulum Busch.

Aconitum pendulum Busch; adventitious root; induction; proliferation

10.3969/j.issn.1005-5304.2016.04.021

R282.2

A

1005-5304(2016)04-0080-04

2015-05-25）

（

2015-06-09；編輯：陳靜）

甘肅省青年科技基金計劃（1308RJYA026）；甘肅省高校中（藏）藥化學與質(zhì)量研究省級重點實驗室開放基金項目（zzy-2012-03）；蘭州市科技計劃項目（2013-3-115）

杜弢，E-mail：gslzdt@163.com